于 珊,張鳳清,解聳林

(長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130012)

五味貞甘飲品對化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用功能學(xué)評價(jià)

于 珊,張鳳清*,解聳林

(長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130012)

探討五味貞甘飲品對化學(xué)性肝損傷的輔助保護(hù)功能。將清潔級Wistar雄性大白鼠分為5組:空白對照組、模型對照組、五味貞甘飲品低劑量組、中劑量組、高劑量組。連續(xù)灌胃大鼠30d,除對照組外以CCl4制備急性肝損傷大鼠模型,并測定ALT、AST值,取肝臟作病理切片,觀察肝臟的病理損傷情況。結(jié)果顯示:高、中劑量組的ALT、AST均低于CCl4肝損傷模型組,差異有顯著性(p<0.01),高劑量組大鼠病理總積分較CCl4肝損傷模型組輕,差異有顯著性(p<0.01)。結(jié)論:五味貞甘飲品對化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能。

五味貞甘飲品,化學(xué)性肝損傷,CCl4

五味貞甘飲品是以五味子、女貞子、甘草、葛根為主要原料,輔以對羥基苯甲酸乙酯、木糖醇制成的保健飲品。目前已通過毒理學(xué)評價(jià)證明其安全無毒,根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》,考察五味貞甘飲品對以CCl4為模型的化學(xué)性肝損傷的輔助保護(hù)作用,為保健食品功能學(xué)申報(bào)提供技術(shù)支持。配方采用中醫(yī)配伍的原則,其中五味子為君藥,葛根為臣藥,佐藥為女貞子和甘草。國內(nèi)外學(xué)者對配方中的各味藥材研究表明配方中各味藥材均對肝損傷有保護(hù)作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,五味子對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均有調(diào)節(jié)作用,同時還發(fā)現(xiàn)其在抑制腫瘤、保護(hù)肝臟、抗氧化、抗衰老等方面也有作用[1]。五味子對CCl4引起的化學(xué)性肝損傷具有一定的保護(hù)作用[2-3]。葛根保肝機(jī)制可能與葛根的保護(hù)肝細(xì)胞膜、清除自由基、抗纖維化等作用有關(guān)[4]。葛根素對肝臟有保護(hù)和修復(fù)的作用[5-6]。呂娟濤、湯浩通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,女貞子多糖能不同程度的改善肝組織病理變化[7]。陳紅艷等經(jīng)過實(shí)驗(yàn)表明甘草提取物對四氯化碳所致小鼠急性化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用[8]。化學(xué)性肝損傷由化學(xué)性肝毒性物質(zhì)所造成的肝損傷。在被調(diào)查的我國人群中,亞健康的發(fā)生率約為58.18%,其中肝臟損傷人數(shù)達(dá)1.3億人,由于肝損傷病癥導(dǎo)致死亡的人數(shù)近50萬人。所以,對化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的保健飲品的研制有很好的市場前景。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠急性CCl4肝損傷模型,通過檢測其血清中ALT、AST的含量和病理檢測來研究五味貞甘飲品對化學(xué)性肝損傷的輔助保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子,女貞子,葛根,甘草 購于同仁堂藥店；對羥基苯甲酸乙酯 天津市北辰方正試劑廠,分析純；氫氧化鈉 北京化學(xué)試劑廠,分析純；四氯化碳 北京化工廠,分析純；蒸餾水。

ALT試劑盒、AST試劑盒 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；日本東芝TBA-120FR全自動生化分析儀；D75-3型低速臺式自動平衡離心機(jī) 北京時代北利離心機(jī)有限公司；T1000型電子天平 常熟雙杰測試儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五味貞甘飲品制備 五味子、葛根、女貞子、甘草→水提→提取液→減壓濃縮→濃縮液Ⅰ→醇沉→濃縮液Ⅱ→調(diào)配→灌裝→滅菌→成品

提取:每瓶五味貞甘飲品含五味子2g,葛根4g,女貞子3g,甘草2g,加入10倍量水(mL/g),煎煮3次,每次2h,煎液濾過,合并濾液,濾液減壓濃縮(60℃,-0.08MPa)至相對密度為1.10～1.15(60℃),得到濃縮液Ⅰ。

醇沉:量取適量95%乙醇,攪拌加入到濃縮液Ⅰ中,使含醇量達(dá)70%,靜置24h,過濾,濾液,回收乙醇并濃縮至相對密度1.10～1.15(60℃),得到濃縮液Ⅱ。

配制:將濃縮液Ⅱ加純化水至近配方量,攪拌混合30min使均勻,冷藏(4～8℃)24h,過濾(300目),收集濾液；對羥基苯甲酸乙酯用適量乙醇溶解,溶液備用；取對羥基苯甲酸乙酯乙醇溶液、處方量木糖醇6g,加入到濾液中,用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH為6.5～7.0,加水至足量,攪拌混合30min使均勻,過濾(300目)。

灌裝:灌封,100mL/瓶。推薦成人(體重按60kg計(jì))日攝入量為每日1瓶,100mL/瓶,即100mL/60kg·BW。

滅菌:滅菌條件為115℃ 30min。

1.2.2 動物實(shí)驗(yàn)及分組 Wistar雄性大白鼠50只(“SPF級”由“吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供”),隨機(jī)分為對照組、CCl4肝損傷模型組及五味貞甘飲品高、中、低劑量組,每組雄性大鼠10只。以濃配液(1∶16)為樣品,即0.104mL/kg BW,高、中、低劑量組分別給予成人日攝入濃配液量的30倍、10倍、5倍即3.12、1.04、0.52mL/kg BW(按31.2、10.4、5.20mL分別加蒸餾水至100mL的量配藥)。各組均按1.0mL/100g BW的量灌胃。實(shí)驗(yàn)期間受試物各劑量組灌胃給予不同劑量的五味貞甘飲品,連續(xù)灌胃30d,正常對照組及CCl4肝損傷模型組灌胃給予蒸餾水。大鼠灌胃30d后,將各組動物隔夜禁食16h,模型組及各樣品組一次灌胃給予CCl4,以3.2% CCl4(用植物油稀釋)作為肝臟毒物建立急性化學(xué)性肝損傷模型,灌胃量5mL/kg BW。正常對照組給予植物油,受試組繼續(xù)給予五味貞甘飲品至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(與CCl4灌胃間隔4.5h)。給予CCl4后24h用1%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液,按5mL/kg BW腹腔注射麻醉后,下腔靜脈采血,分離血清,測定ALT、AST值,并取肝臟作病理切片,觀察肝臟的病理損傷情況。病理組織學(xué)觀察以肝細(xì)胞“氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝聚、水樣變性、細(xì)胞壞死”等作為觀察指標(biāo),并根據(jù)每種病變程度進(jìn)行量化。

1.2.3 大鼠血清中ALT、AST含量的測定 大鼠腹腔取血后,靜置,3000r/min,離心15min,用自動生化分析儀測定血清生化指標(biāo)的活性。

1.2.4 大鼠肝臟的病理分析用 10%福爾馬林固定肝臟組織塊,包埋,切片,采用HE染色方法進(jìn)行常規(guī)病理檢查,觀察肝細(xì)胞病理情況。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),p<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味貞甘飲品對大鼠體重的影響

由表1可見,經(jīng)過給予不同劑量的五味貞甘飲品30d,各劑量組、模型組與正常對照組比較,動物體重、增重差異無顯著性(p>0.05)。

表1 五味貞甘飲品對動物體重的影響Table 1 Effect of Mixed zhen gan drinks on the level of weight in rats

2.2 五味貞甘飲品對動物血清中ALT、AST的影響

由表2可見,CCl4肝損傷模型組的ALT、AST均高于正常對照組,差異有顯著性(p<0.01),說明模型成立；五味貞甘飲品高、中劑量組的ALT、AST 均低于CCl4肝損傷模型組,差異有顯著性(p<0.01),其中五味貞甘低劑量組的ALT值與CCl4肝損傷模型組無顯著性差異,但是其ALT的值低于CCl4肝損傷模型組,并且隨著五味貞甘飲品濃度的增加ALT、ALS的值變低。

2.3 五味貞甘飲品對肝臟病變的影響

由鏡檢結(jié)果可見,正常對照組的病理積分明顯低于CCl4模型組,差異性顯著(p<0.01),說明模型成立。五味貞甘飲品高劑量組的病理總積分低于CCl4模型組,差異性顯著(p<0.01),五味貞甘飲品低、中劑量組的病理總積分與CCl4模型組相比差異雖沒有顯著性,但其病理總積分

表2 五味貞甘飲品對大鼠血清ALT、AST的影響Table 2 Effect of Mixed zhen gan drinks on the level of Serum ALT and AST in rats

注:**表示 CCl4模型組比較有顯著差異(p<0.01)。

表3 病理積分Table 3 Pathologic total points

注:總分的計(jì)算方法為,將各種病理變化的得分相加。*表示與CCl4模型組比較有顯著性差異(p<0.05)；**表示與CCl4模型組比較有顯著性差異(p<0.01)。

均低于CCl4模型組,且隨著五味貞甘飲品的濃度增加其總積分的數(shù)值下降。五味貞甘高劑量組的氣球變性病理積分低于CCl4模型組,差異性顯著(p<0.05),五味貞甘高劑量組的細(xì)胞壞死病理積分低于CCl4模型組,差異具有顯著性(p<0.01),各劑量組的水樣變性、脂肪變性、胞漿凝聚與CCl4模型組雖沒有顯著降低,但隨著劑量的增加病變也相對減輕。

3 結(jié)論

四氯化碳是一種選擇性的肝毒性物質(zhì),是目前誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的常用化學(xué)毒物,可將其溶于甘油、花生油、石蠟油、棉籽油等,經(jīng)口服、腹腔注射、皮下注射等途徑制備肝損傷模型[9]。實(shí)驗(yàn)采用3.2% CCl4植物油溶液按5mL/kg BW進(jìn)行灌胃,成功地建立了肝損傷模型。

肝損傷是多因素參與的一個復(fù)雜病理過程,在其病變過程中多種酶、自由基以及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)均發(fā)生著較大的變化[10-13]。CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型是研究藥物保肝活性的常用模型。當(dāng)CCl4誘導(dǎo)的急性肝細(xì)胞損傷發(fā)生時,谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)從肝細(xì)胞內(nèi)釋放至血清中,導(dǎo)致血清中ALT 和AST 活性的升高,所以血清中ALT 和AST 是急性肝損傷的敏感指標(biāo),其升高在一定程度上說明了肝臟受損的程度[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示五味貞甘飲品的各劑量組與模型組和正常對照組比較,動物體重、增重沒有顯著差異,CCl4肝損傷模型組的ALT、AST均高于正常對照組,差異性顯著(p<0.01),病理積分明顯高于對照組,差異性顯著(p<0.01),說明模型成立。五味貞甘飲品的高、中劑量組的ALT、AST均低于CCl4肝損傷模型組,差異性顯著(p<0.01)。高劑量組的病理總積分低于CCl4模型組,差異性顯著(p<0.01),并且高劑量組與CCl4模型組相比氣球變性、細(xì)胞壞死病理積分及病理總積分明顯下降,且高、中、低劑量組均呈劑量反應(yīng)關(guān)系,其它病變類型與CCl4模型組相比也有減輕。說明五味貞甘飲品對化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用。

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Evaluation of the effect ofmixed zhen gan drinks on chemical liver injury

YU Shan,ZHANG Feng-qing*,JIE Song-lin

(College of Chemistry and Life Science,Changchun University of Technology,Changchun 130012,China)

To explore the protective effect on chemical liver injury of Mixed zhen gan drinks. Male Wistar rats were divided into 5 groups:blank group,model group and mixed zhen gan drinks with low dose group,middle dose group and high dose group. Each group was ntragastric administration for 30d,the acute hepatic injury model was made by CCl4except the control group,the level of ALT and AST was detected and pathology were carried out. Results:Level of ALT and AST in high and middle dose group was lower than that of CCl4hepatic injury model group with significant difference(p<0.01),rat pathologic total points of high dose group was lighter than CCl4hepatic injury model group with significant difference(p<0.01). Conclusion:Mixed zhen gan drinks had auxiliary protection effect on chemical liver injury。

Mixed zhen gan drinks；liver injury；CCl4

2014-03-24

于珊(1989-),女,碩士研究生,研究方向:保健食品開發(fā)。

*通訊作者:張鳳清(1967-),女,碩士,教授,研究方向:保健食品開發(fā)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)03-0360-03

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.069