賴金龍，付倩，任莎，吳國，陶宗婭,*，張紅，羅學剛

1.四川師范大學生命科學學院，成都 610101 2.西南科技大學 教育部生物質(zhì)材料教育部工程研究中心，綿陽 621010

檢測細胞DNA斷裂損傷效應(yīng)的彗星實驗法的改良

賴金龍1，付倩1，任莎1，吳國1，陶宗婭1,*，張紅1，羅學剛2

1.四川師范大學生命科學學院，成都 610101 2.西南科技大學 教育部生物質(zhì)材料教育部工程研究中心，綿陽 621010

為了解決彗星實驗過程中常出現(xiàn)的脫膠、細胞核分離操作繁瑣、重復性低等問題，對彗星實驗方法進行了改良，初步建立了彗星實驗的快速操作流程。結(jié)果顯示，通過對載玻片進行預(yù)處理，可確保凝膠懸掛均勻；采用改良機械法分離的細胞核濃度適中；以0.5%(w/v)涂層瓊脂糖作為基層、以1.5%(w/v)低熔點包埋瓊脂糖作為疊加層的“雙層凝膠法”，輔以“推片法”鋪膠，操作便捷且不發(fā)生脫膠現(xiàn)象；細胞核膜經(jīng)裂解處理后再進行電泳和熒光觀察，彗星圖像清晰，雜質(zhì)少。應(yīng)用改良后的彗星實驗方法，操作簡便，耗時更短，實驗效果良好，可快速檢測出細胞DNA損傷效應(yīng)。

銫；蠶豆根尖細胞；遺傳毒性；DNA損傷；彗星實驗；改良

彗星實驗(comet assay)也稱單細胞凝膠電泳實驗(single cell gel electrophoresis,SCGE)，是一種操作簡單、有效評估細胞DNA損傷的方法[1]。其原理是器官或組織細胞受外源因素(如輻射、重金屬等)影響，細胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂，經(jīng)裂解后，DNA解旋，在電場作用下，DNA斷片遷移出細胞核，形成彗星狀的電泳圖譜；而正常細胞的大分子量DNA在電場作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜[2]。根據(jù)電泳緩沖液的pH不同，可分為中性彗星實驗(pH=8.4)和堿性彗星實驗(pH>13)，前者主要用于檢測DNA雙鏈的斷裂損傷，而后者則具有更高的靈敏性，可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷[3-5]。目前，彗星實驗技術(shù)已廣泛用于環(huán)境毒理學、生物監(jiān)測、輻射生物學等領(lǐng)域[6-10]。

但彗星實驗的靈敏度和結(jié)果的重復性易受低熔點瓊脂糖濃度、裂解時間、電泳緩沖液組分、電泳條件等較多因素的影響；常用的“三明治”型的包埋法操作繁瑣、易脫膠[11]，機械法分離細胞核的效果不佳等因素[12]，限制了此法的廣泛應(yīng)用。因此，建立一套快速、簡單的實驗流程尤為重要。本研究室通過對彗星實驗方法的改良，已建立一套成熟的彗星實驗流程，解決了長期存在的脫膠、機械法分離細胞核效果差、重復性低等問題，可快速檢測出DNA的損傷效應(yīng)。本文選用對環(huán)境污染物較為敏感的蠶豆為試材，以銫(133Cs+)為外源處理因子，以“中性彗星實驗”為例，詳細介紹實驗操作流程、比較改良前后的檢測效果及數(shù)據(jù)處理方法，為應(yīng)用彗星實驗檢測細胞DNA損傷提供方法學指導。

1 試劑與儀器設(shè)備(Reagent and equipment required)

1.1 儀器設(shè)備

玻璃培養(yǎng)皿；冰盤；冰盒；1～10 μL，10～100 μL，100～1 000 μL移液器和槍頭；1.5 μL扣蓋離心管；解剖刀；脫色搖床(KB-900，海門其林貝爾)；尼龍布(孔徑200 μm)；5 mL注射器；天平(精度0.001 g)；微波爐(EG823LA3-NR，美的微波電器制造有限公司，佛山)；恒溫水浴鍋(HWS26型，上海百典儀器設(shè)備有限公司)；載玻片(帶磨砂邊)；蓋玻片；水平電泳槽(DYCP 31DN型，北京六一儀器廠)；穩(wěn)壓電泳儀(DYY-6C型，北京六一儀器廠)；計時器；徠卡正置熒光顯微鏡(DM3000，德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)：100～400倍，藍色激發(fā)光波長460～485 nm。

1.2 試劑準備

去離子水(ddH2O)；重鉻酸鉀洗液：稱取重鉻酸鉀20 g，置500 mL燒杯中加入40 mL蒸餾水，加熱溶解，冷卻后，緩慢加入360 mL濃硫酸，攪勻，冷卻后，裝入棕色瓶中待用；甲醇；0.2 mmol·L-1磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)，4 ℃預(yù)冷；涂層瓊脂糖溶液(0.5%,w/v)：稱取250 mg常熔點瓊脂糖，加入50 mL ddH2O，微波加熱溶解，倒入50 mL離心管中，45 ℃水浴待用；包埋凝膠溶液(1.5%,w/v)：150 mg低熔點瓊脂糖加入10 mL PBS緩沖液中，微波加熱溶解，45 ℃水浴待用(經(jīng)過多次實驗篩選，該濃度的包埋凝膠不脫落)；5TBE (Tris-硼酸，pH 8.4)濃儲存液(滅菌待用)；電泳緩沖液(0.5TBE)：量取100 mL TBE濃儲存液，用ddH2O定容至1 000 mL，待用；SDS裂解緩沖液(2.5%,w/v，現(xiàn)配現(xiàn)用)：稱取25 g十二烷基磺酸鈉(SDS)用電泳緩沖液溶解后，定容至1 000 mL，混勻備用；吖啶橙染色溶液(5 μg·mL-1)：吸取250 μL 100 μg·mL-1吖啶橙貯備液，用PBS緩沖液稀釋至5 mL，避光保存。以上所用試劑均為分析純，購自Sigma公司。

2 實驗流程(The testing flow)

2.1 試材及其處理

蠶豆品種為“成胡一號”(Vicia faba L.)，購自成都市種子市場。目前我國土壤中Cs+的背景值為8.24 mg·kg-1[13]，因此對照組濃度為8.24 mg·L-1(CK)；再根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇損傷效應(yīng)較為明顯的Cs+處理液濃度[ρ(Cs+)]100 mg·L-1和200 mg·L-1作為實驗組，溶液配制均用1/6改良霍格蘭營養(yǎng)液。

種子經(jīng)消毒、浸種，適溫下萌發(fā)至胚根1 cm左右[14]。選擇胚根長度一致的蠶豆放入墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，分組編號，每組分別添加Cs+處理液10 mL。培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)48 h后，選取蠶豆根尖進行彗星實驗，其操作步驟依據(jù)中華人民共和國國家標準《GB/T 23748—2009 輻照食品的鑒定DNA彗星試驗法篩選法》[2]，并對其操作流程進行改良和實驗條件的優(yōu)化。

2.2 載玻片涂膠預(yù)處理

選取一端帶有磨砂的載玻片，置于重鉻酸鉀洗液中，浸泡至少30 min后，取出，用自來水沖洗，蒸餾水沖洗，晾干后置于甲醇中保存。取1張潔凈的載玻片直接放入裝有50 mL涂層瓊脂糖溶液中(45 ℃)，停留5～10 s，取出，觀察載玻片表面凝膠是否懸掛均勻，垂直晾干，備用，可保存1周。

2.3 植物組織細胞核懸液的制備

選取處理后的蠶豆根尖6個，置于冰盤上的培養(yǎng)皿中，加入1 mL預(yù)冷的PBS緩沖液，用解剖刀快速切成薄片，將緩沖液和組織薄片轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，放入冰盒內(nèi)(避光)，脫色搖床220 r·min-1震蕩10 min。

將離心管中的細胞核懸液及組織薄片全部轉(zhuǎn)移到墊有尼龍布圓片(孔徑200 μm)的注射器中，推動活塞，過濾至1.5 mL離心管中，置冰盒內(nèi)保存待用。

2.4 細胞核的包埋

將細胞核懸液與包埋凝膠溶液以1∶3的比例混合(如：取150 μL細胞核懸液，加入450 μL包埋凝膠溶液快速混勻)，置45 ℃水浴保溫，用槍頭吸取100 μL混合液滴于已涂膠的載玻片上，用潔凈蓋玻片推片，將混合液鋪平，置冰盤上冷卻。

2.5 核膜裂解及電泳

將已包埋細胞核的載玻片放入培養(yǎng)皿中，倒入適量的SDS裂解緩沖液(2.5%,w/v)，裂解30 min，使核膜溶解。裂解后，將載玻片并排放入水平電泳槽中，加入電泳緩沖液(0.5TBE)，穩(wěn)壓10 V，電泳15 min(此條件下易于觀察到細胞凋亡現(xiàn)象)。

2.6 染色與熒光觀察

取出電泳后的載玻片，置于染色培養(yǎng)皿中，每一張載玻片滴加100 μL吖啶橙染色溶液(5 μg·mL-1)，避光染色5 min。染色完成后，流水沖洗多余染液后，放入蒸餾水中保濕(可保存5～6 h)，避光待用。

熒光觀察：取出已染色的載玻片，吸去多余水分，置于熒光顯微鏡(物鏡10～40倍，460 ～485 nm的藍色激發(fā)光)下觀察，采集圖像數(shù)據(jù)并保存，圖片格式為TIFF。

3 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析(Data processing and results analysis)

細胞中的DNA與吖啶橙結(jié)合后，在藍色激發(fā)光(460～485 nm)下發(fā)出綠色熒光。正常細胞的DNA未受到損傷，核膜裂解后，主要以超螺旋形式存在，在電流作用下，DNA大分子移動距離較短，熒光集中在細胞核(包括大分子量DNA)；隨著細胞中DNA損傷加劇，DNA出現(xiàn)斷裂，在電流作用下，斷片(構(gòu)成彗星尾部)遷移出細胞核(構(gòu)成彗星頭部)，其遷移距離和彗星尾部DNA含量即可表示DNA的損傷程度[15]。本研究表明，若不經(jīng)過核膜裂解而直接電泳，DNA斷片無法遷移出細胞核(圖1“a”)，裂解30 min后，則明顯觀察到彗星圖像(圖1“b”)。

彗星分析軟件(comet assay software project,CASP)可將圖像轉(zhuǎn)化為彗星常用統(tǒng)計量(圖1“c”)，其中彗星尾長(tail length of comet,TL)在一定程度上反映了DNA損傷程度和DNA斷裂片斷的大小；彗尾DNA比例 (percent DNA in the tail,TD)表示隨DNA損傷加重，尾部DNA含量遞增，頭部DNA含量遞減，則尾部DNA含量比例增加；彗星尾距(tail moment,TM)表示尾部DNA含量和彗尾長度的乘積，是衡量DNA損傷的基本參數(shù)[16-17]。

采集樣本數(shù)據(jù)后，通過“3D Bars”圖顯示各樣本詳細數(shù)據(jù)(圖2 A1,B1,C1)，可見，隨Cs+處理濃度增加，樣本中受損傷的細胞數(shù)及損傷程度均明顯增加。通過“箱圖”進行統(tǒng)計(圖2 A2,B2,C2)，結(jié)果顯示，隨Cs+處理濃度增加，TL、TD和TM均呈上升趨勢。進行方差分析時為了避免犯“第二類錯誤”(即處理間實際存在顯著差異而未能檢驗出)，因此選用LSD法進行均值多重比較。表1可見，與CK比較，當r(Cs+)為200 mg·L-1時，TL、TD和TM均顯著增加(P<0.05)，表明蠶豆胚根DNA受到顯著的損傷。

4 討論(Discussion)

應(yīng)用彗星實驗在單細胞水平上檢測細胞的DNA損傷程度，簡單有效。但常規(guī)操作較為繁瑣，常出現(xiàn)涂膠不均勻、脫膠、細胞核懸液濃度不合適、重復性較差等問題。本研究通過多次實驗，發(fā)現(xiàn)導致涂膠不均勻的原因主要是載玻片不干凈或有油脂，采用重鉻酸鉀洗液和甲醇依次浸泡載玻片后，晾干，再涂層瓊脂糖溶液，較好地克服了涂膠不均勻的問題，且可回收利用載玻片，避免了以往一次性使用載玻片造成的浪費。

目前較常用的植物細胞核的提取方法主要是酶解分離法和機械分離法[12]，其中酶解分離法成本較高，時間較長，操作復雜；機械分離法通過切片、機械震蕩可快速分離得到適宜濃度的細胞核懸液，操作方便。本研究顯示，細胞核的提取濃度主要受搖床轉(zhuǎn)速和震蕩時間的影響，經(jīng)改進，選用轉(zhuǎn)速220 r·min-1，震蕩10 min，可獲得以蠶豆為試材時適宜濃度的細胞核懸浮液。對于其他實驗材料，若細胞核濃度較低，可適當增加根尖量；同時，應(yīng)根據(jù)實驗材料選擇適宜孔徑的尼龍布，避免因尼龍布孔徑太大，濾液雜質(zhì)太多，影響觀察。

本研究表明，包埋凝膠的脫膠問題主要與低熔點瓊脂糖濃度和細胞包埋的方法有關(guān)，若采用常規(guī)的“三明治”法進行細胞包埋，凝固后需移去蓋玻片片[18]，極易造成脫膠。經(jīng)改良后，以0.5%(w/v)涂層瓊脂糖作為基層，以1.5%(w/v)包埋凝膠作為疊加層，同時用“推片法”鋪展疊加層，這種“雙層凝膠法”操作方便，不需移去蓋玻片等步驟，較好地解決了脫膠問題。

圖1 不同濃度Cs+對蠶豆根尖細胞DNA損傷的彗星實驗結(jié)果及細胞核膜裂解處理對彗星實驗結(jié)果影響的比較

表1 不同濃度Cs+對蠶豆胚根細胞DNA損傷的彗星評價Table 1 The score analysis of the comet assay for the DNA damage in the radicle cells of Vicia faba treated by Cs+ in different concentrations

注：采用LSD法進行多重比較，同一列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters in a column means significant difference at the 5 % level.

圖2 用"3D Bars"圖(A1、B1、C1)和"箱圖"(A2、B2、C2)描述不同濃度Cs+對蠶豆根尖DNA的損傷程度

本研究顯示，細胞核膜的完整性對實驗結(jié)果有顯著的影響，未經(jīng)細胞核膜的裂解處理過程，細胞核中的DNA斷片無法遷移出細胞核，導致“假陰性”結(jié)果。因此，核膜裂解步驟不可省略。

由于彗星實驗結(jié)果受電泳條件(如：電泳緩沖液、電壓大小、電泳時間等)的影響，為了避免因電泳條件不同而形成“假陽性”結(jié)果，應(yīng)嚴格保持電泳條件一致。若采用彗星實驗法檢測細胞凋亡現(xiàn)象，建議選用低電壓(10 V)，電泳15 min。

與國家標準方法(GB/T 23748—2009)比較，本研究在實驗環(huán)節(jié)、實驗條件及耗時等5個方面進行了較好的改進和優(yōu)化(表2)。

由于細胞個體存在差異，彗星實驗各指標(TL、TD、TM)受極值的影響較大，導致標準偏差較大，若采用均值表示結(jié)果會導致量化意義降低[19]。因此，彗星實驗的統(tǒng)計分析建議采用SPSS 軟件的Explore統(tǒng)計過程和頻數(shù)分布功能，并使用Origin軟件繪制“3D Bars”圖和“箱圖”，用于顯示樣本數(shù)據(jù)的分布情況和樣本處理間差異性的比較。

綜上所述，通過對彗星實驗方法的改進和優(yōu)化，建立了簡單、快速的彗星實驗流程(圖3)。

表2 彗星實驗技術(shù)改良前后實驗效果比較Table 2 Comparison between the improved comet assay and the standard method

圖3 快速檢測細胞DNA斷裂損傷效應(yīng)的彗星實驗法實驗流程

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◆

Improvements of the Comet Assay for Rapid Detecting the Rupture and Damage of DNA in Cells

Lai Jinlong1,Fu Qian1,Ren Sha1,Wu Guo1,Tao Zongya1,*,Zhang Hong1,Luo Xuegang2

1.Life Science College,Sichuan Normal University,Chengdu 610101,China 2.Engineering Research Center of Biomass Materials,Ministry of Education,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China

25 November 2014 accepted 30 December 2014

The comet assay or single cell gel electrophoresis assay (SCGE) provides a simple and effective method for evaluating DNA damage in cells.The method is based on the capability with which the denatured and cleaved DNA fragments migrated out of the nucleoid under the effects of external electric field,whereas undamaged DNA migrated slower and remained mainly in the nucleoid under the same condition.Degree of DNA damage could be assessed by evaluating the tail length of comet (TL),the percent DNA in the tail (TD) and the tail moment (TM) of the DNA “comet” which were built upon the DNA fragments.Although the details and the technique process of the method has been improved recently,there are many problems and difficulties which still remain unresolved,such as the agarose gel debonding,very complex results of the nucleus separation,low repeatability of experimental results and non-standardized technique process of the method,and etc.In view of the above problems,the technical details of the quick process method have been improved in the research.The results showed that it was ensured that the agarose gel was distributed uniformly on the slides through the pretreatment of slide; the nucleus concentration were appropriate which were collected by the improved mechanical separation method; the problem of agarose gel debonding were better solved by the way of double gel layer in which 0.5% (weight in volume,w/v) agarose was used as the basal layer and the low metling agarose of 1.5 % (w/v) used as the overlay,and agarose gel laid slowly with coverslip.It is indicated that the clear picture and fewer impurity could be presented by the improved comet assay and the method is a simple and rapid for analysis degree of DNA damage.

Cs; radicle cells; Vicia faba; genotoxicity; DNA damage; the comet assay; improved

國家核設(shè)施退役及放射性廢物治理科研重點項目(14ZG6101)；四川省教育廳重點課題(14ZA0030)；四川省生物質(zhì)改性材料工程

賴金龍(1991-)，男，碩士生，研究方向為生態(tài)毒理學，E-mail: 599101592@qq.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: t89807596@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141125001

2014-11-25 錄用日期：2014-12-30

1673-5897(2015)4-195-08

Q331

A

陶宗婭(1957-)，女，博士，教授，研究方向為植物逆境生物化學與分子生物學。

技術(shù)研究中心(西南科技大學)開放課題(12zxbk03)；四川師范大學校級青年課題(14qn07)；四川師范大學實驗技術(shù)課題(SYJS2014-14)

賴金龍，付倩，任莎,等.檢測細胞DNA斷裂損傷效應(yīng)的彗星實驗法的改良[J].生態(tài)毒理學報，2015,10(4): 195-202

Lai J L,Fu Q,Ren S,et al.Improvements of the comet assay for rapid detecting the rupture and damage of DNA in cells [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 195-202 (in Chinese)