王妙，查金苗，王子健

中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質(zhì)學國家重點實驗室，北京 100085

稀有鮈鯽Ras信號通路相關(guān)基因的克隆、序列分析及其組織分布

王妙，查金苗*，王子健

中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質(zhì)學國家重點實驗室，北京 100085

Ras基因是一類在生物進化過程中較為保守的原癌基因，在多種細胞生命活動中起到細胞增殖、分化和細胞骨架構(gòu)建等重要作用。本文克隆了稀有鮈鯽Ras信號通路相關(guān)的k-ras、n-ras、pik3cd、pin1和raf1基因的部分cDNA片段，并分析了其序列。序列分析結(jié)果表明，k-ras的氨基酸序列與鯉魚相對應(yīng)的氨基酸序列同源性最高，為99%；n-ras、pik3cd、pin1和raf1的氨基酸序列均與斑馬魚相對應(yīng)的氨基酸序列同源性最高，分別為99%、87%、96%和97%，結(jié)果表明稀有鮈鯽與鯉魚、斑馬魚的親緣關(guān)系較近。組織表達分析表明，k-ras、n-ras、pik3cd、pin1和raf1基因在肝臟、鰓、腎臟、腦和性腺等組織中具有表達差異性。本文為研究環(huán)境污染物對魚類致癌作用機制和安全性評估提供分子生物學基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

稀有鮈鯽；Ras基因；基因克隆

Ras基因是一類在生物進化過程中較為保守的原癌基因，在細胞的增殖、分化和細胞骨架的構(gòu)建等細胞生命活動中起到重要作用[1-2]。人類Ras基因家族包含3種功能性基因：H-ras、N-ras和K-ras，基因內(nèi)部的核甘酸序列相差較大，但編碼的產(chǎn)物均為p21蛋白(即Ras蛋白)。Ras蛋白是一種細胞信號傳遞蛋白，其功能主要是調(diào)節(jié)細胞增殖和分化，對細胞外信息的跨膜傳遞起重要作用，被稱為細胞信號網(wǎng)絡(luò)傳遞中的“分子開關(guān)”[3]。

Ras基因最常見的激活方式為點突變，約33%的人類惡性腫瘤存在Ras基因的點突變[4-5]?；罨腞as蛋白能結(jié)合和激活一系列的效應(yīng)酶，通過下游的效應(yīng)因子介導(dǎo)多種生物學功能[6]。Ras下游存在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，各信號通路之間相互影響和制約，其中Ras/Raf和PI3K/Akt通路是腫瘤發(fā)生過程中最重要的2個信號級聯(lián)因素[7]。目前在臨床醫(yī)學上，Ras相關(guān)研究工作主要集中在活化的Ras與各種腫瘤的關(guān)系，同時也利用各種模式動物研究Ras信號通路在腫瘤發(fā)生過程中的作用，以及Ras通路作為用藥靶點的研究。而在水生動物中對于Ras的研究目前主要還在起始階段，主要集中在基因的測序，以及少量的機理研究。Ren等[8]對斑馬魚胚胎時期血管生成的過程進行了研究，其研究結(jié)果表明，激活的N-Ras信號能夠調(diào)控斑馬魚的動-靜脈的分化。此外，Liu等[9]的研究也表明K-ras/PI3K-AKT信號在斑馬魚的造血作用和血管生成的過程中起重要作用。目前關(guān)于Ras通路相關(guān)基因信息特別是水生生物中相對缺乏，基于水生生物特別是魚類是腫瘤研究的良好模型，因此亟待開展Ras通路相關(guān)基因基礎(chǔ)信息學研究。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

Trizol reagent購自美國Invitrogrn公司，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、隨機引物、DNase I、dNTP、PCR所用Taq DNA聚合酶均為Promega(USA)公司產(chǎn)品。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗魚飼養(yǎng)

稀有鮈鯽為中國科學院水生生物研究所惠贈，并在本實驗室飼養(yǎng)并繁殖后代。使用經(jīng)過活性炭過濾并曝氣的自來水做為養(yǎng)殖用水，控制pH值在7.2～7.6，溫度為(25±1) ℃，水的硬度為44.0～61.0 mg·L-1(以CaCO3計算)。人工控制光照周期為16:8(晝:夜)。飼養(yǎng)期間投喂適量顆粒型商品餌料(Trea，德國)和新孵化的豐年蟲(Artemia nauplii)早晚各一次。

1.3 總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

稀有鮈鯽經(jīng)低溫麻醉后，迅速提取肝臟、鰓、性腺和腎臟等組織，總RNA的提取方法參照動物組織RNA抽提試劑盒進行，提取出的總RNA于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按Promega的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄說明書進行，所有試劑均來自Promega (USA)，加入總RNA 2 μg，隨機引物1 μg，補無核酸酶水至15 μL混勻，于70 ℃溫育5 min，迅速于冰中冷卻。隨后加入：5 μL 5xBuffer M-MLV，1.25 μL dNTP mix，1 μL RNAasin，200 U M-MLV Reverse Transcriptase和無核酸酶水1.75 μL，總共25 μL體系，整個過程在冰上進行。然后置于37 ℃溫育1 h，之后70 ℃放置10 min，并于-20 ℃保存。

木材泡沫的吸水率很高（圖3）。其開孔結(jié)構(gòu)類似于海綿。然而，松木纖維含有疏水性(即防水)成分，與山毛櫸相比，可減少松木泡沫的吸水性。其還具有吸收水分的能力，與泡沫密度無關(guān)——是纖維的疏水性質(zhì)，而不是孔隙的大小。一個主要的因素是山毛櫸和松木泡沫在水中保持尺寸穩(wěn)定——冷水中24 h后膨脹小于1%，因此有效地防止膨脹。然而，吸水可能產(chǎn)生的問題，可能促進真菌侵襲。對此可能的解決方案是在纖維混合物中添加混凝土。添加10%的混凝土可將櫸木泡沫的吸水率從31 kg/m2降低到2 kg/m2?；炷临x予泡沫更高的密度。替代的疏水添加劑是硅烷或蠟。然而，這兩者都對泡沫的強度具有負面影響。

1.4 目的基因引物設(shè)計及PCR擴增

在GenBank上搜索目的基因的同源序列，使用Primer Premier 5.0軟件，在目的基因保守區(qū)域設(shè)計引物，引物序列見表1。分別取稀有鮈鯽雌、雄個體基因組cDNA為模板進行PCR擴增。總反應(yīng)體系為25 μL，其中含模板DNA 1 μL，正向反向引物各1 μL，12.5 μL GoTaq?Green Master Mix (Promega，Madison，WI，USA)，加無核酸酶水補至25 μL。

PCR擴增循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性8 min；然后35個循環(huán)：94 ℃變性40 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄圖像。委托北京生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.5 目的基因序列分析

經(jīng)克隆測序獲得擴增片段用DNAman軟件進行分析，去除兩端引物序列，并進行氨基酸序列推導(dǎo)。將得到的序列在GenBank上進行Blast初步分析，并將分析結(jié)果及序列向GenBank提交。從GenBank選取并下載各物種基因的氨基酸序列，用ClustalX1.8軟件進行多重序列排列，將排列結(jié)果輸入Mega5.0軟件用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 定量PCR

定量PCR使用7 500 Real-TimePCR System(Applied Biosystems，USA)熒光定量PCR儀，內(nèi)參基因使用管家基因β-actin，基因定量的引物見表1。擴增體系為20 μL，PCR反應(yīng)體系包括：10 μL GoTaq?qPCR Master Mix (Promega)、0.4 μL正向引物(forward primer)、0.4 μL反向引物(reverse primer)、2 μL cDNA和7.2 μL無核酸酶水。PCR反應(yīng)程序為95 ℃，10 min；40個循環(huán)：95 ℃ 15 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s；最后一個循環(huán)做出熔解曲線：95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s。每個樣品3次重復(fù)。目的基因的相對表達量根據(jù)2-ΔΔCt法計算。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 13.0 和OriginPro 8.0軟件，實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)均為平均值±標準差表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Ras信號通路相關(guān)基因的克隆

本文克隆k-ras、n-ras、pik3cd、pin1和raf1共5個稀有鮈鯽Ras信號通路相關(guān)基因并測定其相應(yīng)的序列，序列大小分別為543、462、291、594以及471 bp。克隆的基因片段和相應(yīng)的氨基酸序列提交至GenBank，獲得的登陸號分別為KJ411872、KJ411873、KJ411874、KJ411875和KJ411876。

表1 稀有鮈鯽中Ras通路基因克隆和定量所用的PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for cloning and quantification of Ras pathway genes in rare minnow

2.2 同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

BLAST分析獲得為各基因Blastp的同源性(表2)，發(fā)現(xiàn)k-ras氨基酸序列與鯉魚、羅非魚、比目魚以及鱸魚相對應(yīng)的氨基酸序列同源性均為99%，

表2 稀有鮈鯽氨基酸序列同其他已知魚類相應(yīng)氨基酸序列的同源性比對Table 2 Homology comparison of amino acid sequences between Gobiocypris rarus and other fish species

圖1 基于NJ(neighbor-joining)法構(gòu)建的稀有鮈鯽與其他物種的核苷酸進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of genes sequence between Gobiocypris rarus and other organisms based on NJ (neighbor-joining) method

表明k-ras是具有較高的保守性。而n-ras、pik3cd、pin1以及raf1的氨基酸序列都與斑馬魚相對應(yīng)的氨基酸序列同源性最高，分別是99%、87%、96%和97%。聚類分析結(jié)果表明，稀有鮈鯽n-ras、pik3cd、pin1和raf1在進化關(guān)系上也與斑馬魚最接近(圖1)。

2.3 組織分布

熒光定量PCR測定了k-ras、n-ras、pik3cd、pin1和raf1基因在稀有鮈鯽肝臟、鰓、腎臟、腦和性腺5個組織中mRNA表達。在雌魚中，k-ras基因在腦和性腺中的表達量高于其他組織；在雄魚中，k-ras在鰓、腎臟、腦和性腺中的表達量均高于其在肝臟中的表達量。n-ras基因在雌魚和雄魚的各個組織中表達一致，性腺中的表達量最高，其次為肝臟，而其他組織相對較低。對于pik3cd基因，在雌雄魚腎臟、腦、性腺中表達量相對較高，在肝臟中表達相對較低；在鰓中的表達具有性別差異性，在雄魚中表達量較高，而在雌魚中的表達量較低。pin1基因在雌雄魚的腦和性腺中表達量高，而其他組織中的表達量相對較低。raf1基因在雌魚的鰓、腎臟和腦中表達量低于在肝臟和性腺中的表達量；而在雄魚中，raf1基因在性腺中表達量最高。

圖2 k-ras、n-ras、pik3cd、pin1和raf1基因在稀有鮈鯽組織中的表達Fig. 2 Expression of k-ras, n-ras, pik3cd, pin1 and raf1 mRNA in a panel tissues of rare minnow

3 討論(Discussion)

稀有鮈鯽是我國特有的小型理科魚類，近年來已被廣泛應(yīng)用于生態(tài)、遺傳、生理和環(huán)境科學等領(lǐng)域，已成為我國生態(tài)毒理研究方面的實驗生物[10]，然而目前關(guān)于分子生物學信息相對缺乏，特別是癌癥相關(guān)信號通路相關(guān)基因等基礎(chǔ)信息。Ras基因是一類在生物進化過程中較為保守的原癌基因，在細胞的增殖、分化和細胞骨架的構(gòu)建等細胞生命活動中起到重要作用[1-2]。本文克隆獲得了2個稀有鮈鯽Ras基因，包括k-ras和n-ras，序列比對發(fā)現(xiàn)k-ras與鯉魚的k-ras基因同源性最高，氨基酸序列相似性為99%，而n-ras與斑馬魚相對應(yīng)的氨基酸序列同源性最高，相似性為99%。組織分布發(fā)現(xiàn)n-ras基因主要在肝臟和性腺中高表達，而k-ras主要在腦和性腺中高表達。類似的，Liu等[9]克隆獲了斑馬魚的k-ras基因，同源性分析顯示k-ras蛋白與人類K-RAS2B和鼠K-RAS2高度相似，表明斑馬魚的k-ras基因與n-ras基因存在很大差別。另外，斑馬魚N-ras蛋白的同源性分析[11]表明Zras-B1編碼的蛋白與人類N-ras最相似，相似性為91%，與人類Ha-ras和Ki-ras的相似性分別為84%和85%。k-ras基因在斑馬魚單細胞階段、整個胚胎時期以及成魚的大部分組織中均能檢測到[9]。Ki-ras在比目魚卵巢和肝臟中都有表達[12]，小鼠HRAS轉(zhuǎn)錄組在腦、肌肉、皮膚中高度表達，而在肝臟中的表達量較低；KRAS轉(zhuǎn)錄組在腸道，肺以及胸腺中容易檢測到，NRAS主要在哺乳動物小鼠睪丸和胸腺中表達[13]。綜合以上研究表明k-ras和n-ras在不同物種中存在不同表達，同時組織分布存在較大差異。

Ras下游存在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，各信號通路之間相互影響[7]，pik3cd，raf1和pin1是Ras信號通路下游的關(guān)鍵基因，在信號激活和信號傳導(dǎo)過程中具有重要作用。其中pik3cd是PI3K-Akt 信號通路中的一個重要靶點，在細胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進增殖的關(guān)鍵作用，并且與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。已有報道表明miR-7通過靶向PIK3CD、mTOR和p70S6K能有效地調(diào)控PI3K/Akt信號通路，抑制肝癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移[15]。而raf1在Ras/Raf1/MAPK(ERK)細胞信號傳導(dǎo)途徑中具有重要作用[16]。Bokemer等[17]研究發(fā)現(xiàn)活化的Ras能激活Raf1，從而激活其下游的激酶(MEK和MAPK)，通過對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達的影響而將細胞增殖信號傳遞到細胞核內(nèi)，達到調(diào)節(jié)細胞增殖過程。pin1是一種高度保守的、特異的多肽脯氨酰基順反異構(gòu)酶，能特異性地催化磷酸化的絲/蘇-脯氨酸基序發(fā)生順反異構(gòu)，影響磷酸化蛋白的功能，其正常表達水平與細胞分裂緊密相連，在分裂旺盛的細胞中很容易檢測到[18]。pin1在多種腫瘤中高表達，可促進CyclinD1 等下游基因的表達，促進細胞的異常增生而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[19]。Bao等[20]研究發(fā)現(xiàn)在人類前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、腦瘤、肺癌、結(jié)腸癌腫瘤組織中pinl的均存在過表達。本文獲得了raf1、pin1和pik3cd基因序列信息，將為補充和完善背景生物學信息以及深入研究Ras信號通路的調(diào)控機制提供基礎(chǔ)。

本文獲得了稀有鮈鯽ras信號通路中k-ras，n-ras，pik3cd，raf1以及pin1等相關(guān)基因片段和序列的分子生物學信息，且獲得了在肝臟、鰓、腎臟、腦和性腺中表達譜，為深入研究化學品致癌作用機制提供了分子生物學基礎(chǔ)。

[1] Bos J L. Ras oncogenes in human cancer: A review [J]. Cancer Research, 1989, 49(17): 4682-4689

[2] Schmukler E, Kloog Y, Pinkas K R. Ras and autophagy in cancer development and therapy [J]. Oncotarget, 2014, 5(3): 577-586

[3] Bos J L. The ras gene family and human carcinogenesis [J]. Mutation Research, 1988, 195(3): 255-271

[4] Shin S H, Kim S C, Hong S M, et al. Genetic alterations of k-ras, p53, c-erbB-2, and DPC4 inancreatic ductal adenocarcinoma and their correlation with patient survival [J]. Pancreas, 2013, 42(2): 216-222

[5] Murtaza B N, Bibi A, Rashid M U, et al. Spectrum of k-ras mutations in Pakistani colorectal cancer patients [J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2014, 47(1): 35-41

[6] Cully M, Downward J. SnapShot: Ras signaling [J]. Cell, 2008, 133: 1292-1302

[7] De Luca A, Maiello M R, D'Alessio A, et al. The RAS/RAF/MEK/ERK and the PI3K/AKT signalling pathways: Role in cancer pathogenesis and implications for therapeutic approaches [J]. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 2012, 16(S2): S17-S27

[8] Ren C G, Wang L, Jia X E, et al. Activated n-ras signaling regulates arterial-venous specification in zebrafish [J]. Journal of Hematology & Oncology, 2013, 6: 34

[9] Liu L, Zhu S, Gong Z, et al. K-ras/PI3K-Akt signaling is essential for zebrafish hematopoiesis and angiogenesis [J]. PLoS ONE, 2008, 3(8): e2850

[10] 曹文宣, 王劍偉. 稀有鮈鯽: 一種新的魚類實驗動物[J]. 實驗動物科學與管理, 2003, 20(S1): 96-99

Cao W X, Wang J W. Rare minnow: A new laboratory animal in China [J]. Laboratory Animal Science and Management, 2003, 20(S1): 96-99 (in Chinese)

[11] Cheng R, Bradford S, Barnes D, et al. Cloning, sequencing, and embryonic expression of an n-ras proto-oncogene isolated from an enriched zebrafish (Danio rerio) cDNA library [J]. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 1997, 6(1): 40-47

[12] Fran?oise V H. cDNA cloning and expression of two Ki-ras genes in the flounder, Platichthys flesus, and analysis of hepatic neoplasms [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 2000, 126: 17-27

[13] Leon J, Guerrero I, Pellicer A. Differential expression of the ras gene family in mice [J]. Molecular and Cellular Biology, 1987, 7(4): 1535-1540

[14] Osaki M, Oshimura M, Ito H. PI3K-Aktpathway: Its functions and alterations in human cancer [J]. Apoptosis, 2004, 9(6): 667-676

[15] Fang Y X, Xue J L, Shen Q, et al. MicroRNA-7 inhibits tumor growth and metastasis by targeting the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway in hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology, 2012, 55(6): 1852-1862

[16] Magnuson N S, Beck T, Vahidi H, et al. The Raf-1 serine/threonine protein kinase [J]. Seminars in Cancer Biology, 1994, 5(4): 247-253

[17] Bokemer D, Sorokin A, Dunn M J. Multiple intracellular MAP kinase signaling cascades [J]. Kidney International, 1996, 49(5): 1187-1198

[18] Liou Y C, Ryo R, Huang H K, et al. Loss of Pin1 function in the mouse resembles the cyclinD-null phenotypes [J]. Proceedings of the National Academy of Science, 2002, 99(3): 1335-1340

[19] Wulf G M, Ryo A, Wulf G C, et al. Pin1 is overexpressed in breast cancer and potentiates the transcriptional activity of c-Jun towards the cyclinD1 gene [J]. EMBO Journal, 2001, 20(13): 3459-3472

[20] Bao L, Kimzey A, Sauter G, et al. Prevalent overexpression of prolylisomerase Pin1 in human cancers [J]. American Journal of Pathology, 2004, 164(5): 1727-1737

◆

Clone, Sequence Analysis and Distribution of Ras Pathway Genes in Rare Minnow

Wang Miao, Zha Jinmiao*, Wang Zijian

State Key Laboratory of Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Science, Beijing 100085, China

22 October 2014 accepted 12 November 2014

Ras gene is a kind of more conservative proto-oncogenes in the process of evolution, it is very important for cell proliferation and differentiation, and the construction of cytoskeleton. Partial cDNA sequences of k-ras, n-ras, pik3cd, raf1 and pin1, which are involved in Ras signal pathway, were cloned and sequenced from the liver of Gobiocypris rasus. Sequence analysis showed that the k-ras gene shared the highest sequence affinity with the amino acid sequence of Cyprinus carpio (99%), whereas the other four genes showed the highest sequence affinity with those of Danio rerio (99%, 87%, 96% and 97%, respectively). The phylogenetic trees were developed based on amino acid sequences of Gobiocypris rarus and other known species, which showed the closest genetic relationship with Gobiocypris rarus, Cyprinus carpio and Danio rerio. Besides, differential gene expression of k-ras, n-ras, pik3cd, raf1 and pin1 has been demonstrated across a panel of tissues in the rare minnow. It has been shown that all the genes had differential expression in liver, gill, kidney, brain and gonad. The present study offered scientific information for discovering cancer processes and assessing ecological health risk of aquatic xenobiotics of Gobiocypris rarus at molecular level.

Grobiocypris rarus; Ras pathway genes; clone

國家重大863化學品項目課題“化學品毒性高通量生物測試與評價技術(shù)”(2012AA06A302);國家水體污染控制與治理科技重大專項“東江流域生物毒性監(jiān)控與管理技術(shù)體系研究及應(yīng)用示范”(2014ZX07206-005-002)

王妙(1988-)，女，碩士，研究方向為水生態(tài)毒理學，E-mail: wangmiao8809@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zhajinmiao@gmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141022002

2014-10-22 錄用日期：2014-11-12

1673-5897(2015)2-338-08

X171.5

A

查金苗(1975-)，男，博士，研究員，主要研究興趣包括水生模型生物體系的構(gòu)建和發(fā)展、水環(huán)境生物毒性測試方法、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的篩選技術(shù)研究、環(huán)境污染物對水生生物分子毒理機制和水生態(tài)系統(tǒng)完整性評估方法等，在國內(nèi)外學術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文70余篇，SCI論文40余篇。

王妙, 查金苗, 王子健. 稀有鮈鯽Ras信號通路相關(guān)基因的克隆、序列分析及其組織分布[J]. 生態(tài)毒理學報, 2015, 10(2): 338-345

Wang M, Zha J M, Wang Z J. Clone, sequence analysis and distribution of Ras pathway genes in rare minnow [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 338-345 (in Chinese)