舒志恒，李華強(qiáng)，李 清，董睿方，鄭承劍*，秦路平*

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，銀川 750004；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海 200433；3.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室，上海 200234）

用HPLC法測定4種牡荊屬植物中黃荊子素的含量

舒志恒1，2，李華強(qiáng)2，3，李 清2，董睿方2，3，鄭承劍2*，秦路平2*

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，銀川 750004；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海 200433；3.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室，上海 200234）

目的：建立HPLC法測定4種牡荊屬植物（黃荊、牡荊、單葉蔓荊和蔓荊）果實(shí)中黃荊子素（VNL）的含量，比較黃荊子素的含量異同。方法：采用Zorbax Extend C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），Extend-C18保護(hù)柱（12.5mm× 4.6mm，5μm）；以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，0～18min 14.4%乙腈，18～30min 14.4%～17%乙腈，30～45min 17%乙腈；流速1.0ml/min；檢測波長254nm；柱溫30℃。結(jié)果：黃荊子素在14.2～455.0μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為96.99%。黃荊子素的含量在牡荊屬4種植物中存在差異，其中以黃荊子和蔓荊子中含量較高。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、快速，操作簡便，精密度高，重復(fù)性好，可用于4種牡荊屬植物中黃荊子素的含量測定。

牡荊屬；黃荊子素；含量測定；色譜法，高效液相

［Pharm Care Res，2015，15（4）：277-280］

牡荊屬植物所含化學(xué)成分類型較豐富，主要含有二萜類、木脂素類和黃酮類化合物。其中木脂素類和黃酮類化合物被認(rèn)為是該屬植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤及抗炎鎮(zhèn)痛等多種活性［1］。近年來，針對(duì)牡荊屬中的木脂素類成分的研究十分活躍［2-6］。本課題組前期曾對(duì)該屬植物黃荊的干燥成熟果實(shí)（黃荊子）的藥理活性和化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，獲得了一系列苯代萘型木脂素［4-6］。其中6-羥基-4β-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-3α-羥甲基-7-甲氧基-3，4-二氫-2-萘醛（簡稱為黃荊子素，VNL，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）的含量較高，且被證實(shí)有顯著的抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛和抗氧化等活性［3，7］。近期，通過LC-MS檢測證實(shí)，VNL廣泛存在于黃荊、牡荊、蔓荊、單葉蔓荊4種植物的果實(shí)中。本課題組曾采用HPLC法測定了黃荊子中VNL的含量［8］，但牡荊屬其他3種常用藥用植物中VNL的含量測定方法及不同種間VNL含量異同未見報(bào)道。本研究建立了牡荊屬4種常用藥用植物中VNL的HPLC測定方法，為進(jìn)一步建立以VNL為指標(biāo)成分的牡荊屬藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

圖1 黃荊子素（VNL）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of vitexdoin（VNL）

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Mettler AE分析天平［精度：0.01mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 藥材和試劑 黃荊V.negundoL.于2014年9月采自四川省簡陽市；牡荊V.negundoL.var.cannabifolia（Sieb.et Zucc.）Hand.-Mazz.于2014年9月采自第二軍醫(yī)大學(xué)藥用植物園；蔓荊V.trifoliaL.、單葉蔓荊V.trifoliaL.var.simplicifoliaCham.于2014年9月采自福建省福州市，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室秦路平教授鑒定。VNL對(duì)照品（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室自制，經(jīng)HPLC檢測純度＞98%）［4］；95%乙醇、甲酸為分析純，甲醇、乙腈為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 采用反相高效液相色譜Zorbax Extend C18柱（250mm×4.6mm，5μm），Extend-C18保護(hù)柱（12.5mm×4.6mm，5μm）；檢測波長254nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量5μl，流速1.0ml/min；以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，0～18min 14.4%乙腈，18～30min 14.4%～17%乙腈，30～45min 17%乙腈，對(duì)照品及樣品的HPLC譜圖見圖2。

2.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取VNL對(duì)照品4.55mg，用甲醇溶解，定容至10ml容量瓶中，即得455.0μg/ml的VNL對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）供試品溶液：精密稱取2.00g已干燥至恒重的樣品粉末（已過24目篩），加入25ml 50%乙醇，于75℃水浴恒溫回流提取1h。提取液過濾，濾渣重復(fù)提取2次，用適量體積的溶劑洗滌殘?jiān)?，收集濾液，60℃減壓濃縮，用50%乙醇轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，定容，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系以及檢測限和定量限的考察 精密吸取2.2（1）項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成濃度為455.0、227.5、113.8、56.9、28.4、14.2μg/ml的系列對(duì)照品溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝9.264 1X＋35.343，r＝0.999 8（n＝6）。結(jié)果表明VNL含量在14.2～455.0μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。通過不斷稀釋對(duì)照品溶液濃度，得到VNL的檢測限和定量限分別為0.055和0.182μg/ml。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取VNL對(duì)照品溶液5μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得VNL含量的RSD為1.41%（n＝6），結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（黃荊子）5μl，分別于放置0、2、4、8、12、16、24h后進(jìn)樣，測得VNL含量的RSD為0.38%（n＝7），結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批黃荊子樣品，按2.2（2）項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，測得供試品溶液中VNL含量的RSD為0.82%（n＝6），表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的黃荊子樣品（2.534mg/g）6份，每份1.00g，精密加入VNL對(duì)照品適量，按2.2（2）項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定含量并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果為（96.99± 1.71）%。

2.8 樣品測定 精密稱取單葉蔓荊子、蔓荊子、牡荊子和黃荊子樣品2.00g，按2.2（2）項(xiàng)下方法制備供試品溶液后按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算VNL含量，結(jié)果見表1。

3 討 論

圖2 4種牡荊屬植物果實(shí)中黃荊子素的HPLC譜圖Figure 2 HPLC photograms of vitexdoin in the fruits of the four Vitexspecies

表1 四種牡荊屬植物果實(shí)中黃荊子素的含量Table 1 The contents of vitexdoin in the fruits of the four Vitex species

作者考察了30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇作為提取溶劑對(duì)VNL提取率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VNL的提取量隨乙醇濃度的增大，先增加后有所下降，在乙醇濃度為50%時(shí)達(dá)到最大值，原因在于VNL為中等極性成分，溶劑極性過低會(huì)造成其溶解度的下降。同時(shí)還比較了不同的提取溫度（55、65、75、85、95℃）對(duì)提取率的影響，發(fā)現(xiàn)VNL的提取率在75℃時(shí)達(dá)到最高，此后升高提取溫度，提取率變化不明顯?？紤]到提取溫度過高時(shí)，VNL含有多個(gè)酚羥基，受熱不穩(wěn)定，另外乙醇溶液的揮發(fā)也會(huì)造成有機(jī)溶劑的大量損失。因此選擇75℃作為本研究中樣品的提取溫度。本研究在選擇流動(dòng)相組成和確立洗脫梯度時(shí)曾參考文獻(xiàn)［8］，按其方法測定4種牡荊屬植物中VNL的含量，發(fā)現(xiàn)除黃荊外其他3種植物中目標(biāo)物的分離效果并不理想。作者經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定梯度洗脫條件。此條件下4種牡荊屬植物的供試品溶液基線平穩(wěn)，目標(biāo)物均得到良好分離，且重復(fù)性好。

樣品測定結(jié)果表明，不同種間VNL含量存在較大差異，其中以黃荊子、蔓荊子含量較高，單葉蔓荊子次之，牡荊子中含量最低。有文獻(xiàn)曾對(duì)黃荊子、蔓荊子、單葉蔓荊子、牡荊子的藥理活性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)黃荊子的解熱鎮(zhèn)痛活性較強(qiáng)，而牡荊子效果最差［9］。本課題組前期一系列研究亦表明［4-7］，牡荊屬木脂素類成分具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛和抗骨質(zhì)疏松活性，結(jié)合本研究中4種植物的VNL含量測定結(jié)果，推測該屬植物藥理活性強(qiáng)弱與木脂素類成分的含量相關(guān)。

［1］周 燕，何蓉蓉，邱 峰，等.牡荊屬植物的研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（17）：229-233.

Zhou Yan，He RongRong，Qiu Feng，et al. Research advances inVitexL. ［J］. Chin J Exp Tradit Med Formuale，2010，16（17）：229-233. In Chinese with English abstract.

［2］Xin Hong，Kong Ying，Wang Yong，et al. Lignans extracted fromVitex negundopossess cytotoxic activity by G2/M phase cell cycle arrest and apoptosis induction［J］. Phytomedicine，2013，20（7）：640-647.

［3］Zhou YingJun，Liu Y E，Cao JianGuo，et al. Vitexins，nature-derived lignan compounds，induce apoptosis and suppress tumor growth［J］. Clin Cancer Res，2009，15（16）：5161-5169.

［4］Zheng ChengJian，Huang BaoKang，Han Ting，et al. Nitric oxide scavenging lignans fromVitex negundoseeds［J］. J Nat Prod，2009，72（9）：1627-1630.

［5］Zheng ChengJian，Tang WeiZong，Huang BaoKang，et al. Bioactivity-guided fractionation for analgesic properties and constituents ofVitex negundoL. seeds［J］. Phytomedicine，2009，16（6-7）：560-567.

［6］Zheng ChengJian，Zhang XiangWang，Han Ting，et al. Antiinflammatory and anti-osteoporotic lignans fromVitex negundoseeds［J］. Fitoterapia，2014，93：31-38.

［7］ 鄭承劍.黃荊子的抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其品質(zhì)評(píng)價(jià)［D］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2010.

Zheng ChengJian.Anti-inflammatory constituents and quality evaluation ofVitexnegundofruits［D］.Shanghai：Second Military Medical University，2010.In Chinese with English abstract.

［8］Zheng ChengJian，Zhao XiangXiang，Ai HongWei，et al. Therapeutic effects of standardizedVitex negundoseeds extract on complete Freund’s adjuvant induced arthritis in rats［J］. Phytomedicine，2014，21（6）：838-846.

［9］鐘世同，邱光鐸，劉元帛，等.單葉蔓荊子、蔓荊子、黃荊子和牡荊子的藥理活性比較［J］.中藥藥理與臨床，1996，（1）：37-39.

Zhong ShiTong，Qiu GuangDuo，Liu YuanBo，et al. Comparison of pharmacological activities of the fruits ofVitextrifoliaL. var.simplicifoliaCham. ，Vitex trifoliaL. ，Vitex negundoL. andVitex negundoL. var.cannabifolia（Sieb. et Zucc. ）Hand. -Mazz. ［J］. Pharmacol Clin Chin Mater Med，1996，（1）：37-39. In Chinese.

Content determination of vitexdoin in the fruits of four Vitexspecies by HPLC method

SHU ZhiHeng1，2，LI HuaQiang2，3，LI Qing2，DONG RuiFang2，3，ZHENG ChengJian2*，QIN LuPing2*
（1.Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China；2.Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；3.Department of Botany，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Objective：To establish a HPLC method for the determination and comparison of the content of vitexdoin（VNL）in the fruits of four relatedVitexspecies such asV.negundoL. ，V.negundoL. var.cannabifolia（Sieb. et Zucc. ）Hand. -Mazz. ，V.trifoliaL. var.simplicifoliaCham. andV.trifoliaL. .Methods：Analyses were performed on Zorbax Extend C18analytical column（250mm×4. 6mm，5μm）and Extend-C18guard column（12. 5mm×4. 6mm，5μm）. Mobile phase was composed of acetonitrile-0. 1%formic acid in gradient elution at a flow rate of 1. 0ml/min：0-18min 14. 4%acetonitrile，18-30min 14. 4%-17%acetonitrile，30-45min 17%acetonitrile. Detection wavelength was 254nm and column temperature was 30℃.Results：VNL displayed good linearity within the ranges of 14. 2-455. 0μg/ml and average additional recovery rate was 96. 99%. VNL content in the fruits of the four species varied considerably，with VNL contents inV.negundoL. andV.trifoliaL. being higher than those in the other two species.Conclusion：The HPLC method proves to be accurate，simple，rapid，precise and reproducible. It could be used for content determination of VNL in the fruits of the fourVitexspecies.

VitexL.；vitexdoin；content determination；chromatography，high performance liquid

R927.2 ［

］ A ［

］ 1671-2838（2015）04-0277-04

10.5428/pcar20150412

2015-03-27

］ 2015-07-10

國家自然科學(xué)基金（81102773，81473328），上海市科委項(xiàng)目（14401902500，14R21411600），上海市衛(wèi)生系統(tǒng)新優(yōu)青計(jì)劃（XYQ2013100）

舒志恒（男），碩士生.E-mail：13817760547@163.com

鄭承劍，E-mail：zhengchengjian@smmu.edu.cn；秦路平，E-mail：qinluping@126.com

［

［本文編輯］陽凌燕