張七二，鐘錦開 ，蒲榮 ，鄺樹華 ，王占科

(1、東莞市寮步醫(yī)院，廣東 東莞523400；2、南昌市解放軍第九四醫(yī)院，江西 南昌330002)

流行病學(xué)和基礎(chǔ)研究已證實人乳頭狀瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的主要病因，特別是持續(xù)的高危型HPV感染[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的HPV亞型有100多種，其中40余種與生殖道疾病相關(guān)[2]，不同HPV亞型其致病性不同，且不同地區(qū)及不同年齡段女性，HPV分布及感染率亦存在差異，因而非常有必要對不同地區(qū)女性HPV感染狀況進行流行病學(xué)檢查，為制訂適合本地區(qū)HPV感染防治工作提供理論依據(jù)。HPVDNA檢測是從病因?qū)W角度進行宮頸病變的篩查，診斷方面具有檢查快速、特異性高等特點[3]。本研究采用基因擴增及導(dǎo)流雜交技術(shù)對我院2960例女性患者宮頸脫落細胞中HPV21種亞型進行檢測，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2014年1月至2014年8月來我院就診女性患者2960例，年齡為16~81歲。

1.2 標(biāo)本采集 由臨床醫(yī)師以窺陰器暴露宮頸，將宮頸刷置于宮頸口輕輕搓動宮頸刷，順時針旋轉(zhuǎn)5圈后慢慢取出，置于裝有細胞保存液的取樣管中，擰緊瓶蓋及時送檢，若不能馬上檢測者則應(yīng)保存于4℃冰箱，長期保存者應(yīng)置于-20℃低溫冰箱中。

1.3 主要試劑與儀器 HPV-DNA檢測試劑盒 (潮州凱普生物化學(xué)有限公司)，ABI-7500熒光定量PCR儀，HHM-2型凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀。

1.4 檢測步驟

1.4.1 DNA提取 取含有宮頸脫落細胞的細胞混懸液0.5ml，14000r/min離心去上清液后，嚴(yán)格按照試劑說明書提取DNA。

1.4.2 PCR擴增 將1μlDNA模板加至0.75μlDNA Tag酶及23.25μlPCR Mix反應(yīng)體系中，瞬間離心并上機擴增。PCR擴增條件為，95℃變性9min；95℃、20s，55℃、30s，72℃、30s循環(huán) 40 次；72℃延伸5min。

1.4.3 雜交及結(jié)果判讀 嚴(yán)格按照試劑說明書操作，膜上出現(xiàn)清晰可見的藍紫色圓點者為陽性，不同位點代表不同亞型，其中低危型有6、11、42、43、44，高危型有 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、Cp8304，另設(shè)陰、陽性對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 HPV檢測情況 2960例標(biāo)本中共檢測出20種HPV亞型，未檢測到43亞型，830例標(biāo)本陽性，陽性率為28.04%。

2.2 HPV多重感染情況 830份陽性標(biāo)本中共檢出1090株HPV病毒，單一HPV亞型感染654例，占78.80%，多重亞型感染176例，占21.20%(以二重、三重感染為主)，另見一例七重亞型感染者。感染前五位亞型分別為 16(17.16%)、52(15.23%)、58(12.30%)、Cp8304(7.16%)、11(6.15%)；其中低危型 129 例，占 14.54%，以11、6 亞型為主；高危型 701 例，占 84.46%，以 16、52、58亞型為主，具體結(jié)果見表1、表2。

表1 830份HPV陽性標(biāo)本中HPV亞型分布情況(%)

表2 HPV亞型多重感染情況

2.3 不同年齡段HPV感染情況 不同年齡段HPV檢出率存在差異性，其中21~30歲、>50歲陽性檢出率分別為38%、33%，明顯高于28.04%平均水平(χ2=6.02 和 χ2=5.43，P<0.01)，具體結(jié)果見表 3。

表3 不同年齡段HPV感染情況

3 討論

宮頸癌在全球婦女惡性腫瘤中居第2位，僅次于乳腺癌，是威脅婦女健康的重要疾病。且其發(fā)病有年輕化趨勢。早期診斷和治療宮頸上皮內(nèi)瘤變是降低宮頸癌發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。人們正在努力尋找與腫瘤生物學(xué)行為關(guān)系更密切、更客觀、可重復(fù)性好的指標(biāo)[4]。

HPV是一類具有嚴(yán)格宿主范圍和組織特點特異性病毒，主要通過性傳播，低危型主要引起尖銳濕疣等癥狀，而高危型則與宮頸癌密切相關(guān)。大量研究證明持續(xù)HPV感染是引起宮頸癌的主要病因，且HPV載量與宮頸癌轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。HPV與CIN和宮頸癌有密切關(guān)系,HPV感染應(yīng)視為與CIN相關(guān)的早期病變[5]從CIN到浸潤性宮頸癌的演變過程中，高危HPV感染是宮頸癌的主要致癌因子之一。當(dāng)宮頸上皮感染HPV后細胞增殖活性升高，抑制及破壞人體局部的免疫功能，從而促進細胞過度增殖最終癌變[6]。吳兵[7]等報道HPV基因亞型分布與地區(qū)分布有關(guān)，存在一定的地區(qū)差異；Munoz[2]等示不同地區(qū)引起宮頸癌的HPV病毒亞型也不盡相同。本研究對本地區(qū)2960例婦女HPV感染情況及21種基因亞型分布情況進行流行病學(xué)回顧性分析，結(jié)果顯示，共檢測到20種亞型，未發(fā)現(xiàn)43亞型，與王長奇等報道基本一致[8]，符合亞洲高危HPV的流行現(xiàn)狀[9]。28.04%的感染率低于浙江地區(qū)的33.08%[9]及北京地區(qū)的57.10%[10]，高于呼和浩特地區(qū)13.04%[11]及深圳地區(qū)的17.50%[12]，高危型HPV感染 (23.68%)明顯高于低危型HPV感染(4.36%)，高危型以 16、52、58 亞型為主，而低危型以11、6亞型為主，與國際癌癥研究協(xié)會(IARC)最新調(diào)查結(jié)果基本一致[13]；在HPV感染患者中，單一亞型感染654例，占78.80%，明顯高于多重亞型感染，說明該地區(qū)主要以單一亞型感染為主；多重感染者中以二重感染為主(占60.00%)，另見一例七重感染者。據(jù)報道單一亞型感染可使宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險增加19.9倍，而多重HPV亞型感染可使宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險增加31.8倍[14]，表明HPV多重感染增加了宮頸癌患病率。年齡是HPV及宮頸癌發(fā)病的另一相關(guān)因素，在所分析各年齡段中，以20~30歲、>50歲年齡段陽性率較高，呈現(xiàn)“雙峰”狀，與Giulianu[15]報道基本一致，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為呈現(xiàn)此現(xiàn)象原因可能與性行為、性伴侶、激素及抵抗力等因素有關(guān)。

綜上所述，HPV感染及HPV亞型分布存在地區(qū)差異，且與女性年齡相關(guān)，因此非常有必要對不同地區(qū)的HPV感染特點進行流行病學(xué)調(diào)查，為當(dāng)?shù)匦l(wèi)計委因地制宜地制訂最佳宮頸癌方案提供理論依據(jù)。

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