呂梅，宦欣，李芊蔚，王硯硯

論著·臨床

血漿和組織miR-124表達(dá)與大腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析

呂梅，宦欣，李芊蔚，王硯硯

目的 分析血漿和組織中miR-124表達(dá)水平與大腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性。方法 收集大腸癌患者71例，其中無法切除患者49例、完全切除患者22例，收集其血漿和腫瘤組織樣本。檢測腫瘤無法切除患者血漿和組織中miR-101、miR-124、miR-126、miR-210、miR-217的表達(dá)，通過實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (qRT-PCR)分析miR-124表達(dá)和患者及無進(jìn)展生存期(PFS)的相關(guān)性。結(jié)果 qRT-PCR檢測無法切除大腸癌患者血漿和組織中miRNAs表達(dá)，其中高表達(dá)的miR-124變化最顯著(分別為P<0.05，P<0.01)，其他miRNAs無明顯變化。血漿中miR-124與患者OS相關(guān)：在無法切除大腸癌患者血漿、組織中高表達(dá)miR-124與OS呈正相關(guān)(血漿:OR=0.451, 95% CI 0.189～0.654,P=0.002；組織：OR=0.295, 95% CI 0.493～1.374,P=0.037)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估：采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估發(fā)現(xiàn)血漿中高表達(dá)miR-124與PFS相關(guān)(OR=0.147，P=0.022)；而組織中高表達(dá)miR-124與PFS無相關(guān)性(OR=0.281，P=0.057)，血漿和組織中低表達(dá)miR-124與低死亡風(fēng)險(xiǎn)比無相關(guān)性(OR=2.07，P=0.163)。高miR-124表達(dá)同PFS無相關(guān)性(OR=1.85，P=0.725)。結(jié)論 血漿中miR-124表達(dá)可以作為評價(jià)大腸癌預(yù)后的生物標(biāo)記物。

大腸癌；miR-124；總生存期;相關(guān)性

大腸癌是世界范圍內(nèi)病死率最高的疾病之一。盡管隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，早期診斷和先進(jìn)的治療方法不斷應(yīng)用到臨床治療上，但是許多大腸癌患者仍然是不能治愈的[1，2]。microRNAs(miRNAs)是一類由20～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，其典型特征是具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。miRNAs家族一般通過與特定mRNA 3’UTR(3’-untranslated regions)的不完全或完全互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶mRNA的翻譯或促使其降解，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝、激素分泌及個(gè)體發(fā)育等幾乎所有已知的生物學(xué)過程[3，4]，因而，miRNAs在腫瘤中既可以促進(jìn)癌細(xì)胞的生長，也可以抑制癌細(xì)胞的生長。體液中能檢測到miRNAs，包括血清、血漿、唾液等。雖然miRNAs是不穩(wěn)定的RNA分子，但是血液中miRNAs相對比較穩(wěn)定而且在血液中容易檢測[5，6]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，癌癥相關(guān)miRNAs被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)評價(jià)miR-124與大腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性，有助于了解大腸癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年9月—2014年7月我院治療大腸癌患者71例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)糞便隱血試驗(yàn)陽性；(2)結(jié)腸鏡檢查及病理活檢確診；(3)X線鋇劑灌腸顯示大腸損傷[8]。所有患者無既往治療史，均接受常規(guī)的化學(xué)治療。有家族遺傳史15例，合并高血壓、糖尿病等其他疾病39例。71例患者中包括49例無法手術(shù)切除患者和22例腫瘤完全切除患者。大腸癌TNM分期中，無法切除患者49例均為IV期，且已有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移管狀腺癌44例；而完全切除患者22例中16例為II或III期，管狀腺癌19例。二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中性別、年齡、原發(fā)部位、組織學(xué)類型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。本試驗(yàn)得到了我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參加研究的大腸癌患者均簽署知情同意書。

表1 71例患者基線資料比較 (例)

1.2 標(biāo)本收集 血液標(biāo)本收集到EDTA管中，分離血漿貯存在-80°C。從病理科獲得所有患者福爾馬林固定石蠟包埋組織標(biāo)本。

1.3 RNA提取 總RNA從血漿和組織標(biāo)本中提取，采用mirVanaTM miRNA Isolation Kit(北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)進(jìn)行，方法如下：研磨的組織樣品30～100 mg或者血液200 μl,加300～1 000 μl裂解液，充分渦旋，置于冰上；加30～100 μl Homogenate Additive(上?？党缮锕こ逃邢薰?，充分渦旋，置冰上10 min；加300～1 000 μl酸性苯酚，渦旋30～60 min；10 000 g離心5 min。小心取出上層水樣，放入新的EP管，標(biāo)注移出液體的體積；加1.25倍體積(上層水樣體積)的乙醇，充分混勻；Wash buffer 1洗2次，Wash buffer 2洗1次，離心，棄濾液；濾筒入新的收集管，加100 μl預(yù)熱洗脫液，離心20～30 s，收集的濾液放-80℃保存。

1.4 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 20 μl反轉(zhuǎn)錄體系包括：含20～25 ng RNA樣品14 μl，4 μl 5×反應(yīng)buffer，2 μl 混合酶(上?？党缮锕こ逃邢薰?，在42℃水浴中反應(yīng)60 min，然后在95℃水浴中滅活反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)5 min。通過Mx3000PTM儀器(Agilent公司,美國)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)包括10 μl SYBR_ Green混合酶，LNA×miRNAs 引物混合物(上?？党缮锕こ逃邢薰?2 μl，稀釋的cDNA樣品2 μl，聚合酶激活/變性(95℃10 min)，40擴(kuò)增循環(huán)(95℃10 s和60℃ 60 s)。

應(yīng)用分析軟件以U6 RNA作為內(nèi)參照；通過檢測基因的Ct減去內(nèi)參U6 Ct得到每組的Ct，參照文獻(xiàn)[9]報(bào)道的方法，計(jì)算基因相對的表達(dá)。

1.5 觀測項(xiàng)目 應(yīng)用qRT-PCR檢測無法切除患者血漿和組織中miR-101、miR-124、miR-126、miR-210、miR-217；分析血漿中miR-124與患者OS、低風(fēng)險(xiǎn)比相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 miRNAs檢測 qRT-PCR檢測無法切除大腸癌患者血漿和組織中miRNAs表達(dá)，其中高表達(dá)的miR-124變化最顯著(分別為P<0.05，P<0.01)，其他miRNAs無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 49例大腸癌無法切除患者血漿和組織中miRNAs表達(dá)

注：與低表達(dá)組比較，aP<0.05，bP<0.01

2.2 相關(guān)分析 (1)血漿中miR-124與患者OS相關(guān)性：在無法切除大腸癌患者血漿、組織中高表達(dá)miR-124與OS呈正相關(guān)性(血漿:OR=0.451, 95% CI 0.189～0.654,P=0.002；組織：OR=0.295, 95% CI 0.493～1.374,P=0.037)(圖1，2)。(2) Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估：采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估發(fā)現(xiàn)血漿中高表達(dá)miR-124與PFS相關(guān)(OR=0.147，P=0.022)；而組織中高表達(dá)miR-124與PFS比無相關(guān)性(OR=0.281，P=0.057)(表3)，血漿和組織中低表達(dá)miR-124與低死亡風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性(OR=2.07，P=0.163)；高miR-124表達(dá)同PFS無相關(guān)性(OR=1.85，P=0.725)。

圖1 無法切除大腸癌患者血漿中高表達(dá)miR-124和低表達(dá)miR-124與總體生存期相關(guān)性

圖2 無法切除大腸癌患者組織中高表達(dá)miR-124和低表達(dá)miR-124與總體生存期相關(guān)性

3 討 論

大腸癌是一個(gè)多基因、多階段形成的復(fù)雜病變過程。如果能夠早期診斷以及監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)，就可以采取有效治療，對大腸癌預(yù)防有重大意義。近年來已發(fā)現(xiàn)許多miRNAs存在于大腸癌患者腫瘤組織和血液中[9，10]。miRNAs的表達(dá)和處理方式在人類惡性腫瘤表現(xiàn)出多方面變化，通過靶向作用于數(shù)百個(gè)靶蛋白，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[11]。這為提高大腸癌早期篩查、診斷和治療及預(yù)后的判斷提供了一個(gè)全新的視角。

表3 大腸癌患者血漿和組織中miR-124與生存期的關(guān)系

最近，許多基因芯片用于檢測大腸癌組織中miRNAs的表達(dá)變化情況。Diosdado等[12]使用qRT-PCR測定55例大腸癌患者和10例健康對照者組織中miR-17～92簇的表達(dá)水平及48例腫瘤組織中c-Myc mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了miR-18a外，其他檢測miRNAs均在大腸癌組織中表達(dá)增加，c-Myc和miR-17 -92簇表達(dá)明顯呈正相關(guān)。在本研究中，我們通過qRT-PCR檢測患者血漿和組織中miR-101、miR-124、miR-126、miR-210、miR-217表達(dá)變化，這些miRNAs與大腸癌的發(fā)病機(jī)制間關(guān)系未見相關(guān)報(bào)道。以往也有一些報(bào)道m(xù)iRNAs從癌細(xì)胞釋放到血液中。研究表明腫瘤源性miRNAs可以非常穩(wěn)定地存在于人類血液中(內(nèi)受內(nèi)源性核糖核酸酶的保護(hù))，且其表達(dá)水平臨床能夠檢測到，另外循環(huán)miRNAs與原發(fā)腫瘤生物學(xué)有潛在聯(lián)系[5]。目前已經(jīng)證實(shí)大腸癌中循環(huán)miRNAs表達(dá)失調(diào)，可能作為大腸癌早期診斷的標(biāo)志物[13]。Huang等[14]使用qRT-PCR檢測晚期大腸腫瘤患者及健康對照者血清中12個(gè)miRNAs的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)血清中miR-92a和miR-29a對晚期腫瘤具有重要的診斷價(jià)值。兩者在鑒別大腸癌和正常對照組時(shí)受試者工作特征曲線下面積分別為0.844和0.838，在早期診斷大腸癌時(shí)具有巨大的潛力。

關(guān)于miR-124在腫瘤中的作用，已有一些相關(guān)報(bào)道，如miR-124在胃癌組織中表達(dá)減少，在細(xì)胞水平上證實(shí)miR-124抵制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等[15～17]。Anwar等[18]報(bào)道m(xù)iR-124在非甲基化肝細(xì)胞癌中的表達(dá)高于甲基化標(biāo)本。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)miR-124下調(diào)與大腸癌患者預(yù)后差相關(guān)。在本研究中，患者血漿和組織中高表達(dá)miR-124與大腸癌患者預(yù)后有相關(guān)性，進(jìn)一步采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估血漿中高表達(dá)miR-124與低死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而組織中高表達(dá)miR-124與低死亡風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性。血漿中miR-124表達(dá)評價(jià)大腸癌預(yù)后更為準(zhǔn)確。

本研究具有一定的局限性：(1)研究對象樣本量較少，71例大腸癌患者中無法手術(shù)切除患者只有49例，下一步研究需要增大樣本例數(shù)；(2)本研究只選擇無法手術(shù)切除患者作為研究對象，而手術(shù)切除腫瘤患者血清和組織中miR-124表達(dá)以及與大腸癌患者預(yù)后關(guān)系也要進(jìn)一步研究；(3)miR-124在大腸癌中發(fā)揮作用的機(jī)制也不清楚，包括其作用的靶蛋白，其靶蛋白在組織和血液中的表達(dá)等。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者血漿和組織中miR-124表達(dá)增加，而且血漿中miR-124表達(dá)與大腸癌患者預(yù)后具有相關(guān)性。但目前的研究仍處于起始階段，miR-124功能仍需深入研究，才有可能應(yīng)用到臨床上。

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Expression levels of microRNA-124 in plasma and tissure correlated with prognosis in patients with colorectal cancer

LVMei,HUANXin,LIQianwei,WANGYanyan.DepartmentofGastroenterology,ZhongshanAffiliatedHospitalofDalianUniversity,LiaoningProvince,Dalian116001,China

Objective To analyze the correlation between plasma and tissue miR-124 expression and overall survival(OS) of patients with colorectal cancer.Methods Collected 71 cases of patients with colorectal cancer which cannot be removed (n=49), completely resected (n=22), collected the plasma and tumor tissue samples. Detected tumor unresectable tissue and plasma of miR-101, miR-124, miR-126, miR-210, miR-217’s expression, by quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) to analyze the correlation between miR-124 expression and the prognosis of the patients.Results qRT-PCR for detection of unresectable expression of miRNAs in plasma and tissue in patients with colorectal cancer, high expression of miR-124’s changes revealed as the most significant (P<0.05,P<0.01), and other miRNAs did not show significant changes. (1) Correlation between plasma miR-124 and patients’ OS: in unresectable colorectal cancer patients, plasma and tissue expression of miR-124 was positively correlated with the OS (OR=0.451, 95% CI 0.189 - 0.654,P=0.002;OR=0.295, 95% CI 0.493-13.74,P=0.037). (2) Cox proportional hazards models assessment: the Cox proportional hazards model evaluation revealed that the high expression of miR-124 in plasma were correlated with PFS (OR=0.147,P=0.022); and high expression of miR-124 in tissue had no correlation with PFS (OR=0.281,P=0.057), plasma and tissue low expression of miR-124 had no correlation with low mortality risk ratio (OR=2.07,P=0.163).High expression of miR-124 had no correlation with PFS (OR=1.85,P=0.725).Conclusion It demonstrated that the plasma miR-124 expressions could be used as biological markers for evaluating the prognosis of colorectal cancer.

Colorectal carcinoma; microRNA-124; Overall survival; Correlation

116001 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.11.008

2015-03-04)