張 翠，郭積芳，孫 悅，王芳霞，楊章民

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

中介蝮蛇毒L－氨基酸氧化酶基因的生物信息學(xué)分析

張 翠，郭積芳，孫 悅，王芳霞，楊章民＊

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

采用生物信息學(xué)方法，對中介蝮蛇毒L－氨基酸氧化酶（GI－LAO）基因進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：GI－LAO基因所包含的開放閱讀框?yàn)? 515bp，編碼504個氨基酸殘基；GI－LAO一級結(jié)構(gòu)與白眉蝮GH－LAO的相似性最高，達(dá)99%；N－端的18個氨基酸殘基為信號肽，成熟肽含486個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為55.1kDa，理論等電點(diǎn)為6.55；該蛋白含有兩個結(jié)構(gòu)域：FAD結(jié)合域（56－123位氨基酸殘基）和催化結(jié)構(gòu)域（61～499位氨基酸殘基）；與白眉蝮GH－LAO序列比對發(fā)現(xiàn)，有4個氨基酸位點(diǎn)存在差異（分別是20、56、99和467位氨基酸殘基），用SIFT軟件分析表明，這四個位點(diǎn)對其功能無影響；該基因編碼的氨基酸序列有2個活性位點(diǎn)（H242和R343），2個N－糖基化位點(diǎn)（N190和N379），5個位點(diǎn)（R108、H241、Y390、G482和W483）與底物結(jié)合有關(guān)，4個保守半胱氨酸殘基形成兩對二硫鍵（C28—C191和C349—C430）；三維結(jié)構(gòu)建模結(jié)果表明，GI－LAO形成同源二聚體，每個單體由22個α－螺旋，22個β－折疊股和一些無規(guī)則卷曲、轉(zhuǎn)角等形成三個結(jié)構(gòu)域：FAD結(jié)合域，底物結(jié)合域以及α－螺旋域；在GI－LAO蛋白的進(jìn)化分析中，中介蝮GI－LAO與白眉蝮GHLAO的親緣關(guān)系最近。

中介蝮；L－氨基酸氧化酶；基因；生物信息學(xué)

L－氨基酸氧化酶（L－amino Acid Oxidase，LAO，EC1.4.3.2）是一種以黃素為輔酶的酶，能立體異構(gòu)性氧化L－氨基酸脫氨，生成對應(yīng)的α－酮酸、氨和H2O2，并伴隨氧氣的消耗［1］。LAOs廣泛存在于蝰科（蝰亞科和蝮亞科）、響尾蛇科、眼鏡蛇科、甚至海蛇的毒液中［2］，因其存在而導(dǎo)致新鮮蛇毒呈現(xiàn)黃綠色。蛇毒L－氨基酸氧化酶（Snake venom L－amino acid oxidase，SV－LAOs）是蛇毒中最受關(guān)注的家族之一，由于易于純化而成為研究L－氨基酸氧化酶的酶學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和藥物學(xué)的有趣客體［3］。關(guān)于LAOs的報道已經(jīng)很多，近年來有關(guān)研究指出從蛇毒中分離的LAOs具有調(diào)控血小板聚集、刺激水腫形成、誘導(dǎo)出血或溶血、抗病毒／HIV活性、抗菌消炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗寄生蟲活性等功能［4］。而且SV－LAOs對血小板聚集的影響呈現(xiàn)相反的作用：Naumann等［5］從巴伊亞盾頭蝮（Bothrops leucurus）中分離出的LAO能抑制由ADP誘導(dǎo)的血小板的聚集；而Izidoro等［6］從巴伊亞矛頭蝮（Bothrops pirajai）中分離出的LAO卻具有誘導(dǎo)血小板聚集的作用。有研究表明SV－LAOs的這些生物活性大部分與其催化產(chǎn)生的H2O2有直接或間接的關(guān)系，但也并不完全單獨(dú)由H2O2引起。這些生物活性使SV－LAOs具有潛在巨大的藥用開發(fā)價值和臨床應(yīng)用前景，因而受到科研工作者的青睞。

早在1944年，Zeller和Maritiz［1］在毒蝰（Vipera aspis）的毒液中檢測到了LAO；1950年，Singer和Kearney［7］首次從美洲食魚蝮（Agkistrodon pisciuorus Piscivorus）蛇毒中純化了LAO；隨后Wellner和Meister［8］從東部菱斑響尾蛇（Crotalus adamanteus）毒液中純化并獲得了LAO的晶體結(jié)構(gòu)。對于SV－LAOs的研究，20世紀(jì)70年代前主要集中在酶學(xué)和生理生化特性方面，80年代和90年代主要集中在分離純化和鑒定方面，90年代以后主要是對其生物活性、結(jié)構(gòu)、克隆表達(dá)等方面的研究［9］。

中介蝮為蝰科（Viperidae）蝮亞科（Crotalinae）亞洲蝮屬（Gloydius）毒蛇，在國內(nèi)廣泛分布于從蒙新區(qū)西部沙漠亞區(qū)、天山亞區(qū)到西部黃土高原亞區(qū)的遼闊區(qū)域（國外分布于西伯利亞南部及蒙古共和國），是該地區(qū)毒蛇的優(yōu)勢種，也是我國6種蝮蛇中毒性最強(qiáng)的一種［10］。迄今，尚未見關(guān)于中介蝮SVLAO的報道。本文采用生物信息學(xué)的方法，對來自中介蝮毒腺cDNA文庫［11］的一個高豐度表達(dá)的SV－LAO基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為其生物學(xué)活性及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

用于分析的中介蝮LAO的cDNA序列來自中介蝮毒腺cDNA文庫，生物信息學(xué)分析的有關(guān)序列均下載自NCBI（National Center for Biotechnology Information）核酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。所選的序列包括：白眉蝮（Gloydius halys，Q6STF1.1）、黃綠原矛頭蝮（Protobothrops flavoviridis，BAN82013.1）、竹葉青（Trimeresurus stejnegeri，Q6WP39.1）、諾維特矛頭蝮（Bothrops pauloensis，B5AR80.1）、南美巨蝮（Lachesis muta，AFP89360.1）、北美侏響尾蛇（Sistrurus catenatus edwardsi，B0VXW0.1）、非洲鋸鱗蝰（Echis ocellatus，B5U6Y8.1）和銀環(huán)蛇（Bungarus multicinctus，A8QL51.1）。

根據(jù)生物信息學(xué)軟件進(jìn)行在線分析（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／；http：／／cn.expasy. org／；http：／／www.cbs.dtu.dk／；http：／／psort. nibb.ac.jp／）。用DNAstar進(jìn)行開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）的查找和翻譯；用BlastX在線完成cDNA序列的相似性分析；用在線工具SignalP 4.1Server、ProtParam完成信號肽和氨基酸序列的理化性質(zhì)分析，用NCBI CDD、ClustalX2、SIFT、PROSITE、SWISS－MODEL進(jìn)行結(jié)構(gòu)域、氨基酸序列比對、氨基酸的忍受度和功能、N－糖基化位點(diǎn)、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；用MEGA5.1繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 中介蝮SV－LAO基因序列

利用DNAstar軟件分析該基因的cDNA序列，結(jié)果表明該cDNA序列全長1 734bp，包含一個1 515bp的ORF，編碼504個氨基酸殘基（圖1），將該基因命名為GI－LAO，GeneBank登錄號為KJ705002。

圖1 中介蝮蛇毒GI－LAO的cDNA序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and deduced amino acids of GI－LAO fromGloydius intermedius

將中介蝮GI－LAO的cDNA序列做BlastX分析，顯示GI－LAO與白眉蝮、黃綠原矛頭蝮、竹葉青、諾維特矛頭蝮、南美巨蝮、北美侏響尾蛇、非洲鋸鱗蝰、銀環(huán)蛇的SV－LAOs編碼的氨基酸序列一致性分別為99%、91%、92%、91%、91%、88%、83%、78%。從中可以看出，GI－LAO編碼的氨基酸序列與白眉蝮GH－LAO序列相似性最高（99%），與其他幾種SV－LAOs序列相似性也很高，顯示不同種屬蛇毒SV－LAOs基因編碼的蛋白在一級結(jié)構(gòu)上高度保守。

2.2 信號肽及理化性質(zhì)預(yù)測

采用SignalP 4.1Server預(yù)測中介蝮GI－LAO氨基酸序列的信號肽。結(jié)果表明：中介蝮GI－LAO編碼的氨基酸序列具有信號肽，可能的酶切位點(diǎn)在18位和19位氨基酸殘基之間。因此，GI－LAO編碼的氨基酸序列的信號肽為18個氨基酸殘基，從第1位氨基酸殘基開始到第18位氨基酸殘基；成熟肽為486個氨基酸殘基，從第19位氨基酸殘基開始到第504位氨基酸殘基。

根據(jù)http：／／cn.expasy.org／網(wǎng)站提供的蛋白質(zhì)分析軟件ProtParam，對GI－LAO編碼的成熟肽進(jìn)行理化性質(zhì)的預(yù)測，結(jié)果表明該成熟肽的分子質(zhì)量為55.1kDa，理論等電點(diǎn)為6.55，屬于穩(wěn)定型蛋白。

2.3 功能結(jié)構(gòu)域和氨基酸位點(diǎn)的預(yù)測與分析

采用NCBI CDD分析GI－LAO編碼的氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明：GI－LAO包含兩個結(jié)構(gòu)域，分別是56～123位氨基酸殘基對應(yīng)的FAD結(jié)合域（屬于NAD－binding－8結(jié)構(gòu)域）和61～499位氨基酸殘基對應(yīng)的催化結(jié)構(gòu)域（圖2），該蛋白屬于短鏈脫氫酶／還原酶（Short－chain dehydrogenases／reductases，SDR）超家族。

圖2 中介蝮蛇毒GI－LAO編碼的氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Structure domain analysis of GI－LAO fromGloydius intermedius

由于GI－LAO與白眉蝮GH－LAO氨基酸序列相似性高達(dá)99%，因此用ClustalX2軟件對GILAO與白眉蝮GH－LAO編碼的氨基酸序列進(jìn)行了比對，差異的氨基酸位點(diǎn)如表1。比較發(fā)現(xiàn)中介蝮GI－LAO與白眉蝮GH－LAO有4個氨基酸位點(diǎn)存在差異：其中第20位氨基酸殘基在白眉蝮是N，在中介蝮是側(cè)鏈帶負(fù)電荷的D；99位氨基酸殘基在白眉蝮是側(cè)鏈帶負(fù)電荷的D，而在中介蝮是側(cè)鏈不帶電荷的最小氨基酸G，另外2個位點(diǎn)（56位和467位）的氨基酸都屬于性質(zhì)相同的含分支側(cè)鏈氨基酸，不會對該酶的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響。用SIFT軟件預(yù)測GI－LAO和GH－LAO中這4個氨基酸差異位點(diǎn)的忍受度和功能，結(jié)果表明：這4個位點(diǎn)的差異均不會對GI－LAO的功能產(chǎn)生影響。這也提示我們在后續(xù)進(jìn)行GI－LAO的生物活性檢測時，可以參考白眉蝮GH－LAO的檢測方法。研究表明，活性位點(diǎn)H223和R322對LAOs介導(dǎo)的催化反應(yīng)是非常重要的［12］。對于本文研究的GI－LAO，這兩個位點(diǎn)分別是H242和R343（因?yàn)楹行盘栯模?，在進(jìn)行序列比對時，也發(fā)現(xiàn)這兩個位點(diǎn)是保守的。N－連接糖鏈對于LAOs與細(xì)胞表面的相互作用是非常重要的，它能夠使相互作用區(qū)域的H2O2集中，導(dǎo)致細(xì)胞毒性［12］。采用PROSITE預(yù)測GI－LAO氨基酸序列的N－糖基化位點(diǎn)，結(jié)果表明該氨基酸序列具有兩個潛在的N－糖基化位點(diǎn)（Asn－X－Thr／Ser，X為除脯氨酸外的任意氨基酸），分別是N190和N379；預(yù)測其底物結(jié)合位點(diǎn)分別為：R108、H241、Y390、G482、W483；保守半胱氨酸殘基有4個，能形成兩對二硫鍵（C28－C191和C349－C430）。

表1 中介蝮與白眉蝮SV－LAOs氨基酸序列的差異位點(diǎn)比較Tab.1 Comparison of the different amino acid residues between GI－LAO and GH－LAO

2.4 三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測及分析

圖3 中介蝮蛇毒GI－LAO三級結(jié)構(gòu)圖Fig.3 3－D deduced structure of GI－LAO fromGloydius intermedius

采用SWISS－MODEL在線同源建模方法，對中介蝮蛇毒GI－LAO編碼的氨基酸序列進(jìn)行建模。以1reoA為模板，所建模型是從第21位氨基酸殘基到第504位氨基酸殘基。結(jié)果（圖3）表明該蛋白是由非共價鍵形成的同源二聚體，每個單體由22個大小不等的α－螺旋，22條β－折疊股和一些無規(guī)則卷曲、轉(zhuǎn)角等形成。該蛋白每個單體含有一個FAD輔因子，形成三個結(jié)構(gòu)域：FAD結(jié)合域，底物結(jié)合域以及α－螺旋域。在底物結(jié)合域和α－螺旋域之間形成一個漏斗形底物進(jìn)入通道，底物進(jìn)入通道后與活性位點(diǎn)相結(jié)合［13］。從所建的模型中也能看出這三種結(jié)構(gòu)域。

2.5 GI－LAO蛋白進(jìn)化分析

用MEGA 5.1軟件中的MP法對GI－LAO蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，進(jìn)化樹各分支的置信度由Bootstrap 1000次檢驗(yàn)，并且以銀環(huán)蛇LAO氨基酸序列為外群。結(jié)果見圖4，可以看出進(jìn)化樹主要分為兩大支：銀環(huán)蛇、北美侏響尾蛇、南美巨蝮和諾維特矛頭蝮的SV－LAOs聚為一支；中介蝮GI－LAO與白眉蝮、竹葉青、黃綠原矛頭蝮、非洲鋸鱗蝰的SVLAOs聚為一支。在蝰科中，GI－LAO與蝮亞科的白眉蝮GH－LAO親緣關(guān)系最近，序列相似性達(dá)到99%，揭示出這兩種SV－LAOs的功能也非常相似。

圖4 用MP法計(jì)算的GI－LAO與其他氨基酸序列的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree by MP method on GI－LAO and other amino acid sequences of snakes

3 結(jié)論

蛇毒是自然界最豐富的蛋白源之一，LAO約占蛇毒總蛋白的1%～9%，尤其是在蝰科、響尾蛇科和眼鏡蛇科中含量最為豐富［13］。SV－LAOs通常是FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）或FMN（黃素單核苷酸）結(jié)合的糖蛋白同源二聚體分子，通過催化氧化L－氨基酸產(chǎn)生 H2O2，與蛇毒活性和毒性密切相關(guān)［4］。通常SV－LAOs保存在4℃中性的緩沖液中，大多數(shù)SV－LAOs呈現(xiàn)熱不穩(wěn)定性，其活性與pH和緩沖液離子強(qiáng)度有關(guān)。目前已知的LAOs在細(xì)胞內(nèi)一般由兩個非共價結(jié)合的亞基組成，有些由兩個分子質(zhì)量相同的同源亞基組成，而有些則由兩個異源亞基組成。該酶等電點(diǎn)pI變化也很廣，從4.0～8.5（酸性、中性和堿性）均有分布，并且以酸性為主。作為一種多功能酶，近年來人們又嘗試將SVLAOs作為治療心血管疾病、細(xì)菌性疾病、腫瘤、寄生蟲、病毒感染的新型藥物。隨著對該酶研究的深入，相信在不久的將來，它們作為藥物將會在臨床上發(fā)揮巨大的作用。

本文對中介蝮GI－LAO基因所做的生物信息學(xué)分析，有望為后續(xù)的生物活性及應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)，至于其糖基化類型及程度，對氨基酸底物的選擇性，催化活力大小及抗病毒能力，則有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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〔責(zé)任編輯 王 勇〕

Bioinformatics analysis of SV－LAO gene fromGloydius intermedius

ZHANG Cui，GUO Jifang，SUN Yue，WANG Fangxia，YANG Zhangmin＊
（School of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi′an 710119，Shaanxi，China）

A snake venom L－amino acid oxidase（SV－LAO）gene fromGloydius intermedius cDNA library was bioinformatically analyzed.The results showed that the open reading frame of cDNA is 1 515bp，encoding 504amino acids.The primary structures of LAOs between Gloydius halys and Gloydius intermedius showed the highest identity（99%）.The N－terminal 18amino acids is the signal peptide，so the mature peptide contains 486amino acids，with the theoretical molecular weight and isoelectric point being 55.1kDa and 6.55，respectively.GI－LAO contains two domains，ie.FAD binding domain and catalytic domain.A comparison of the primary structures between GI－LAO with GH－LAO（LAO of Gloydius halys）revealed that there are four amino acids differences（20，56，99and 467）.Online analysis with SIFT software indicated that these differences have no influence on the function of GI－LAO.The key residues in the active site are H242 and R343.The potential N－glycosylation sites are N190and N379.Five residues（R108，H241，Y390，G482，W483）form the substrate binding sites.The four conserved Cys residuces are presumably to form two disulfide bonds（C28—C191and C349—C430）.Tertiary structure remodel－ling revealed that GI－LAO is composed of 22ɑ－h(huán)elixes，22β－strands，turns and loops，which may then refold into three domains（the FAD－binding domain，the substrate－binding domain and theαhelical domain）.The GI－LAO protein phylogenetic tree indicates a closest relationship between Gloydius halys and Gloydius intermedius.These bioinformatical analysis would lay the foundation for further investigation of GI－LAO as anti－viral agent.

Gloydius intermedius；L－amino acid oxidase；gene；bioinformatics

Q811.4；Q71

：A

1672－4291（2015）05－0071－05

10.15983／j.cnki.jsnu.2015.05.355

2015－02－16

國家自然科學(xué)基金（30870303）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（GK200902029）；國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃

（CX14067）

張翠，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E－mail：zhangcui＠snnu.edu.cn

＊通信作者：楊章民，男，副教授，博士。E－mail：yzhangmin＠snnu.edu.cn