汪 慧，顧亞琴，舒 燕，錢巧珍，王 靜，酈紅巖

HPLC測(cè)定山楂葉提取物中槲皮素在大鼠體內(nèi)的血藥濃度及藥動(dòng)學(xué)研究

汪 慧，顧亞琴，舒 燕，錢巧珍，王 靜，酈紅巖

目的 建立高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定山楂葉提取物中槲皮素在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，并探討其在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)(以下簡(jiǎn)稱藥動(dòng)學(xué))特征。方法 SD大鼠灌胃給予山楂葉提取物，在不同的時(shí)間點(diǎn)眼后靜脈叢取血，預(yù)處理后測(cè)定血漿中的槲皮素的濃度，經(jīng)3P97軟件處理數(shù)據(jù)。結(jié)果 山楂葉提取物中槲皮素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)符合二房室模型，槲皮素能在體內(nèi)較快地被吸收，且有雙峰現(xiàn)象的出現(xiàn)，給藥后0.25 h即達(dá)到峰濃度，峰濃度(Cmax)為(1.209±0.298) mg/L，且在3 h時(shí)出現(xiàn)二次吸收，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)消除半衰期(T1/2β)=(35.461±13.75) h、周邊室到中央室速率常數(shù)(K21)=(1.135±0.462)/h、中央室消除速率常數(shù)(K10)=(0.193±0.252)/h、中央室到周邊室速率常數(shù)(K12)=(8.067±4.658)/h、藥-時(shí)曲線下面積(AUC0-t)=(1.209±0.298) mg·h/L。結(jié)論 高效液相色譜法測(cè)定血漿中槲皮素濃度準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，適用于山楂葉提取物中槲皮素的藥動(dòng)學(xué)研究。槲皮素雙峰現(xiàn)象的出現(xiàn)，表明槲皮素在腸道中存在重吸收。

槲皮素；山楂葉提取物；藥動(dòng)學(xué)；高效液相色譜法

山楂葉為薔薇科植物山里紅(CrataegusPinnatifidaBge.Var.MajorN.E. Br.)或山楂(CrataegusPinnatifidaBge.)的干燥葉[1]。近年來，隨著中藥材資源的不斷開發(fā)，采用山楂葉治療心血管方面疾病的研究較多[2，3]。黃酮類化合物是山楂葉中的主要的化學(xué)成分，可廣泛用于心血管疾病的治療[4]。槲皮素是其中的主要黃酮成分之一[5]，研究報(bào)道槲皮素具有抗氧化、降血壓、擴(kuò)張血管以及保護(hù)受損心肌[6]的功效。有關(guān)槲皮素單體化合物的藥動(dòng)學(xué)已有相關(guān)報(bào)道[7,8]，但尚未有對(duì)山楂葉提取物中槲皮素藥動(dòng)學(xué)特征的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究大鼠灌胃山楂葉提取物后槲皮素的藥動(dòng)學(xué)，旨在揭示其在動(dòng)物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化特征，為開發(fā)心血管類藥品及保健食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 日本島津LC-20AT高效液相色譜儀(包括SPD-20A紫外檢測(cè)器，N2000色譜工作站)；Sigma高速離心機(jī)(Sigma公司)；SK-1快速混勻器(江蘇中大儀器廠)；METTLER AE240分析天平(梅特勒儀器有限公司)；微量移液器(Thermo Electron公司)。

槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100081-200406)；山楂葉購(gòu)自鎮(zhèn)江存仁堂醫(yī)藥有限公司，經(jīng)江蘇大學(xué)歐陽臻教授鑒定為薔薇科植物山楂的干燥葉；山楂葉提取物(自制，HPLC法測(cè)得槲皮素含量為5.157 mg/g)；甲醇、乙腈(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)；娃哈哈純凈水(娃哈哈集團(tuán))，其余試劑均為分析純。

雄性SD大鼠(江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2009-0002)5只，體重在(250±20)g之間。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil-5C18(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.25%醋酸溶液(B)，按如下梯度洗脫：0～20 min，25%～45% A；20～25 min，45%～50% A；25～35 min，50%～80% A；流速：1 ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣20 μl。

1.2.2 山楂葉提取物的制備 稱取干燥的山楂葉粉末60 g，置1000 ml燒瓶中，分別加入10、8倍量60%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，濾渣用60%乙醇潤(rùn)洗，合并濾液，濃縮并干燥即得，經(jīng)HPLC測(cè)得提取物中槲皮素含量為5.157 mg/g。

1.2.3 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取槲皮素對(duì)照品適量置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得含槲皮素66.8 mg/L的對(duì)照品溶液。

1.2.4 血漿樣品預(yù)處理 精密吸取血漿0.1 ml，加0.2 ml乙腈沉淀蛋白，渦流振蕩1 min，高速離心(13 000 r/min)10 min，取上清0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣20 μl。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 方法的專屬性 將空白血漿、空白血漿中加入槲皮素對(duì)照品、灌胃山楂葉提取物血漿樣品按1.2.1色譜條件下進(jìn)樣，考察槲皮素主峰的特異性，是否與其他峰分離度良好。

1.2.5.2 線性范圍及檢測(cè)限 精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液適量，置于1 ml離心管中，加入大鼠空白血漿100 μl，配制成槲皮素濃度為0.167、0.334、0.668、1.670、3.340、6.680 mg/L的血漿樣本，并進(jìn)行色譜分析，以峰面積Y對(duì)血藥濃度X進(jìn)行線性回歸，線性方程為Y=7136.5X+139.42(R2=0.9998)。

1.2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度 配制含槲皮素0.223、0.835、3.340 mg/L的低、中、高濃度的血漿樣品，各濃度測(cè)5次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算槲皮素的含量，計(jì)算方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.2.5.4 提取回收率 配制含槲皮素0.223、0.835、3.340 mg/L的低、中、高濃度的血漿樣品各5份，進(jìn)樣20 μl，測(cè)定得到峰面積(5次測(cè)定的平均值)A1；以同時(shí)配制等濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)樣得到的峰面積(5次測(cè)定的平均值)A2作為對(duì)照，計(jì)算得低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品中槲皮素的提取回收率(R=A1/A2×100%)。

1.2.5.5 穩(wěn)定性考察 配制含槲皮素的低、中、高3個(gè)濃度0.223、0.835、3.340 mg/L的血漿樣品，考察室溫放置穩(wěn)定性、臨時(shí)儲(chǔ)存穩(wěn)定性及長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

1.2.6 藥動(dòng)學(xué)研究 大鼠給藥前禁食不禁水，灌胃給藥山楂葉提取物2.4 g/kg(給藥劑量按槲皮素算為12.38 mg/kg)，并于給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h眼眶后靜脈叢取血，置于肝素化離心管中，分離血漿，-20 ℃保存。再按“1.2.4血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)步驟操作。

2 結(jié) 果

2.1 方法的專屬性 空白血漿、空白血漿中加入槲皮素對(duì)照品、灌胃山楂葉提取物血漿樣品色譜圖見圖1，槲皮素與其他干擾組分分離效果良好，無雜質(zhì)峰干擾。

2.2 線性范圍及檢測(cè)限 血漿中槲皮素在0.167～6.68 mg/L之間線性關(guān)系良好，血漿中檢測(cè)限為0.0468 mg/L。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度及精密度結(jié)果見表1。

2.4 提取回收率 低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品中槲皮素的提取回收率分別為81.4%，85.2%，83.7%，平均提取回收率為83.4%，符合藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 穩(wěn)定性考察 血漿樣品預(yù)處理后室溫下放置36 h穩(wěn)定；樣品經(jīng)4 ℃冰箱儲(chǔ)存5 d保持穩(wěn)定；樣品在-20 ℃凍存2周穩(wěn)定。

2.6 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 血藥濃度數(shù)據(jù)見表2，用3P97藥動(dòng)學(xué)程序?qū)ρ帩舛葦?shù)據(jù)擬合計(jì)算，結(jié)果表明山楂葉提取物中的槲皮素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)符合二房室模型，主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3，其平均藥-時(shí)曲線見圖2。

表1 血漿樣品中槲皮素的準(zhǔn)確度和精密度 ±s)

表2 5只雄性SD大鼠不同時(shí)間血藥濃度數(shù)據(jù)

注：NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5為大鼠編號(hào)

圖1 大鼠血漿樣品中槲皮素的HPLC色譜圖

圖2 山楂葉提取物中槲皮素在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線

主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)槲皮素Ka(/h)10.173±6.281Α(/h)5.174±1.672T1/2β(h)35.461±13.75K21(/h)1.135±0.462K10(/h)0.193±0.252K12(/h)8.067±4.658AUC0-t(mg·h/L)6.108±3.217Tmax(h)0.25;3Cmax(mg/L)1.209±0.298

3 討 論

血漿樣品處理方法比較了甲醇、乙腈、6%高氯酸等溶劑，通過綜合比較雜質(zhì)干擾及提取回收率因素，發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀蛋白效果不如乙腈，6%高氯酸沉淀蛋白效果較好，但會(huì)對(duì)色譜柱造成一些損害，故采用乙腈沉淀蛋白法。同時(shí)考察了不同體積比的血漿-乙腈(1∶2，1∶3，1∶4)對(duì)槲皮素測(cè)定的影響，結(jié)果隨著乙腈體積比的加大，血漿雜質(zhì)峰并沒有明顯減少(與血漿-乙腈體積比1∶2相比)，故選定以血漿-乙腈(1∶2)作為沉淀蛋白條件。本研究中，大鼠灌胃山楂葉提取物后槲皮素在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程符合二室模型。槲皮素在胃腸道能迅速被吸收吸收速率常數(shù)(Ka)=(10.214±5.911)/h，且灌胃后血漿中的槲皮素在0.25 h達(dá)峰值(1.209±0.298)mg/L，說明槲皮素進(jìn)入大鼠體循環(huán)后能迅速地分布分布速率常數(shù)α=(5.124±1.588)/h，從而發(fā)揮藥效迅速。同時(shí)在研究中還發(fā)現(xiàn)槲皮素在體內(nèi)的過程出現(xiàn)主峰與次峰，即雙峰現(xiàn)象，表明槲皮素在腸道中存在二次吸收。文獻(xiàn)[9]報(bào)道，某些藥物因肝腸循環(huán)在體內(nèi)可出現(xiàn)二次吸收峰(雙峰現(xiàn)象)，而此重吸收過程有可能是導(dǎo)致槲皮素在體內(nèi)T1/2β長(zhǎng)的原因。另一方面，槲皮素的代謝存在腸腸循環(huán)，Crespy等[10]利用大鼠空腸和回腸進(jìn)行槲皮素和蘆丁原位灌流實(shí)驗(yàn)，表明其有效吸收部位可能在腸道上段，并發(fā)現(xiàn)2/3的槲皮素在灌流過程中吸收進(jìn)入腸壁，但同時(shí)又有52%的槲皮素以結(jié)合物的形式(葡萄糖醛酸甙或硫酸甙)重新分泌入腸腔。由于本研究對(duì)象為山楂葉的提取物，為山楂葉中某一系列化合物的混合物，所以不能排除同類的黃酮化合物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為槲皮素被吸收進(jìn)入體循環(huán)，而且各個(gè)化學(xué)成分之間的相互作用都有可能導(dǎo)致槲皮素的吸收、分布及代謝等發(fā)生變化。本研究結(jié)果為山楂葉的新藥開發(fā)及后續(xù)臨床給藥方案研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2015-01-27收稿 2015-03-02修回)

(責(zé)任編輯 張亞麗)

Study on pharmic concentration and its pharmacokinetics of quercetin in extract of hawthorn leaves in rats by HPLC

WANGHui,GUYaqin,SHUYan,QIANQiaozhen,WANGJing,andLIHongyan.

JiangsuJibrierPharmaceuticalJointStockLimitedLiabilityCompany,Zhenjiang212009,China

LIHongyan,E-mail:lhy707@126.com

Objective To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for measuring the pharmic concentration of quercetin in extract of hawthorn leaves in rats and to study its pharmacokinetics. Methods Blood sample were collected through venous plexus in rat eye at different time after oral administration of the extract of hawthorn leaves. After liquide extraction with acetonitrile, the concentration of quercetin in plasma was measured. Then pharmacokinetics parameters were calculated with 3P97 program. Results The results showed that quercetin plasma concentration-time curves in rats coincided with two-compartment model, quercetin was absorbed fast in rats, and it has twin peaks. peak concentration(Cmax) of quercetin in rat plasma was (1.209±0.298) mg/L. It has a secondary absorption peak at 3 h. The main pharmacokinetic parameters were as follows:elimination half time(T1/2β) was (35.461±13.75) h, rate constant of central chamber and peripheral chambers(K21) was (1.135±0.462)/h, elimination rate constant of central chamber(K10) was (0.193±0.252)/h, rate constant of central chamber and peripheral chambers(K12)was (8.067±4.658)/h,area under the concentration-versus-time curve(AUC0-t)was (1.209±0.298)mg·h/L. Conclusions HPLC method is accurate and sensitive. The twin peaks indicats that quercetin has a reabsorption in the intestines.

quercetin；hawthorn leaves extracts; pharmacokinetics; HPLC

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.03.008

汪 慧，本科學(xué)歷，執(zhí)業(yè)藥師，E-mail:5062342765@qq.com

212009 鎮(zhèn)江，江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司

酈紅巖，E-mail: lhy707@126.com

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