許晨昊，楊 光，林彤遠，周霞，范國榮*

［1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230031；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物（中藥）代謝產(chǎn)物研究重點實驗室，上海 200433；3.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，南京 210009］

用HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中硫辛酸的濃度及其毒代動力學(xué)研究

許晨昊1，楊 光2，林彤遠1，周霞3，范國榮2*

［1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230031；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物（中藥）代謝產(chǎn)物研究重點實驗室，上海 200433；3.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，南京 210009］

目的：建立測定SD大鼠血漿中硫辛酸的HPLC-MS/MS法，并將其應(yīng)用于硫辛酸的毒代動力學(xué)研究。方法：采用XAqua C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇（A）:水（B），0～2min A:B＝20:80，2～7min A:B＝95:5，7～9min A:B＝20:80，梯度洗脫9min；流速為1ml/min。采用負離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進行監(jiān)測，離子對：硫辛酸m/z205→171，內(nèi)標(biāo)布洛芬m/z205→161，測定大鼠連續(xù)28d灌胃硫辛酸300mg/kg后的主要藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果：硫辛酸線性范圍為0.005～5μg/ml，最低定量限為0.005μg/ml；日內(nèi)和日間精密度良好，RSD均＜15%。大鼠初次和末次給藥后的AUC0～24h分別為（23.16±2.45）和（21.27±2.62）μg·h·ml-1，AUC0～∞分別為（23.70±2.56）和（21.67±2.66）μg·h·ml-1，cmax分別為（24.34±2.50）和（22.23±2.61）μg/ml，t1/2分別為（5.22±0.57）和（4.96±0.23）h。硫辛酸在SD大鼠體內(nèi)無明顯的藥物蓄積現(xiàn)象。結(jié)論：該方法靈敏度高、專屬性強、操作簡便，適用于生物樣本中硫辛酸的測定及毒代動力學(xué)研究。

硫辛酸；毒代動力學(xué)；色譜法，高效液相；串聯(lián)質(zhì)譜法

［Pharm Care Res，2015，15（4）：265-268］

研究發(fā)現(xiàn)，長期暴露在高強度的噪聲下會給聽力帶來不可逆的損傷，其原因之一可能是噪聲暴露破壞了耳蝸的抗氧化體系，導(dǎo)致耳內(nèi)氧化和抗氧化體系失衡，耳蝸內(nèi)積累了大量氧自由基。這些過量的自由基會破壞細胞膜脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)，引起聽力損傷，而且噪聲暴露后期形成的活性氧又會進一步引起毛細胞損傷，造成永久性耳聾［1］。硫辛酸（lipoic acid）作為一種天然優(yōu)質(zhì)的抗氧化劑，是目前已知的唯一能在脂溶性和水溶性條件下均具有良好抗氧化作用的物質(zhì)，易穿過細胞膜，對血腦屏障有良好的穿透性。已有研究表明，硫辛酸可以高效地清除自由基，對噪聲性聽力損傷具有保護作用［2，3］。

對硫辛酸的體內(nèi)分析方法雖有文獻報道［4-7］，但檢測方法的前處理繁瑣，分析時間長，最低定量限高，且國內(nèi)尚無其在SD大鼠體內(nèi)毒代動力學(xué)研究的報道。本研究建立了一種靈敏且簡便的檢測方法，并對高劑量條件下硫辛酸在SD大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)進行了考察，為進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器 XAqua C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm，華譜公司）；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括Waters 2695液相色譜儀、Micromass Quattro Ultima質(zhì)譜儀和Masslynx 4.1工作站，美國Waters公司）；SCILOGEX MX-S渦旋混合器、Thermo Mircro 21R型低溫離心機（美國Thermo Electron公司）；Hi-Tech水純化系統(tǒng)（18.2MΩ，上海和泰儀器有限公司）；XS205Du十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo集團公司）。

1.2 試藥 硫辛酸供試品由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室提供；硫辛酸對照品（規(guī)格20mg，純度≥98%，批號12072905）由中國食品藥品檢定研究院提供；內(nèi)標(biāo)布洛芬對照品（純度≥99.5%）由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室提供；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；甲醇（色譜純，美國Merck公司）；氫氧化鈉（江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司）；鹽酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；去離子水為Hi-Tech水純化系統(tǒng)自制。

1.3 實驗動物 SD大鼠，雌雄各半，體重180～220g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物許可證號SCXK（滬）2013-0016。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 流動相為甲醇（A）:水（B），采用梯度洗脫方式（0～2min A:B＝20:80，2～7min A:B＝95:5，7～9min A:B＝20:80），流速1ml/min，柱后1:2分流，進樣量5μl，柱溫25℃。

2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用電噴霧離子源，負離子模式掃描。錐孔電壓為20V；毛細管電壓為3.0kV；離子源溫度為120℃；脫溶劑溫度為350℃；脫溶劑氣為氮氣，流速為800L/h；碰撞氣為氬氣，0.25Pa；駐留時間0.5s。掃描模式為MRM模式，硫辛酸：m/z205→171，錐孔電壓和碰撞能量分別為25V和8eV；內(nèi)標(biāo)布洛芬：m/z205→161，錐孔電壓和碰撞能量分別為25V和9eV。兩者的質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 硫辛酸和內(nèi)標(biāo)布洛芬的質(zhì)譜圖Figure 1 Mass spectrometry photograms of lipoic acid and internal standard ibuprofen

2.3 對照品溶液的配制 （1）硫辛酸對照品溶液：取硫辛酸對照品5mg，精密稱定，置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并配制成濃度為1mg/ml的儲備液，置于-20℃冰箱中備用。（2）布洛芬內(nèi)標(biāo)溶液：取布洛芬對照品5mg，按上述方法制得濃度為1mg/ml的儲備液，用甲醇稀釋后得濃度為0.5μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4℃冰箱中備用。

2.4 血漿樣品的處理 血漿樣品室溫下解凍后，取100μl置于1.5ml Eppendorf塑料離心管中，加入10μl濃度為0.5μg/ml的內(nèi)標(biāo)布洛芬溶液，渦旋混合5s，加入300μl乙腈，渦旋振蕩3min進行蛋白質(zhì)沉淀，于1 600×g離心10min。吸取上清液150μl置于另一1.5ml Eppendorf塑料離心管中，于2 400×g離心3min。分取上清液100μl裝瓶，置于進樣器中自動進樣5μl，進行HPLC-MS/MS分析。

2.5 動物分組、給藥及血漿樣品采集 16只SD大鼠，雌雄各半，按隨機數(shù)字表法分成首日、末日給藥組，每組8只。精密稱取硫辛酸供試品適量，溶于適量1mol/L的氫氧化鈉溶液中，待完全溶解后，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0左右。兩組大鼠以300mg·kg-1·d-1劑量單次灌胃給予藥液，末日給藥組連續(xù)給藥28d。在首次和末次給藥前以及給藥后0.25、0.5、1、2、4、8和24h，各組大鼠分別經(jīng)眼眶采血約0.3ml，并立即置于肝素鈉抗凝管中，1 000×g離心10min。吸取上層血漿，于-80℃低溫冰箱中保存，備用。

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1 專屬性 硫辛酸和內(nèi)標(biāo)布洛芬的保留時間分別為5.5、5.9min，血漿樣品均無干擾?？瞻籽獫{、空白血漿添加硫辛酸和內(nèi)標(biāo)布洛芬，及受試SD大鼠給藥后血漿的典型圖譜見圖2。

2.6.2 基質(zhì)效應(yīng) 空白血漿按2.4項下方法處理后，加入硫辛酸對照品儲備液制得低、中、高濃度為0.01、0.1、4μg/ml的血漿樣品（每個濃度平行3份），測定的峰面積與相應(yīng)濃度的硫辛酸對照品溶液的峰面積進行比較，即為血漿基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明本方法中基質(zhì)效應(yīng)不影響分析。

圖2 SD大鼠血漿中硫辛酸和內(nèi)標(biāo)布洛芬的HPLC-MS/MS譜圖Figure 2 HPLC-MS/MS photograms of lipoic acid and internal standard ibuprofen in plasma of SD rats

2.6.3 線性范圍及定量下限 取適量硫辛酸對照品儲備液，用甲醇逐級稀釋后，加入到大鼠空白血漿中，制得濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/ml的硫辛酸系列血漿樣品，按2.4項下方法處理并進樣，記錄色譜圖。以硫辛酸與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，以血漿樣品的濃度（c）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，權(quán)重為1/c2，得方程：y＝9.930× 10-3c＋1.778×10-2，r＝0.997 7。線性范圍0.005～5μg/ml，定量下限為0.005μg/ml。

2.6.4 準(zhǔn)確度和精密度實驗 配制濃度為0.01、0.1、4μg/ml的低、中、高濃度硫辛酸血漿樣品各5份，按2.4項下方法處理，于1d內(nèi)5個不同時間點測定，連續(xù)測3d。將待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入當(dāng)天的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實測濃度，計算日內(nèi)和日間精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果日內(nèi)與日間RSD均＜15%（見表1）。準(zhǔn)確度以方法回收率表示，同法制備低、中、高濃度對照品血漿各5份，按2.4項下方法處理，記錄色譜峰面積，計算待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算實測濃度與加入濃度的比值即為方法回收率，結(jié)果見表1。

2.6.5 提取回收率 配制濃度為0.01、0.1、4μg/ml的硫辛酸血漿各5份，按2.4項下方法處理后進樣，得峰面積作為Set 1；對照品溶液用甲醇稀釋，使之與Set 1待測理論濃度一致，每個濃度平行制備5份，進樣分析得峰面積Set 2。通過Set 1與 Set 2中硫辛酸峰面積均值的比值，求得其提取回收率（見表1）。

表1 精密度和回收率實驗結(jié)果Table 1 Results of precision and recovery rate tests

2.6.6 穩(wěn)定性實驗 按2.4項下方法制備0.01、4μg/ml兩個濃度的硫辛酸質(zhì)控樣品，分別置于-80℃冰箱中長期放置30d、經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)、室溫放置4h、提取后樣品在自動進樣器內(nèi)放置24h，考察穩(wěn)定性，結(jié)果表明血漿樣品在上述條件下均穩(wěn)定，RSD均＜15%（n＝3）。

2.6.7 稀釋效應(yīng) 對于實測樣品中濃度超過線性范圍的樣品，需要進行稀釋來考察稀釋效應(yīng)。同法配制8、20、40μg/ml的硫辛酸血漿樣品，-80℃保存，分析時分別取8μg/ml血漿樣品50μl加50μl空白血漿，取20μg/ml血漿樣品20μl加80μl空白血漿，取40μg/ml血漿樣品10μl加90μl空白血漿，以稀釋到原濃度的1/2、1/5、1/10，按2.4項下方法處理后進樣，測得濃度的準(zhǔn)確度為（89.08± 2.98）%，RSD為3.35%（n＝5）。

2.7 毒代動力學(xué)研究結(jié)果 用BAPP2.0軟件處理SD大鼠不同時間點血藥濃度，主要毒代動力學(xué)參數(shù)見表2。應(yīng)用非房室模型方法比較SD大鼠給藥后的平均血藥濃度-時間曲線，結(jié)果見圖3。SD大鼠灌胃給藥后第1天和第28天AUC、MRT、t1/2及cmax均無明顯變化，說明無藥物蓄積現(xiàn)象。

表2 SD大鼠首、末次給藥后硫辛酸的藥動學(xué)參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of lipoic acid after the first and last administrations in SD rats

圖3 大鼠首、末次給藥后硫辛酸的平均血藥濃度-時間曲線Figure 3 The mean plasma concentration-time curves of lipoic acid in SD rats plasma afterthe first and last administrations

3 討 論

作者比較了蛋白質(zhì)沉淀和液液萃取兩種前處理方法，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀法的提取效率明顯高于液液萃取。研究報道可能是由于硫辛酸極性較大，導(dǎo)致其在非極性溶劑中分配較少［7］。作者也曾采用等度洗脫方式，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)嚴重，無法滿足定量要求，從而采用了梯度洗脫的條件，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)得到明顯改善，響應(yīng)值更高。原因可能是血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)與待測物得到有效分離，從而避免與待測物形成競爭，提高了離子化效率。與文獻報道的方法［4-7］比較，采用本研究測定大鼠血漿中硫辛酸的方法，前處理方法更簡單，取樣量少，靈敏度較高，可以滿足硫辛酸在SD大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠灌胃給藥后，血漿中硫辛酸濃度15min即達峰值，24h時血藥濃度低于cmax的5%，且半衰期較短，說明其在大鼠體內(nèi)分布迅速，消除較快。其中末次給藥與首次給藥的AUC比值＜1，可能與體內(nèi)藥物代謝酶活性升高有關(guān)。

［1］王希營，朱全剛，高 靜，等.噪聲性聽力損傷藥物防治的研究進展［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2012，12（2）：139-144.

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Concentration determination of lipoic acid in rat plasma by HPLC-MS/MS method and its toxicokinetic study

XU ChenHao1，YANG Guang2，LIN TongYuan1，ZHOU Xia3，F(xiàn)AN GuoRong2*
［1.Shool of Pharmacy，Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China；2.Department of Pharmaceutical Analysis，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai Key Laboratory for Pharmaceutical（Chinese Materia Medica）Metabolite Research，Shanghai 200433，China；3.Department of Pharmaceutical Analysis，School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China］

Objective：To establish a HPLC-MS/MS method for concentration determination of lipoic acid in rat plasma and study its toxicokinetics.Methods：The analysis was performed on XAqua C18column（150mm×4. 6mm，5μm）. The mobile phase was composed of methanol（A）-water（B）in gradient elution at a flow rate of 1ml/min，0-2min A:B＝20:80，2-7min A:B＝95:5，7-9min A:B＝20:80. Negative ion multiple reaction monitoring（MRM）ofm/z205→171（lipoic acid）andm/z205→161（internal standard ibuprofen）was detected. Pharmacokinetic parameters of lipoic acid were calculated after gavage of 300mg/kg to the rats for 28d.Results：The calibration curve of lipoic acid had a good linearity within the range of 0. 005-5μg/ml and the limit of quantity was 0. 005μg/ml. The intra-day and inter-day RSD were＜15%. The main pharmacokinetic parameters of the first and last administration were as follows：AUC0-24hwere（23. 16±2. 45）and（21. 27± 2. 62）μg·h·ml-1，AUC0-∞were（23. 70±2. 56）and（21. 67±2. 66）μg·h·ml-1，cmaxwere（24. 34±2. 50）and（22. 23± 2. 61）μg/ml，t1/2were（5. 22±0. 57）and（4. 96±0. 23）h，respectively. There was no significant drug accumulation in SD rats.Conclusion：The method is sensitive，specific，convenient and suitable for the determination of lipoic acid in biological samples as well as toxicokinetic study.

lipoic acid；toxicokinetics；chromatography，high performance liquid；tandem mass spectrometry

R927.2，R969 ［

］ A ［

］ 1671-2838（2015）04-0265-04

10.5428/pcar20150409

2015-04-16

］ 2015-07-15

許晨昊（男），碩士生.

E-mail：xuchenhaomelody@126.com

范國榮，E-mail：guorfan@163.com

［

［本文編輯］ 陽凌燕