周麗明,張 勇

(上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江西上饒 334001)

周麗明,張 勇

(上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江西上饒 334001)

為了測(cè)定堿不溶性酵母胞壁多糖含量,采用硫酸溶液水解堿不溶性酵母胞壁多糖,苯酚-硫酸法測(cè)定水解液的糖含量。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)硫酸溶液水解堿不溶性酵母胞壁多糖的條件進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的水解條件為:稱取堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入3mol/L H2SO4溶液20mL置于100℃水浴中水解90min。水解液定容至250mL,測(cè)定其糖含量。該方法的精密度RSD為0.30%,穩(wěn)定性RSD為0.67%,重現(xiàn)性RSD為0.29%,樣品的平均加標(biāo)回收率為99.87%,RSD為1.16%,是測(cè)定堿不溶性酵母胞壁多糖含量的有效方法。

堿不溶性,酵母胞壁多糖,水解,苯酚-硫酸法

啤酒廢酵母是啤酒生產(chǎn)工藝過程中剩下的副產(chǎn)物,主要由大量的死細(xì)胞和弱細(xì)胞組成[1],每生產(chǎn)100t啤酒,產(chǎn)生約1.5t剩余酵母(含水75～80%)[2]。2012年我國啤酒產(chǎn)量數(shù)為4435萬t[3],可回收廢啤酒酵母60多萬噸(濕重)。目前,廢啤酒酵母的綜合利用集中在酵母細(xì)胞的氨基酸、肽、蛋白質(zhì)資源、酵母抽提物調(diào)味品、β-葡聚糖、甘露糖以及活性酶類如超氧化物歧化酶等產(chǎn)品的生產(chǎn)與研究[4]。受到多糖成為食品科學(xué)、天然藥物、生物化學(xué)與生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)[5]的影響,酵母多糖越來越受到科研工作者的重視。研究表明,酵母多糖具有增強(qiáng)免疫[6-9]、抗氧化[10]、抗誘變[11]、抗腫瘤[12]、抗輻射[13]、吸收毒素[14]、降血脂[15-16]等生物功能；在肉制品生產(chǎn)中可替代部分脂肪和淀粉[17]。

酵母細(xì)胞壁中存在堿不溶性葡聚糖、堿溶性葡聚糖、酸溶性葡聚糖、連接有蛋白質(zhì)的無定性的堿溶性甘露聚糖等多糖類物質(zhì),其中不溶性葡聚糖除因不溶使其在抗腫瘤等的臨床應(yīng)用上受到限制外,高度的粘性、持水性和熱穩(wěn)定性以及制備工藝簡(jiǎn)單等方面的優(yōu)點(diǎn),使其在食品、醫(yī)藥、化妝品、造紙和建筑材料等行業(yè)廣泛應(yīng)用[18]。堿不溶性酵母胞壁多糖的不溶解性造成了其測(cè)定的困難性。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)用硫酸溶液對(duì)其進(jìn)行水解,苯酚-硫酸法測(cè)定水解液的糖含量。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化水解條件,以期建立高效、快速、可靠、能作為酵母多糖質(zhì)量控制方法的堿不溶性酵母胞壁多糖測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

廢啤酒干酵母 湖北金龍泉啤酒有限公司提供；葡萄糖、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸、鹽酸、無水乙醇、丙酮、乙醚 分析純。

320-S型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；JJ-1型電動(dòng)攪拌器 常州國華電器有限公司；DZT-6020型真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722S型可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH·SY11-Ni2型電熱恒溫水浴鍋 北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液制備:取105℃干燥至恒重的D(+)葡萄糖,精密稱重,配成3.62mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用前用蒸餾水稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用液(0.0362mg/mL)。

80%苯酚:80g苯酚(分析純重蒸餾試劑)加20g水使之溶解,置冰箱中避光貯存。

6%苯酚:臨用前以80%苯酚配制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 堿不溶性酵母胞壁多糖制備工藝[19]稱取100g廢啤酒干酵母,按料液比1∶10g/mL加入1mol/L的NaOH溶液,100℃攪拌處理1h,冷卻后用HCl調(diào)pH4.5,充分?jǐn)嚢?3000r/min離心20min后棄上清液,沉淀即為酵母胞壁多糖粗品。將沉淀用200mL蒸餾水洗出,100℃水浴20min,3000r/min離心20min；沉淀用100mL95%乙醇洗出,用電動(dòng)攪拌器攪拌15min后3000r/min離心20min；重復(fù)一次；沉淀用100mL丙酮洗出,攪拌15min后3000r/min離心20min；重復(fù)一次；然后沉淀用100mL無水乙醚洗出,攪拌15min,3000r/min離心20min,沉淀置于沸水浴中揮發(fā)殘余無水乙醚,最后置于37℃下真空烘干,即得堿不溶性酵母胞壁多糖。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用苯酚-硫酸法[20]。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用液0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60及1.80mL于試管中,各以水補(bǔ)至2.00mL,另一試管加入2.00mL蒸餾水作為空白對(duì)照。各試管分別加入6%苯酚1.00mL,然后冷水浴中迅速加入濃硫酸5.00mL,搖勻,并于冷水浴中放置5min,再置沸水浴中加熱15min,取出冷卻至室溫后于490nm處測(cè)其吸光度,橫坐標(biāo)為葡萄糖微克數(shù),縱坐標(biāo)為吸光度值,得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 堿不溶性酵母胞壁多糖含量測(cè)定 準(zhǔn)確吸取多糖水解液1.00mL,按1.3.2操作,測(cè)其吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算水解液的糖濃度,然后按式(1)計(jì)算堿不溶性酵母胞壁多糖的含量。

多糖含量(%)=水解液的糖濃度(mg/mL)×250mL/稱取的堿不溶性酵母胞壁多糖質(zhì)量(mg)×100

(1)

1.3.4 堿不溶性酵母胞壁多糖水解條件單因素及正交實(shí)驗(yàn) 水解時(shí)間篩選:精確稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL 3mol/L H2SO4溶液后于100℃水浴中分別水解60、90、120、150、180min,5000r/min離心20min后定容至250mL,然后按1.3.3操作。以多糖含量為考察指標(biāo)研究水解時(shí)間對(duì)多糖水解程度的影響。

水解所需H2SO4溶液濃度的篩選:精確稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL濃度分別為1、2、3、4、5mol/L的H2SO4溶液后于100℃水浴中水解90min,5000r/min離心20min后定容至250mL,然后按1.3.3操作。以多糖含量為考察指標(biāo)研究H2SO4溶液濃度對(duì)多糖水解程度的影響。

水解所需H2SO4溶液體積的篩選:精確稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,分別加入10、15、20、25、30mL的3mol/L H2SO4溶液水解后于100℃水浴中水解90min,5000r/min離心20min后定容至250mL,然后按1.3.3操作。以多糖含量為考察指標(biāo)研究H2SO4溶液體積對(duì)多糖水解程度的影響。

水解溫度的篩選:精確稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL 3mol/L H2SO4溶液后分別于60、70、80、90、100℃水浴中水解90min,5000r/min離心20min后定容至250mL,然后按1.3.3操作。以多糖含量為考察指標(biāo)研究水解溫度對(duì)多糖水解程度的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定水解時(shí)間、H2SO4溶液濃度、H2SO4溶液體積、水解溫度為實(shí)驗(yàn)因素,以多糖含量為考察指標(biāo),根據(jù)正交表L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化堿不溶性酵母胞壁多糖水解條件。

1.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取多糖水解液1.00mL,按1.3.2操作,連續(xù)5次測(cè)定其吸光度。

1.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 每間隔2h準(zhǔn)確吸取同一多糖水解液1.00mL,按1.3.2操作,測(cè)其吸光度,連續(xù)實(shí)驗(yàn)12h,觀測(cè)其穩(wěn)定性。

1.3.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批堿不溶性酵母胞壁多糖樣品5份,每份10mg,各加入20mL 3mol/L H2SO4溶液后于100℃水浴中水解90min,定容至250mL。然后準(zhǔn)確吸取多糖水解液1.00mL,按1.3.3操作,測(cè)其吸光度并計(jì)算多糖含量。

1.3.8 回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批堿不溶性酵母胞壁多糖樣品6份,其中5份分別加入不同質(zhì)量的烘干后的葡萄糖,6份樣品均加入20mL 3mol/L H2SO4溶液于100℃水浴中水解90min,定容至250mL。然后準(zhǔn)確吸取多糖水解液1.00mL,按1.3.2操作,測(cè)其吸光度并根據(jù)回歸方程計(jì)算水解液中的糖量,按式(2)計(jì)算加標(biāo)回收率。

加標(biāo)回收率(%)=(加標(biāo)樣品總糖量-樣品中的糖量)/加入的葡萄糖質(zhì)量×100

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.3.2操作,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。結(jié)果表明,葡萄糖含量在0～0.06516mg范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系,在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為:y=0.0057x+0.0008,r=0.9998。

2.2 堿不溶性酵母胞壁多糖水解條件單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 堿不溶性酵母胞壁多糖水解時(shí)間的篩選 堿不溶性酵母胞壁多糖水解后的溶液狀況和多糖含量見表1。

表1 水解時(shí)間對(duì)堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響Table 1 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

表2 H2SO4溶液濃度對(duì)堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響Table 2 Effect of the content of H2SO4 solution on the hydrolysis of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

表3 H2SO4溶液體積對(duì)堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響Table 3 Effect of the volume of H2SO4 solution on the hydrolysis of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of glucose

從表1中可以看出,在90min前,隨著水解時(shí)間的延長,不溶物逐漸減少,水解程度不斷增大,在90min的時(shí)候水解程度達(dá)到最佳；90min后,硫酸可能使水解生成的糖部分碳化,致使多糖含量減少,水解3h后糖類幾乎全部碳化；也有可能是生成了腐黑物[21]。所以確定水解時(shí)間為90min。

2.2.2 堿不溶性酵母胞壁多糖水解所需H2SO4溶液濃度的篩選 堿不溶性酵母胞壁多糖水解后的溶液狀況和多糖含量見表2。從表2中可以看出,隨著硫酸溶液濃度從1mol/L增至3mol/L,堿不溶性酵母胞壁多糖水解程度增大,不溶物減少,多糖含量增加；但當(dāng)硫酸溶液濃度增至4mol/L及以上時(shí),造成糖類碳化或生成了腐黑物,多糖含量下降。所以確定水解所需硫酸溶液濃度為3mol/L。

2.2.3 堿不溶性酵母胞壁多糖水解所需H2SO4溶液體積的篩選 堿不溶性酵母胞壁多糖水解后的溶液狀況和多糖含量見表3。從表3中可以看出,隨著硫酸溶液用量從10mL增至20mL,堿不溶性酵母胞壁多糖水解程度增大,不溶物逐漸減少,多糖含量增加；但當(dāng)硫酸溶液用量超過20mL時(shí),造成糖類碳化或生成了腐黑物,多糖含量下降。所以確定水解所需硫酸溶液用量為20mL。

2.2.4 堿不溶性酵母胞壁多糖水解溫度的篩選 堿不溶性酵母胞壁多糖水解后的溶液狀況和多糖含量見表4。從表4中可以看出,隨著水解溫度的升高,堿不溶性酵母胞壁多糖水解逐漸完全,多糖含量增加,且溶液顏色呈無色,說明無碳化和腐黑物生成。所以100℃水浴條件下水解堿不溶性酵母胞壁多糖最適宜。

表4 水解溫度對(duì)堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響Table 4 Effect of hydrolysis temperature on the hydrolysis of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

2.3 堿不溶性酵母胞壁多糖水解條件正交實(shí)驗(yàn)

由表5可以看出,各因素對(duì)堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響程度依次為H2SO4溶液濃度>水解時(shí)間>H2SO4溶液體積>水解溫度。直觀分析最佳水解條件為:稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL 3mol/L H2SO4溶液于100℃水浴中水解90min。按此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得制備的堿不溶性酵母胞壁多糖含量為83.21%,高于所有正交實(shí)驗(yàn)組合。因此確定此條件為最佳水解條件。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of L9(34)orthogonal array design tests

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

連續(xù)5次測(cè)定的吸光度見表6。結(jié)果顯示,水解液經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后的吸光度平均值為0.1806,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.30%(n=5),表明精密度好。

表6 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 6 Precision of the method(n=5)

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。結(jié)果顯示,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.67%(n=7),說明水解液在12h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Stability of the method

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。結(jié)果顯示,堿不溶性酵母胞壁多糖中多糖含量的平均值為83.10%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.29%(n=5),重現(xiàn)性良好。

表8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 8 Reproducibility of the method(n=5)

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9。結(jié)果顯示,加標(biāo)回收率的平均值為99.87%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.16%(n=5),說明測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確度高。因此用本方法測(cè)定堿不溶性酵母胞壁多糖可靠。

表9 樣品測(cè)定結(jié)果和回收率(n=5)Table 9 Average spike recovery of the method(n=5)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過硫酸溶液水解堿不溶性酵母胞壁多糖,水解條件為:準(zhǔn)確稱取堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL 3mol/L H2SO4溶液后于100℃水浴中水解90min,然后定容至250mL。準(zhǔn)確吸取水解液1.0mL,按苯酚-硫酸法操作,測(cè)其吸光度,根據(jù)回歸方程和式(1)計(jì)算堿不溶性酵母胞壁多糖含量。本方法準(zhǔn)確率高,穩(wěn)定性好,重現(xiàn)性好,結(jié)果可靠,操作簡(jiǎn)便,水解時(shí)間較文獻(xiàn)[21]縮短了很多,是測(cè)定堿不溶性酵母胞壁多糖含量的有效方法。

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Study on the phenol-sulfuric acid determination methodof alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

ZHOU Li-ming,ZHANG Yong

(College of Life Science,Shangrao Normal University,Shangrao 334001,China)

To determine the concent of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides,the solution of H2SO4was used to hydrolysis the alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides,then the saccharide of the hydrolytic solution was determined by phenol-sulfuric acid method. The hydrolysis condition was optimized by single factor and orthogonal experiments. The optimized hydrolysis condition was as follows:10mg alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides were hydrolyzed for 90min at 100℃ with 20mL 3mol/L H2SO4solution. Then the solution was volumed to 250mL and the content of saccharide was determined. The RSD of precision was 0.30%. The RSD of stability was 0.67%. The RSD of reproducibility was 0.29%. The average spike recovery was 99.87%,with 1.16% RSD. The method was effective for determination of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides.

alkali-insoluble;yeast cell wall polysaccharides;hydrolysis;phenol-sulfuric acid method

2014-04-08

周麗明(1980-)，女，碩士，講師，研究方向:生物活性物質(zhì)。

TS261.9

A

1002-0306(2015)03-0311-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.057