楊麗，趙新蘭，唐卓，陳凱，秦愛平

論著·基礎(chǔ)

miR-25/TWIST1調(diào)控通路在成骨細(xì)胞礦化中的作用研究

楊麗，趙新蘭，唐卓，陳凱，秦愛平

目的 探究miR-25在成骨細(xì)胞分化過程中的作用及其作用機(jī)制。方法 β-甘油磷酸(β-glycerophosphate，β-GP)和抗壞血酸(ascorbic acid)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞礦化，茜素紅(Alizarin Red S)染色實(shí)驗(yàn)觀察成骨細(xì)胞的礦化情況。生物信息學(xué)運(yùn)算預(yù)測(cè)miR-25的靶基因。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)miR-25以及其他相關(guān)基因的表達(dá)。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和抑制實(shí)驗(yàn)用于研究miR-25在成骨細(xì)胞分化中的作用及其與靶基因之間的相互關(guān)系。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-25與其靶基因之間的結(jié)合。結(jié)果 miR-25的表達(dá)隨成骨分化過程而逐漸升高。過表達(dá)miR-25通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其靶基因TWIST1的表達(dá)來促進(jìn)成骨分化。作為調(diào)控成骨細(xì)胞分化的的轉(zhuǎn)錄因子，扭曲基礎(chǔ)螺旋—環(huán)—螺旋蛋白1(TWIST1)是miR-25的靶基因。結(jié)論 miR-125通過作用于靶基因 TWIST1在成骨細(xì)胞的分化中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，表明調(diào)控miR-25的表達(dá),可能成為骨代謝疾病新的治療靶點(diǎn)。

microRNA; 成骨細(xì)胞分化; 轉(zhuǎn)錄因子；靶基因

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性形成了骨重建和骨吸收，二者間的動(dòng)態(tài)平衡維持了骨量的相對(duì)穩(wěn)定。成骨細(xì)胞是由原始成骨細(xì)胞分化成熟而來的骨形成細(xì)胞。多種骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松癥或骨形態(tài)、骨結(jié)構(gòu)和骨功能的病理狀態(tài)與成骨細(xì)胞的礦化異常密切相關(guān)[1]。成骨細(xì)胞的礦化過程牽涉了成骨細(xì)胞與其他細(xì)胞間的相互作用，而這一相互作用過程是受到多個(gè)細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜過程[2]。miRNA可與靶mRNAs的3’非翻譯區(qū)(3’UTRs)或編碼區(qū)序列(CDS)以不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合后[3]，通過抑制其翻譯或促使mRNA分子降解的方式參與調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。

最近有關(guān)miRNAs和骨代謝的研究逐漸被人們所重視。然而miR-25在成骨細(xì)胞礦化過程中的作用及其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究分析miR-25在成骨細(xì)胞分化中的表達(dá)模式并揭示miR-25在β-甘油磷酸鈉(β-GP) + 抗壞血酸(ascorbic acid ,AA)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化過程中的調(diào)控作用及其機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞：新生小鼠乳鼠顱骨的成骨細(xì)胞。(2)主要儀器：Nikon 300型自動(dòng)攝像倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，電泳儀、轉(zhuǎn)印儀、紫外交聯(lián)儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio．Rad公司)，流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司)。(3)主要試劑：無酚紅α-MEM培養(yǎng)液、Trizol以及胎牛血清(FBS)(美國Gibico公司)，0．25%胰酶-EDTA、膠原酶(美國Gibico公司)，β-GP(美國Invitrogen公司)，AA(美國Sigma公司)，茜素紅染色試劑盒(美國Sigma公司), anti-miR-25(GenePharma Co., Ltd),扭曲基礎(chǔ)螺旋—環(huán)—螺旋蛋白1(TWIST1) siRNA(OriGene Technologies Inc)。

1.2 方法

1.2.1 原始成骨細(xì)胞的培養(yǎng)：遵照南華大學(xué)附屬湖南省老年醫(yī)院倫理委員會(huì)議程用手術(shù)、酶消化法分離新生小鼠乳鼠顱骨的成骨細(xì)胞。含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液吹打均勻后接種于培養(yǎng)皿中，37°C, 5% CO2培養(yǎng)，每2～3天換液1次，至細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)皿底時(shí)以0.25%胰酶消化傳代。 使用誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含50 mg/L AA、10 mmol/L β-GP)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞礦化。茜素紅染色法鑒定成骨細(xì)胞礦化成熟，并檢測(cè)TWIST1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。

在AA和β-GP誘導(dǎo)成骨細(xì)胞(OBs)分化的第0天、7天、14天和21天分別用Western Blot法、PCR法檢測(cè)TWIST1蛋白表達(dá)水平和miR-25的表達(dá)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR分析：利用羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，方法按參考文獻(xiàn)[5]。miR-25和TWIST1分別以 U6和β-actin作為內(nèi)參，其引物見表1、2。

表1 microRNA實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

表2 mRNA實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

1.2.3 茜素紅染色：茜素紅染色陽性的礦化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞分化、礦化和功能的標(biāo)志。其步驟如下：培養(yǎng)皿用PBS洗2次，70%乙醇固定1 h，PBS洗5遍。調(diào)至pH 4.2, 1%茜素紅染色30 min，加入50%乙醇去除非特異性著色，空氣干燥。隨后倒置顯微鏡下以200倍數(shù)觀察茜素紅染色陽性的礦化結(jié)節(jié)。茜素紅定量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[6]的方法：加入氯化十六烷基置室溫下30 min。吸取上清，使用紫外分光光度計(jì)，波長540 nm處測(cè)樣本吸光值A(chǔ)，用氯化十六烷基溶液調(diào)零，茜素紅量用ng/mg蛋白表示。每個(gè)視野計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 miR-25靶基因預(yù)測(cè)：應(yīng)用TargetScan軟件預(yù)測(cè)并使用RNA22-HSA進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：質(zhì)粒構(gòu)建方法按參考文獻(xiàn)[7]，構(gòu)建包含所預(yù)測(cè)miR-25結(jié)合位點(diǎn)的WT-pGL3-TWIST1-3′UTR。引物如下，F(xiàn)：5′-GGCTCTAGAGTCACCTCAGCGGCCATTC-3′R：5′-GGCCGGCCCCGACAGCCAGTCAAAGA-3′。MUT-pGL3-TRAF6-3′UTR.突變引物如下，F(xiàn)：5′-GACAGCCTTTCCTACTACCAT-3′R：5′-CTTATTCCGTTCCCTTCG-3′

購買miR-25特異性抑制劑2′-O-甲基反義寡核苷酸(anti-miR-25),脂質(zhì)體和miR-25抑制劑復(fù)合體嚴(yán)格按說明書直接和細(xì)胞混合。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：外周血單核細(xì)胞與野生型或突變型 pGL3-TWIST1-3′UTR和miR-25或 miR-C共培養(yǎng)48 h。空脂質(zhì)體作為陰性對(duì)照。

雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)(Promega)和光度計(jì)用以熒光信號(hào)定量。每個(gè)熒光素酶值通過海腎熒光素酶值進(jìn)行校正。

2 結(jié) 果

2.1 miR-25與TWIST1表達(dá)水平的變化 TWIST1在成骨細(xì)胞礦化的表達(dá)隨時(shí)間呈逐步下降趨勢(shì)。在礦化的關(guān)鍵時(shí)間段14～21 d持續(xù)處于較低表達(dá)水平。miR-25表達(dá)在成骨細(xì)胞分化過程中逐漸上升，在第0～21 d隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延續(xù)逐漸上升。結(jié)果表明miR-25的表達(dá)在成骨細(xì)胞分化過程中呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，而TWIST1在成骨細(xì)胞礦化的表達(dá)呈逐步下降趨勢(shì)，提示miR-25可能在成骨細(xì)胞分化過程中起到了重要的調(diào)控作用，且該作用可能與TWIST1相關(guān)。見圖1。

2.2 miR-25對(duì)β-GP和AA誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化的影響 與轉(zhuǎn)染miR-C的對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染pre-miR-25組的茜素紅定量升高約2倍 (P<0.05)，表明過表達(dá)miR-25促進(jìn)了OBs的分化成熟。見圖2。

注：A.TWIST1的表達(dá)呈逐步下降趨勢(shì)，在礦化的關(guān)鍵時(shí)間段14～21 d持續(xù)處于較低表達(dá)水平。B.miR-25的表達(dá)呈逐步上升趨勢(shì)，在礦化的關(guān)鍵時(shí)間段14～21 d持續(xù)處于較高表達(dá)水平

注：Pre-miR-25與對(duì)照質(zhì)粒(pre-miR-C)分別轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，加入50 mg/l抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，行茜素紅染色。與對(duì)照組比較，aP<0.05

2.3 miR-25對(duì)TWIST1的作用 利用TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-25的靶基因。在TWIST1的3′UTR區(qū)存在miR-25的堿基互補(bǔ)序列(圖3A)。 將miR-25表達(dá)載體(pre-miR-25)轉(zhuǎn)染至OBs并用β-GP 和AA誘導(dǎo)其分化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-25表達(dá)載體組的miR-25的表達(dá)明顯升高至2倍。這表明miR-25表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖3B)。 pre-miR-25轉(zhuǎn)染OBs 48 h后實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-25降低了TWIST1的蛋白表達(dá)水平，而過表達(dá)miR-25的表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞分化相關(guān)的其他一些關(guān)鍵基因如：SMAD5、EPAH4 沒有直接作用，而TWIST1的mRNA水平無明顯改變(圖3C)。

將WT-pGL3-TWIST1-3’UTR或MUT-pGL3-TWIST1-3′UTR與pre-miR-25或miR-C共轉(zhuǎn)染OBs。結(jié)果示，與共轉(zhuǎn)染miR-C或MUT-pGL3-TWIST1-3′UTR相比，當(dāng)WT-pGL3-TWIST1-3′UTR與miR-25共轉(zhuǎn)染時(shí)，miR-25結(jié)合于TWIST1 mRNA的3’UTR端致熒光素酶活性受到明顯抑制，而對(duì)照組熒光素酶活性則無明顯改變(圖3D)。結(jié)果表明miR-25結(jié)合于TWIST1的3’UTR，且TWIST1是miR-25的靶基因。

注：A.圖示TWIST1的3’UTR端存在miR-25的結(jié)合位點(diǎn)，且標(biāo)注了野生型(WT)TWIST1-3’UTR以及突變型(MUT)TWIST1-3’UTR。B. PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-25過表達(dá)與抑制表達(dá)載體構(gòu)建成功，與對(duì)照組比較，aP<0.05。C.miR-25在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TWIST1的表達(dá)。過表達(dá)miR-25的表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞分化相關(guān)的其他一些關(guān)鍵基因如：SMAD5、EPAH4 沒有直接作用。與對(duì)照組比較，aP<0.05。D.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)示：共轉(zhuǎn)染pre-miR-25可以降低野生型(WT)TWIST1-3’UTR的熒光素酶活性而不影響突變型(MUT)TWIST1-3’UTR的熒光素酶活性

圖3 miR-25直接作用于其靶基因TWIST1

3 討 論

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，miR-25參與調(diào)控了由β-GP和AA誘導(dǎo)的OBs的礦化過程，并且發(fā)現(xiàn)了miR-25通過作用于其靶基因 TWIST1發(fā)揮其在成骨細(xì)胞分化過程中的調(diào)控。

miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)OBs的成熟礦化過程中miR-25的表達(dá)明顯升高。在本研究中，我們選取miR-25作為研究對(duì)象并進(jìn)一步研究其在成骨細(xì)胞礦化過程中的作用及其機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-25促進(jìn)了礦化結(jié)節(jié)的生成同時(shí)抑制了TWIST1的蛋白表達(dá)。抑制miR-25則減少了礦化結(jié)節(jié)的生成同時(shí)促進(jìn)了TWIST1的蛋白表達(dá)。表明miR-25在成骨細(xì)胞的分化過程中起到了重要的調(diào)控作用。我們對(duì)miR-25在破骨細(xì)胞的分化過程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。 研究已發(fā)現(xiàn)miRNAs通過與靶基因的3’UTR結(jié)合來抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或降低靶基因mRNA的穩(wěn)定性。我們利用TargetScan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TWIST1是預(yù)測(cè)的靶基因之一。結(jié)果提示miR-25通過與 TWIST1 mRNA的3’UTR結(jié)合來調(diào)控成骨細(xì)胞的分化。 TWIST1 已被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)作用于成骨細(xì)胞的礦化過程[8]，并且有文獻(xiàn)已證實(shí)TWIST1可以與Runt相關(guān)基因2(RunX2)直接作用，來調(diào)控成骨相關(guān)基因的表達(dá)。TWIST1和 RunX2之間的直接相互作用抑制了成骨前體細(xì)胞活化后所產(chǎn)生的RunX2與DNA的結(jié)合作用[9]。TWIST1可能以類似于神經(jīng)原質(zhì)蛋白阻斷Smad1錄復(fù)合物與神經(jīng)膠質(zhì)分化相關(guān)基因的結(jié)合的方式影響了骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)在間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化過程中的作用[10]。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在成骨細(xì)胞的分化過程中過表達(dá)TWIST1可降低骨鈣素和骨橋蛋白的表達(dá)，而骨鈣素和骨橋蛋白是成骨細(xì)胞礦化的重要相關(guān)基因[11]。

本研究證實(shí)miR-25通過作用于靶基因 TWIST1調(diào)控成骨細(xì)胞分化。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，過表達(dá)miR-25可抑制野生型 TWIST1熒光素酶報(bào)告基因活性，而突變型TWIST1熒光素酶報(bào)告基因載體可取消該作用。另外，過表達(dá)和抑制試驗(yàn)表明miR-25在轉(zhuǎn)錄后水平抑制 TWIST1的表達(dá)水平。而對(duì)其他一些可能對(duì)成骨細(xì)胞分化其調(diào)控作用的基因例如：SMAD7和 EPHA4的表達(dá)沒有影響。這些結(jié)果提示miR-25在轉(zhuǎn)錄后水平抑制 TWIST1基因的表達(dá)。

本研究數(shù)據(jù)可以得出miR-25的作用模式。成骨細(xì)胞分化信號(hào)在原始成骨細(xì)胞激活礦化結(jié)節(jié)形成的通路，miR-25表達(dá)的升高抑制了 TWIST1的蛋白表達(dá)并維持了成骨細(xì)胞礦化過程。因此，一個(gè)新的miR-25/ TWIST1調(diào)控通路被挖掘出來。

綜上所述，本研究證實(shí)了miR-25通過一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miR-25/ TWIST1調(diào)控通路參與成骨細(xì)胞的礦化調(diào)節(jié)，為miRNA在成骨細(xì)胞分化中的作用提供了新的認(rèn)識(shí)，揭示了miR-25在成骨細(xì)胞分化過程中的重要作用并使miR-25表達(dá)的調(diào)控,可能成為治療骨代謝疾病的新手段。

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Study on the role of miR-25/TWIST1 regulatory pathway in osteoblast mineralization

YANGLi,ZHAOXinlan,TANGZhuo,CHENKai,QINAiping.DepartmentofEndocrinology,HunanProvinceGeriatricHospital,Changsha410001,China

Correspondingauthor:QINAiping,E-mail:244652700@qq.com

【Abstrast】 Objective To explore the role of miR-25 in the process of osteoblast differentiation and its mechanism.Methods β-glycerophosphate (β glycerophosphate, β-GP) and ascorbic acid (ascorbic acid) induced osteoblast mineralization, Alizarin Red (Alizarin Red S) experiment were performed to observe stained cells into bone mineralization. Bioinformatics computing predicted target genes of miR-25. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of miR-25 and other related genes. Overexpression experiments and inhibitions experiments were used to investigate the relationship between of miR-25 in osteoblast differentiation and its relationship with target gene. Luciferase gene reporter experiments were used to demonstrate miR-25 binding to its target genes.Results The expression of miR-25 increased gradually in the process of osteogenic differentiation. Overexpression of miR-25 promotes osteogenic differentiation through post transcriptional regulate TWIST1 expression of its target genes . As a transcription factor that regulates the differentiation of bone cells ,TWIST1 is a target gene of miR-25.Conclusion miR-25 plays an important role in the differentiation of osteoblasts by acting on target gene TWIST1, which indicates that the expression of miR-25 may be a new therapeutic target for bone metabolism.

microRNA; Osteoblast differentiation; Transcription factor; Target gene

湖南省自然科學(xué)基金(No.13JJ4119)，湖南省保健專項(xiàng)資金(No.A2014-02)

410016 長沙，湖南省馬王堆醫(yī)院老年內(nèi)分泌科

秦愛平，E-mail:244652700@qq.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.11.024

2015-05-16)