林貞賢，甘慶萌，張聰

(泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院，山東泰安271000)

泰山螭霖魚全人工催產(chǎn)繁殖技術(shù)初步研究

林貞賢，甘慶萌，張聰

(泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院，山東泰安271000)

本研究以不同種類及劑量的催產(chǎn)藥物對(duì)泰山螭霖魚進(jìn)行注射催產(chǎn)，并測(cè)定了催產(chǎn)前后親魚體內(nèi)GtH水平的變化.結(jié)果表明:以人體絨毛膜促性腺激素(HCG)25IU+促黃體釋放激素類似物A2(LHRHA2)0.4μg+地歐酮(DOM)0.2mg的催產(chǎn)組效果最佳，其效應(yīng)時(shí)間12h左右，催產(chǎn)率為66.7%，且與對(duì)照組差異顯著，后經(jīng)人工擠卵、授精，并成功孵化出了仔魚;催產(chǎn)效果與催產(chǎn)時(shí)機(jī)(親魚的性腺成熟度)相關(guān);催產(chǎn)藥物可提高雌雄親魚體內(nèi)促性腺激素(GtH)的水平.

泰山螭霖魚;人工催產(chǎn);促性腺激素(GtH)

泰山螭霖魚(Varicorhinus°macrolepis Bleeker)學(xué)名多鱗白甲魚，俗稱赤鱗魚，隸屬鯉科、鲃亞科、白甲魚屬，是一種為泰山所獨(dú)有的小型野生魚類，是泰安市首個(gè)獲得國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)的產(chǎn)品，其人工開發(fā)利用前景廣闊［1－2］.

目前，經(jīng)泰安市水產(chǎn)養(yǎng)殖專家多年的努力，泰山螭霖魚的人工繁殖已取得成功，主要包括親魚培育、組群、制造人工產(chǎn)盆、收卵、孵化等環(huán)節(jié)［3］.整套繁殖技術(shù)相對(duì)原始落后，加之螭霖魚屬分批產(chǎn)卵的類型，自然狀態(tài)下無(wú)法實(shí)現(xiàn)集約化、規(guī)?；?人工催產(chǎn)可以使雌魚集中產(chǎn)卵，便于受精卵的孵化與仔魚的培育.現(xiàn)如今，許多之前繁殖困難的商品魚，如黃顙魚［4］，泥鰍［5］等都實(shí)現(xiàn)了人工催產(chǎn)和規(guī)模化繁殖.然而，目前，螭霖魚在人工催產(chǎn)方面還沒(méi)有一套成熟的技術(shù)，雖然有劉傳忠［6］、劉永進(jìn)［7］、朱桂玉［8］等人先后對(duì)泰山螭霖魚的人工催產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行了初步研究，但其催產(chǎn)效果仍待進(jìn)一步驗(yàn)證和優(yōu)化，全人工繁殖技術(shù)更是尚未見報(bào)道.本項(xiàng)目組成員于2015年4月至5月對(duì)螭霖魚進(jìn)行了人工催產(chǎn)、擠卵、授精、孵化等繁殖技術(shù)的初步研究，并測(cè)定了注射催產(chǎn)激素前后雌雄親魚體內(nèi)促性腺激素(GtH)的水平，本研究的開展旨在為螭霖魚規(guī)模化、集約化苗種繁育提供理論和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 親魚培育

選擇體質(zhì)健壯、性情活潑、無(wú)病、無(wú)傷的4冬齡螭霖魚(雌雄各半，雌魚體重50g左右，雄魚體重35g左右)作為親魚，6－12尾親魚投放在循環(huán)水族箱(100×80×40cm)中進(jìn)行強(qiáng)化培育，整個(gè)繁殖期間水族箱水溫控制在18－21℃.親魚每天投喂升索牌漁用飼料(S8)2次，投喂量為其體重的0.5%－1%.每天對(duì)水族箱中的水質(zhì)、水溫及親魚的吃食情況進(jìn)行觀察記錄，并對(duì)水族箱進(jìn)行吸污和換水，換水量為總水體的1/5左右.

1.2 人工催產(chǎn)

在四月下旬時(shí)，我們觀察到雄魚對(duì)雌魚追逐增強(qiáng)并不時(shí)撞擊雌魚腹部，撈起雄魚并輕擠腹部即有濃稠且呈乳白色的精液流出，入水即散.雌魚腹部膨大柔軟，卵巢輪廓明顯.我們于4月22日，隨機(jī)選取雌魚20尾進(jìn)行了第一次批次的催產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，催產(chǎn)藥物為HCG 60IU/尾.第二批次于5月1日進(jìn)行，隨機(jī)選取雌魚12尾，分成四個(gè)繁殖組，每組均為雌魚3尾，各組劑量分別為HCG50 IU/尾、HCG40IU/尾、HCG60 IU/尾和HCG75IU/尾.于5月9日進(jìn)行第三批次實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)選取雌魚15尾，分成三個(gè)繁殖組，第各組催產(chǎn)劑種類和劑量分別為HCG50IU/尾、LHRH－A20.5μg+DOM0.2mg/尾、HCG50IU+LHRH－A20.5μg +DOM0.2mg/尾.于5月13日進(jìn)行了第四批次催產(chǎn):精選成熟度高的雌魚6尾，催產(chǎn)劑種類和劑量為HCG25IU+LHRH－A20.4μg+DOM0.2mg/尾.四個(gè)批次均設(shè)置對(duì)照組(雌魚10尾).注射催產(chǎn)藥物劑量在0.15ml－0.25ml，所用絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素類似物A2(LHRH－A2)和地歐酮(DOM)，均為寧波市三生藥業(yè)有限公司出品.

注射和尾靜脈采血均使用lmL注射器配5.5號(hào)靜脈輸液針.注射方法為:將親魚撈出并用干凈的紗布裹住，一人固定魚的頭部與尾部，一人手持針頭在胸鰭基部無(wú)鱗處的凹入部位，將針頭朝魚體前方與體表成45°角刺入約1cm，后將注射液緩緩注入魚體內(nèi).

1.3 人工授精

催產(chǎn)注射12h后，對(duì)實(shí)驗(yàn)中的處理組和對(duì)照組均嘗試進(jìn)行人工擠卵.催產(chǎn)組若有飽滿游離的卵粒流出，則計(jì)為催產(chǎn)成功，若沒(méi)有卵子流出，則親魚放回繼續(xù)培育，12h經(jīng)2次嘗試擠卵，仍無(wú)卵粒流出，則為催產(chǎn)失敗.人工擠卵的具體操作如下:撈取雌魚，用干爽的紗布將魚身包住，擦干其腹部及泄殖孔，使魚尾斜向下，一手固定魚的頭部，一手輕輕地由上而下擠壓雌魚腹部，若有魚卵流出，則落入潔凈干燥的搪瓷托盤中.擠出魚卵后立即撈取一尾雄魚，用同樣的方法，將精液擠壓至魚卵上，為保險(xiǎn)起見，再撈一尾雄魚，將精液擠入魚卵上.用毛筆將精卵充分混勻，再倒入適量的精子稀釋液(0.2%的生理鹽水)，并用毛筆輕輕攪動(dòng)精卵，使之充分混合，然后加入晾曬過(guò)的自來(lái)水，輕輕攪拌，倒掉一部分水，再加入新水，如此反復(fù)多次，盡快地沖洗掉多余的精液，同時(shí)，盡量使所有的卵粒都散開，觀察到卵膜吸水膨脹后，加水深約1cm，受精卵在盤中靜水孵化.

1.4 人工孵化

靜水孵化是在室內(nèi)進(jìn)行，并用硬紙板對(duì)孵化盤進(jìn)行遮光處理，孵化水溫在18－20℃，孵化過(guò)程中每8個(gè)小時(shí)換水一次，每次換去托盤中2/3的水，緩緩加入新水，避免水流過(guò)大沖擊受精卵.換水時(shí)挑去發(fā)白的魚卵，當(dāng)鏡檢發(fā)現(xiàn)受精卵處于囊胚后期或原腸胚前期，統(tǒng)計(jì)受精率.3天左右魚卵孵化出膜，統(tǒng)計(jì)出苗數(shù)，之后每次換水挑去發(fā)育過(guò)程中的死胚，8天左右，健康的仔魚能正常平游，統(tǒng)計(jì)出苗數(shù).

1.5 激素測(cè)定

為了比較泰山螭霖魚催產(chǎn)前后體內(nèi)促性腺激素(GtH)的水平變化，本研究于5月16日和29日先后進(jìn)行了兩次測(cè)定.具體方法為:每次均對(duì)雌雄各6尾親魚進(jìn)行注射催產(chǎn)，劑量為HCG25IU+LHRHA20.4μg+DOM0.2mg/尾(催產(chǎn)組)，0.6%生理鹽水0.15ml(陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)照組)在催產(chǎn)前和注射催產(chǎn)激素12h后分別隨機(jī)抽取雌雄泰山螭霖親魚各3尾，進(jìn)行尾靜脈采血(1mL/尾)，所抽取血液均加入離心管并做好標(biāo)記，室溫放置2h，1000 rpm/min離心20 min，取上清，用魚類促性腺激素釋放激素ELISA試劑盒(南京森貝伽公司所生產(chǎn))，測(cè)定樣品中魚促性腺激素(GtH)的含量.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包中的fisher精確概率法對(duì)催產(chǎn)組和對(duì)照組進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 催產(chǎn)效果

各批次親魚，經(jīng)2次嘗試擠卵，其中第4批次催產(chǎn)率最高，為66.7%，第1批次催產(chǎn)率為25%，第2、3批次均不理想，分別有2個(gè)和1個(gè)催產(chǎn)組在注射催產(chǎn)藥物后，未表現(xiàn)出應(yīng)有的效應(yīng).各批次的受精率較高，魚卵破膜率也較高，而出苗率很低，詳見表1.

表1 螭霖魚催產(chǎn)及受精卵孵化情況

本次實(shí)驗(yàn)中，第一批次產(chǎn)卵5尾，未產(chǎn)15尾.第二批次中第1、2催產(chǎn)組均為產(chǎn)卵1尾，未產(chǎn)2尾.第三批次第1、2催產(chǎn)組均為產(chǎn)卵1尾，未產(chǎn)4尾.第四批次產(chǎn)卵4尾，未產(chǎn)2尾，詳細(xì)結(jié)果見表2.卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示前三批次中催產(chǎn)組與對(duì)照組之間的差異不顯著(P＞0.05)，第四批次中催產(chǎn)組與對(duì)照組之間差異顯著(P＜0.05).結(jié)果見表2.

表2 人工催產(chǎn)組與對(duì)照組情況對(duì)比

2.2 注射催產(chǎn)激素對(duì)螭霖魚促性腺激素(GtH)的影響

5月16日和29日兩次注射催產(chǎn)激素后，均發(fā)現(xiàn)雄魚有不斷追逐雌魚現(xiàn)象，放入產(chǎn)卵沙盆12h后未實(shí)現(xiàn)其自然產(chǎn)卵.通過(guò)測(cè)定促性腺激素(GtH)發(fā)現(xiàn)，5月16日催產(chǎn)組前后雄魚體內(nèi)GtH含量平均為475ng/L和570ng/L，催產(chǎn)前后雌魚體內(nèi)GtH含量平均為210ng/L和380ng/L.5月29日催產(chǎn)前后雄魚體內(nèi)GtH含量平均為385ng/L和505ng/L，雌魚體內(nèi)GtH含量平均為192ng/L和267.5ng/L，而注射生理鹽水的對(duì)照組內(nèi)雌雄魚體內(nèi)激素變化不大，結(jié)果詳見表3.

表3 激素對(duì)螭霖魚體內(nèi)促性腺激素(GtH)的影響

3 分析與討論

魚類繁殖是在下丘腦—腦垂體—性腺軸的控制下完成的.利用外源激素處理是控制養(yǎng)殖魚類繁殖成熟的重要可靠方法.最常用魚類催產(chǎn)劑有絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素(LHRHA)、魚類腦垂體(PG)等，外源激素可刺激腦垂體釋放促性腺激素(GtH)，誘導(dǎo)卵巢性腺類固醇激素的生成和卵子的排放.

HCG是從妊娠早期的孕婦或孕畜尿中提取出來(lái)的一種糖蛋白激素，可直接作用于性腺，具有誘導(dǎo)排卵的作用.劉永進(jìn)等人通過(guò)對(duì)泰山螭霖魚親魚注射1IU/g的HCG進(jìn)行人工催產(chǎn)，取得了較好效果［7］.但我們?nèi)齻€(gè)批次的HCG單劑注射催產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，催產(chǎn)效果均不理想(催產(chǎn)率25%－33%).造成這種差異的原因是HCG的選擇與性腺發(fā)育程度密切相關(guān)，劉永進(jìn)［7］等人催產(chǎn)日期為5月22日，晚于我們的催產(chǎn)日期，分析可能他們所用的親魚成熟程度好，正符合了HCG所具有較強(qiáng)促排卵的作用，但催熟機(jī)制不及垂體和釋放激素類似物的特點(diǎn).筆者認(rèn)為單用HCG催產(chǎn)螭霖魚時(shí)，效果不佳.尤其是在螭霖魚繁殖初期，即使增加用量到1.2IU/g和1.5IU/g，催產(chǎn)效果仍不明顯.我們?cè)陔S后的人工擠卵時(shí)發(fā)現(xiàn)有個(gè)別雌魚腹部膨大、變硬，生殖孔紅腫，輕壓腹部有渾濁并微帶有黃色液體流出，這可能是高劑量的HCG使魚卵快速吸水膨脹，無(wú)法產(chǎn)出體外，而在體內(nèi)退化所致.

LHRH－A是一種人工合成的九肽激素，相對(duì)分子質(zhì)量小，反復(fù)使用不會(huì)產(chǎn)生抗藥性，并對(duì)溫度的變化敏感性較低.地歐酮(DOM)是一種多巴胺抑制劑，可以抑制或消除促性腺激素釋放激素抑制激素(GRIH)對(duì)下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的影響，從而增加腦垂體GtH的分泌，促使性腺發(fā)育成熟.Linpe方法(即LHRH－A加多巴胺D2受體拮抗劑地歐酮)廣泛用于鰱、鳙、草、青魚的人工催產(chǎn)［9］.本研究中第三批次第三催產(chǎn)組利用這兩種催產(chǎn)劑對(duì)螭霖魚進(jìn)行催產(chǎn)，兩次嘗試擠卵均未成功，分析可能與親魚性腺發(fā)育成熟度差、樣本小有關(guān).同泰山螭霖魚同屬鲃亞科的倒刺鲃，采用一次注射催產(chǎn)激素后再采用人工授精的方法，催產(chǎn)成功并獲得產(chǎn)卵率80%的好效果，催產(chǎn)劑種類和劑量為雌魚注射LHRHA24μg+DOM 5mg/kg［10］.因此，LHRH－A2+DOM對(duì)螭霖魚的催產(chǎn)效果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證.

目前，魚類催產(chǎn)中多用這三種激素互相混合使用，注射劑量受親魚性腺發(fā)育成熟度、水溫、雌雄比等因素影響.我們第三批次混合這三種催產(chǎn)劑對(duì)螭霖魚進(jìn)行催產(chǎn)，效果仍然不理想.劉傳忠［6］等人給每尾雌魚(93g)注射劑量為HCG150UI+LHRH－A23μg，但注射催產(chǎn)藥物后，螭霖魚親魚未表現(xiàn)出應(yīng)有效應(yīng).這與本研究第三批次出現(xiàn)的現(xiàn)象較一致，這可能與HCG注射劑量偏大、1次注射、注射時(shí)機(jī)不適等因素有關(guān).大劑量催產(chǎn)藥物的使用以及時(shí)機(jī)過(guò)早可能是我們催產(chǎn)失敗的原因.

在最適宜的時(shí)機(jī)對(duì)親魚進(jìn)行催產(chǎn)，是家魚人工繁殖取得成功的關(guān)鍵因素之一［9］.我們?cè)谶M(jìn)行第四批次的催產(chǎn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，挑選了腹部膨大、柔軟有彈性，生殖孔紅潤(rùn)的雌魚作為催產(chǎn)組，采用和第三批次的實(shí)驗(yàn)組近似的注射劑量，取得了不錯(cuò)的催產(chǎn)效果，催產(chǎn)率達(dá)到了66.7%，催產(chǎn)組與對(duì)照組相比差異顯著.這可能與本批次催產(chǎn)時(shí)機(jī)合適有關(guān).目前，催產(chǎn)時(shí)機(jī)都是以雌魚腹部柔軟膨大、生殖孔紅腫等主觀判斷，影響因素較多，增加了生產(chǎn)上的難度.

本研究中有個(gè)明顯的特點(diǎn)就是首次對(duì)泰山螭霖魚進(jìn)行全人工繁殖試驗(yàn)，這在螭霖魚人工繁殖研究中還是首次.經(jīng)過(guò)人工注射催產(chǎn)、人工擠卵、人工授精、人工孵化等階段，成功孵化出1000余尾仔魚.本研究中受精率高(72%－95%)，魚卵破膜時(shí)間較短(＜3d)，破膜率較高(50%－82%)，但破膜仔魚畸形較多，如歪尾、曲背、卵黃囊腫大等，畸形仔魚絕大多數(shù)均陸續(xù)夭折，導(dǎo)致整體出苗率很低(10%左右).造成這種現(xiàn)象的原因有兩點(diǎn):一是人工擠卵最佳時(shí)機(jī)較難掌握，擠出的卵子有時(shí)不夠成熟或過(guò)熟，即使精卵能受精，胚胎的畸形率和死亡率也較高，進(jìn)而影響出苗率.二是螭霖魚胚后期很長(zhǎng)，從破膜到仔魚平游仍需7－8天.而出膜后，雖屬胚后階段，但剛出膜的仔魚發(fā)育很不完善，無(wú)胸鰭保持平衡，無(wú)鰾不能上下沉浮，眼睛無(wú)色素不能感光，腸道未通，不能攝食.它全身裸露在水中，做拋石式扭動(dòng)，對(duì)溶氧需求驟然增加，它們對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力最差，導(dǎo)致本研究中出苗率低.所以，螭霖魚苗破膜后采用何種孵化方式培育就顯得尤為重要.

本研究結(jié)果表明，催產(chǎn)激素的注射可提高雌雄親魚體內(nèi)促性腺激素(GtH)的水平.GtH的分泌受到下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)和多巴胺的雙重調(diào)節(jié)，排卵和產(chǎn)卵也是以血清GtH的急劇升高為先導(dǎo)的，而最終能否排卵還有賴于血清GtH峰是否超過(guò)“排卵閾值”［11］.盡管注射催產(chǎn)激素后的螭霖魚雌魚血清GtH水平也有大幅提高，但仍低于雌魚，也沒(méi)有實(shí)現(xiàn)自然產(chǎn)卵，可能因?yàn)榇启~血清GtH峰未達(dá)到“排卵閾值”.對(duì)螭霖魚來(lái)說(shuō)，繁殖困難在于雌魚性腺發(fā)育成熟并成功產(chǎn)卵，因?yàn)樾埕~性腺發(fā)育成熟早且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，這種情況在硬骨魚類中具有一定的普遍性.盡管第五、六批次注射激素并未實(shí)現(xiàn)螭霖魚的自然繁殖，但這與注射時(shí)間過(guò)晚，雌雄魚性腺均已退化有關(guān).本研究說(shuō)明適量的催產(chǎn)劑及催產(chǎn)時(shí)機(jī)可實(shí)現(xiàn)螭霖魚的全人工催產(chǎn)繁殖.

［1］陳紅菊，姜運(yùn)良，宋憬愚，等.泰山赤鱗魚胚胎發(fā)育的研究［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2008，32(6):926－933.

［2］張安才，陳紅菊，鄒蘭柱，等.泰山赤鱗魚肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià)［J］.齊魯漁業(yè)，2010，27(9):1－3.

［3］張安才.泰山赤鱗魚的生物學(xué)及人工養(yǎng)殖技術(shù)［J］.齊魯漁業(yè)，2005，22(8):31－32.

［4］張玉杰，郭冰，田江，等.黃顙魚高效人工繁殖技術(shù)［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2011(3):31－33.

［5］胡廷尖，儲(chǔ)張杰，王雨辰，等.泥鰍規(guī)?；斯ご弋a(chǎn)與孵化的研究［J］.浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，31(1):12－17.

［6］劉傳忠，邱鵬，孫劍，等.泰山赤鱗魚繁殖與苗種培育［J］.淡水漁業(yè)，2005，35(6):55－56.

［7］劉永進(jìn)，劉會(huì)，張安才，等.泰山螭霖魚繁育養(yǎng)殖技術(shù)研究［J］.水利漁業(yè)，2005(1):32－35.

［8］朱桂玉，盧繼承，袁娜，等.魚類常用催產(chǎn)劑對(duì)泰山赤鱗魚的催產(chǎn)效果［J］.泰山學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31(6):99－102.

［9］王武.魚類增養(yǎng)殖學(xué)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［10］江林源，梁萬(wàn)文，黃光華，等.倒刺鲃的人工繁殖技術(shù)研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，19(6):1172－1175.

［11］王德壽，林浩然.誘導(dǎo)大鰭鳠和長(zhǎng)吻鮠排卵過(guò)程中血清G T H水平的變化［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2001，23(2):185－189.

A Preliminary Study on the Technology of Artificial Reproduction of Varicorhinus Macrolepis

LIN Zhen－xian，GAN Qing－meng，ZHANG Cong
(School of Biology and Brewing Engineering，Taishan University，Tai＇an，271000，China)

The aim of the present study is to find the controlling factors of the artificial inducement reproduction of varicorhinusmacrolepis.Different types and doses of oxytocin were injected into the parents of varicorhinusmacrolepis for artificial inducement reproduction，and concentrations of gonadotropin(GtH)in male and female parent fish were measured before and after the injection of oxytocin.Results showed that the highest spawning rate group was which was injected with 25IU Human Chorionic Gonadotropin(HCG)+0.4μg Luteinizing Hormone Releasing Hormone－A2(LHRH－A2)+0.2mg Domperidone(DOM)，and the spawning rate reached 66.7%，which was significantly higher than the control group.After waiting for about 12 hours，eggs were squeezed and inseminated artificially，and then the fry was hatched successfully.Secondly，the effect of oxytocin was associated with the development level of the parent fish.Finally，the injection of oxytocin could improve the level of gonadotropin(GtH)in male and female parent fish.

varicorhinusmacrolepis;artificial inducement reproduction;gonadotropin(GtH)

S961.2

A

1672－2590(2015)06－0094－05

2015－10－11

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410453011)

林貞賢(1979－)，男，山東新泰人，泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院講師.