王燦茂，程玉芳，吳金剛，甘丹娜，蔣毅萍，徐江平

(南方醫(yī)科大學藥學院藥理學系，廣州 廣東 510515)

新型PDE4抑制劑Roflupram改善阿爾茨海默病大鼠的認知障礙及神經炎癥

王燦茂，程玉芳，吳金剛，甘丹娜，蔣毅萍，徐江平

(南方醫(yī)科大學藥學院藥理學系，廣州 廣東 510515)

目的 驗證新型PDE4抑制劑羅氟普蘭(roflupram)能否改善Aβ25-35誘導的阿爾茨海默病大鼠的學習記憶障礙，及可能的機制是否與緩解小膠質細胞激活引起的炎癥相關。方法 SD大鼠雙側海馬CA1區(qū)微量注射Aβ25-35(10 μg)造模。動物分組包括：假手術對照組、Aβ25-35注射組、Aβ25-35注射+鹽酸多奈哌齊組、Aβ25-35注射+Rolipram組 、Aβ25-35注射+Roflupram低、中、高劑量。連續(xù)灌胃給藥14 d后，進行Morris水迷宮實驗，20 d后進行避暗實驗。采用Western blot法檢測海馬cAMP下游信號分子(p-PKA、p-CREB)，前致炎因子(iNOS、COX-2、 TNF-α、IL-1β)，膠質細胞激活標記物(GFAP、Iba-1)，炎癥相關蛋白(p-p38、核內NF-κB p65)的蛋白水平變化，并用PCR的方法分析海馬內iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1βmRNA水平的變化。結果 行為學結果顯示，Roflupram能明顯改善由Aβ25-35造成大鼠的空間學習記憶能力和被動回避學習記憶能力障礙。分子生物學分析的結果如下：與Aβ25-35注射組比較，各藥物處理后均可以使海馬內p-CREB、p-PKA蛋白表達水平不同程度的升高，使NF-κB p65(核內)、p-p38、iNOS、 COX-2、TNF-α、IL-1β、GFAP和Iba-1的蛋白水平不同程度的降低，iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β mRNA水平下降。結論 Roflupram能夠改善Aβ25-35誘導癡呆大鼠的學習記憶功能障礙，該效應與抑制小膠質細胞的活化、減少炎性因子的表達，從而緩解神經炎癥有關。

Roflupram；阿爾茨海默??；PDE4抑制劑；神經炎癥；β- 淀粉樣蛋白；認知；小膠質細胞

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以漸進性記憶減退、認知障礙及人格改變?yōu)橹饕R床特征的中樞神經系統(tǒng)退行性變性疾病。腦內老年斑(senile plaques, SPs)形成、含有tau蛋白的神經纖維纏結(neurofibrillary tangles, NTFs)以及神經元缺失變性是其三大病理學特征[1]。AD的病因復雜，人們提出了諸多假說，如淀粉級聯(lián)學說、tau蛋白異常修飾學說、膽堿能神經異常學說等[2]，但沒有一種機制能完全解釋。近些年來神經炎癥學說與AD的關系越來越引起學者的關注, 隨著對AD炎癥機制的重視，有人提出腦內的慢性炎癥反應可能是其另一重要的病理特征[3]，AD發(fā)病的炎癥機制越來越被大家所重視。

磷酸二酯酶 4 (phosphodiesterase 4, PDE4)對于調節(jié)細胞內cAMP的濃度有重要作用。PDE4抑制劑在體內、體外實驗中均有明確的抗炎作用，如羅氟司特(roflumilast)已經在哮喘、慢性阻塞性肺疾病等氣道炎癥性疾病中廣泛使用。此外也有大量的研究表明PDE4抑制劑具有抗抑郁和改善認知的作用[4]，例如經典的PDE4抑制劑咯利普蘭(rolipram)，可以改善不同AD模型實驗動物的學習記憶，并且與其抗神經炎癥的作用有關[5]。PDE4抑制劑常伴有的致嘔吐不良反應限制了其在中樞神經系統(tǒng)疾病中的應用，roflupram是人工合成的新型PDE4抑制劑，化學結構不同于rolipram，通過比格犬灌胃給藥的方式驗證了其不具有致惡心、嘔吐等不良反應，并且對氫溴酸東莨菪堿所致的大鼠學習記憶獲得性障礙具有很好的改善效應(數(shù)據(jù)未顯示)。本研究通過大鼠海馬內注射Aβ25-35致AD模型的方法，進一步研究roflupram在抗神經炎癥方面對大鼠學習記憶障礙的影響。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器單臂腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司) ；TECAN GENios Pro多功能酶標儀(瑞士 Tecan 公司)；Biometra T-gradient 梯度PCR儀(德國 Biometra 公司)；Bio-Rad WB 系統(tǒng)(美國 Bio-Rad 公司)；UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國 Spring Scientific 公司)；注射泵(瑞典 CMA 公司)。

1.2 試劑Aβ25-35(Sigma-Aldrich)，凝聚態(tài)Aβ25-35的制備：Aβ25-35用無菌生理鹽水配制成濃度為5 g·L-1的溶液，置于37 ℃孵箱中老化7 d，使其變?yōu)槟蹜B(tài)的Aβ25-35。roflupram(由北卡羅來納州立大學柯衡明教授設計合成并贈送)；rolipram(Sigma-Aldrich);鹽酸多奈哌齊片(中國衛(wèi)材藥業(yè));核蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；兔GAPDH單抗、兔iNOS單抗、兔COX-2單抗、兔CREB單抗、兔p-CREB單抗、兔PKA單抗、兔p-PKA單抗、兔NF-κB p65單抗、兔Histone H3單抗、兔p38單抗、兔p-p38單抗、兔IL-1β單抗和兔TNF-α單抗(均購于美國Cell Signaling Technology 公司)；羊抗兔HRP-IgG，ECL發(fā)光液，TRIzol(均購于美國 Invitrogen 公司)；Real Time RT-PCR逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；2×Taq PCR Mastermix(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 實驗動物♂SD大鼠、SPF級、3 月齡、70 只、體質量200～250 g，飼養(yǎng)環(huán)境SPF級，由南方醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供、動物質量合格證號：SCXK(粵)2011-0015。

2 方法

2.1 動物分組及造模方法參考文獻[6]，取健康成年大鼠(200～250 g)70 只，隨機分為7 組，每組10 只。分為假手術對照組，Aβ25-35注射組，Aβ25-35注射+鹽酸多奈哌齊組(1.0 mg·kg-1·d-1), Aβ25-35注射+Rolipram組(0.5 mg·kg-1·d-1), Aβ25-35注射+Roflupram低(0.25 mg·kg-1·d-1)、中(0.5 mg·kg-1·d-1)、高(1.0 mg·kg-1·d-1)劑量組。大鼠腹腔注射水合氯醛(0.3 g·kg-1)麻醉后固定于腦立體定位儀上, 頭頂部去毛、消毒, 分離骨膜使顱骨暴露。于雙側海馬CA1區(qū)(坐標：AP-3.5 mm，ML ± 2.0 mm，DV-3.0 mm)注射Aβ25-35(2 μL)，注射速度0.5 μL·min-1，注射完留針5 min使溶液充分彌散。假手術對照組注射生理鹽水2 μL，各組動物手術后消毒并縫合切口皮膚。各組大鼠于注射24 h后開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥23 d。假手術對照組和Aβ25-35注射組每天灌服等容積的生理鹽水。

2.2 行為學檢測

2.2.1 水迷宮實驗 采用Morris水迷宮實驗測試大鼠空間學習記憶能力，實驗方法參考文獻[6]，并進行適當修改。實驗周期為7 d，d 1將大鼠放入水迷宮(未放平臺)自由游泳以適應環(huán)境3 min，d 2～d 6進行定位航行實驗(平臺為不可見，置于水面下1.5 cm)，記錄大鼠到達平臺所需時間(逃避潛伏期)。d 7撤去平臺進行空間探索實驗，記錄大鼠在90 s內于平臺所在象限(目標象限)內探索時間。

2.2.2 避暗實驗 水迷宮實驗結束24 h后進行避暗實驗，用以測試大鼠的被動回避學習記憶能力。避暗箱(50 cm×16 cm×10 cm)分為明箱和暗箱兩部分, 之間有孔相通。暗箱底部鋪有可通電的銅柵, 電流0.5 mA。實驗由4部分組成，對儀器環(huán)境的適應階段、電擊訓練階段、3 h后的短時記憶測試以及24 h的長時記憶測試。實驗分3 d完成，d 1將大鼠頭朝外放入避暗箱明箱，讓其自由活動4 min。d 2將動物重新放置進明箱內，讓其在明箱內活動60 s后將兩室間的門打開，待動物進入暗箱后將明暗箱間的門關閉，并給予0.5 mA的電擊，時間為3 s，使之鞏固刺激性記憶。電擊后3 h進行第1次測試，記錄動物從放入明室到首次進入暗室的時間，即為3 h潛伏期，或3 h保留時間(3 h-retention)，若動物在300 s內未能進入暗室，則保留時間記錄為300 s。24 h后對其保留時間再次進行測試，實驗方法與保留時間的記錄方法同上。

2.3 免疫印跡法測定目標蛋白表達避暗實驗結束后次日給藥后30 min，處死動物并斷頭取腦，分離雙側全海馬組織，用預冷的PBS 洗凈余血(除用于本部分實驗外，其他剩余組織存放于液氮中保存)，然后置于預冷的玻璃勻漿器中，并加入適量RIPA裂解液(含1%的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)，冰上勻漿，4 ℃靜置裂解30 min后，14 000r·min-1離心15 min，取上清后用BCA法進行總蛋白定量。將上清與上樣緩沖液混合(核蛋白提取按試劑盒說明書中的步驟進行)，混合液煮沸變性10 min后備用。取40 μg總蛋白進行SDS-PAGE實驗，再轉移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入抗PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、NF-κB p65、p-p38、p38、COX-2、iNOS、IL-1β、TNF-α、GFAP、Iba-1、GAPDH和Histone H3一抗; 4 ℃孵育12 h后加入對應的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，置于暗室曝光顯影。將膠片掃描后用Image J 1.42軟件進行條帶灰度值掃描。

2.4 RT-PCR檢測目標基因mRNA水平從液氮中取出的海馬組織，按TRIzol試劑說明書提取總RNA。cDNA的合成按RT-PCR逆轉錄試劑盒操作進行。PCR擴增混合體系混勻后置PCR 儀上擴增，擴增條件：94 ℃變性5 min，隨后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20～35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min 終止。以GAPDH為內參, 引物序列詳見Tab 1。1.5%瓊脂糖電泳，凝膠成像儀下觀察拍照。圖像用Image J 1.42軟件進行條帶灰度值掃描。

Tab 1 Sequences of PCR primers

3 結果

3.1 行為學檢測結果

3.1.1 水迷宮實驗 水迷宮定位航行實驗潛伏期結果見Fig 1A，與假手術對照組比較，Aβ25-35注射組的逃避潛伏期顯著延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與Aβ25-35注射組相比較，多奈哌齊、rolipram和roflupram高劑量均能明顯縮短逃避潛伏期，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

空間探索實驗顯示(Fig 1B)，與假手術組相比，Aβ25-35注射組大鼠在目標象限中探索時間明顯短于假手術對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而給予rolipram、多奈哌齊和roflupram高劑量后能明顯延長大鼠在目標象限中的探索時間 (P<0.05，P<0.01)；這說明Aβ25-35能損害大鼠空間記憶功能，而roflupram能改善Aβ25-35造成的空間學習記憶障礙。

3.1.2 避暗實驗 電擊后3 h，各組大鼠間潛伏期沒有顯著差異(結果未顯示)，表明各組間短時記憶沒有差異。電擊后24 h對各組大鼠長時記憶檢測，結果見Fig 2，Aβ25-35注射組動物與假手術對照組相比, 潛伏期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；rolipram組、鹽酸多奈哌齊組、roflupram中和高劑量組較Aβ25-35注射組的潛伏期明顯延長(P<0.05，P<0.01)，這說明roflupram能改善避暗實驗中由Aβ25-35造成的長時記憶障礙。

Fig 1 Effects of Roflupram on Aβ25-35-induced spatial cognitive

A: Mean daily escape latency in place navigation test; B: Probe trial test performed 24 h after the last place navigation test. Don: Donepezil hydrochloride; Rol: Rolipram; Rof: Roflupram.**P<0.01vsVeh+Veh group;#P<0.05,##P<0.01vsAβ + Veh group.

Fig 2 Effects of Roflupram on performance in presence of Aβ25-35in step-through passive avoidance test in ±s, n=10)

Don: Donepezil hydrochloride; Rol: Rolipram; Rof: Roflupram.**P<0.01vsVeh + Veh group;#P<0.05,##P<0.01vsAβ + Veh group.

3.2 Roflupram對Aβ25-35引起大鼠海馬p-PKA、p-CREB、NF-κB p65(核內)和 p-p38蛋白表達的影響如Fig 3A所示，PKA和CREB總蛋白的表達各組間無差異。與對照組相比，Aβ25-35注射組海馬內p-PKA和p-CREB水平明顯下降(P<0.01)；給予rolipram、鹽酸多奈哌齊、roflupram中劑量和高劑量處理之后可明顯對抗Aβ25-35引起的p-PKA和p-CREB蛋白表達水平下降(P<0.05，P<0.01)。

如Fig 3B所示，海馬內給予Aβ25-35后，可使NF-κB p65(核內)和p-p38的蛋白水平明顯升高(P<0.01)，而總的p38蛋白表達各組間無明顯變化，給予rolipram、鹽酸多奈哌齊、roflupram中劑量和高劑量之后可明顯逆轉Aβ25-35引起的NF-κB p65(核內)和p-p38水平上升。

3.3 roflupram對Aβ25-35引起大鼠海馬iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β mRNA水平和蛋白表達的影響RT-PCR檢測如Fig 4A所示，Aβ25-35注射組海馬內iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的mRNA水平較假手術對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而各個給藥處理組則能不同程度地降低這些基因的mRNA轉錄水平。

蛋白表達檢測結果如Fig 4B所示，假手術對照組大鼠海馬內iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β蛋白含量表達量較少，Aβ25-35注射組給予海馬內注射Aβ25-35后蛋白表達明顯升高，而各個藥物處理組則能不同程度地降低這些蛋白的表達水平。

3.4 roflupram對Aβ25-35引起大鼠海馬Iba-1和GFAP蛋白表達的影響如Fig 5所示，海馬內給予Aβ25-35后，與假手術對照組相比，可使小膠質細胞特異性標識蛋白Iba-1表達明顯升高(P<0.01)。給予rolipram、多奈哌齊和roflupram高劑量后能明顯抑制Iba-1的蛋白表達(P<0.05，P<0.01)；與假手術對照組相比，Aβ25-35注射組星形膠質細胞特異性標識蛋白GFAP表達明顯升高(P<0.05)，給予rolipram和roflupram高劑量后能明顯抑制GFAP的蛋白表達(P<0.05)。

4 討論

腦內老年斑形成是AD主要的病理學特征，而β-淀粉樣蛋白是老年斑的主要成分，已有研究證明，大鼠海馬內注射Aβ25-35可以導致學習記憶和認知功能下降[7]，是一種廣泛用于研究AD的動物模型。本研究應用此模型來觀察新型PDE4抑制劑roflupram對Aβ25-35引起大鼠認知功能障礙及神經炎癥的影響。

Fig 3 Effect of roflupram on protein expression of p-PKA，p-CREB，NF-κB p65(nuclear) and

A: Protein expression of p-CREB and p-PKA in the hippocampus in rats; B: Expression of NF-κB p65(nuclear) and p-p38 in the hippocampus in rats. Upper panel is representative immunoblots of p-PKA, PKA, p-CREB, CREB, NF-κB p65(nuclear), p-p38, p38, Histone 3(nuclear loading controls) and GAPDH (control)，lower panels are respective quantifications. The bands in the respective panels are: 1: Veh + Veh; 2: Aβ + Veh; 3: Aβ + Don 1.0 mg·kg-1; 4: Aβ+Rol 0.5 mg·kg-1; 5: Aβ + Rof 0.25 mg·kg-1; 6: Aβ + Rof 0.5 mg·kg-1; 7: Aβ + Rof 1.0 mg·kg-1.**P<0.01vsVeh+Veh group;#P<0.05,##P<0.01vsAβ+Veh group.

Fig 4 Effect of roflupram on mRNA level and protein expression of iNOS,COX-2,TNF-α and

A: mRNA level of iNOS, COX-2, TNF-α and IL-1β in the hippocampus in rats; B: Protein expression of iNOS, COX-2, TNF-α and IL-1β in the hippocampus in rats. Upper panel is representative immunoblots of iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β and GAPDH (control)，lower panels are respective quantifications. See Fig 3 for treatments.**P<0.01vsVeh+Veh group;#P<0.05,##P<0.01vsAβ + Veh group.

Upper panel is representative immunoblots of Iba-1, GFAP and GAPDH (control)， lower panels are respective quantifications. See Fig 3 for treatments.*P<0.05，**P<0.01vsVeh+Veh group;#P<0.05,##P<0.01vsAβ+Veh group.

通過Morris水迷宮和避暗實驗測試發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35海馬CA1區(qū)注射后大鼠在避暗實驗中的24 h的潛伏期明顯減短；在水迷宮實驗中大鼠的逃避潛伏期明顯延長，在目標象限的游泳時間明顯減少；這都說明Aβ25-35微注射到海馬CA1區(qū)可以導致大鼠明顯的記憶和認知功能的障礙。而給予roflupram可明顯改善模型大鼠的學習記憶與認知功能，說明roflupram可以對抗Aβ25-35引起的認知功能障礙。

分子機制研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35海馬CA1區(qū)注射后，海馬的p-PKA和p-CREB蛋白水平下降；小膠質細胞的特異性標識蛋白Iba-1和星形膠質細胞的特異性標識蛋白GFAP明顯升高；磷酸化p-38MAPK和細胞核內的NF-κB p65蛋白水平明顯升高；相應的其下游的COX-2、iNOS、TNF-α和IL-1β的蛋白水平也明顯升高；這些都表明Aβ25-35微注射后海馬出現(xiàn)了嚴重的炎癥反應。而roflupram(1 mg·kg-1)連續(xù)給藥23 d后能逆轉由Aβ25-35引起這些蛋白因子的變化，表明roflupram具有很強的緩解由Aβ25-35引起的神經炎癥的能力。

近年來的臨床和臨床前研究表明，腦內的神經炎癥在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關鍵的作用，神經炎癥的主要特征是膠質細胞過度激活及神經毒性因子釋放的增多。小膠質細胞是腦內主要的免疫細胞，能通過Toll樣受體(TLR)2/4/6和其輔助受體與Aβ相互作用[8]。Aβ可以通過作用于小膠質細胞上的Toll樣受體，引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的增高，導致腦內的氧化應激狀態(tài)，并激活下游的NF-κB p65和p38MAPK信號通路，進而引起炎癥反應的發(fā)生，使疾病惡化并加速進程最終導致癡呆[9]。NF-κB是一類具有多向性轉錄調節(jié)作用的蛋白質因子家族，未激活的NF-κB位于胞質內, 一旦被激活迅速轉入細胞核，調節(jié)包括TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2在內的靶基因的表達，從而在炎癥反應過程中起著重要作用[10]。另外p38MAPK在炎癥和應激反應中也具有重要的作用，可調控TNF-α、IL-β、IL-6、IL-8等與凋亡及炎癥有關的基因表達[11]。因此，抑制NF-κB p65和p38的信號通路在抑制小膠質細胞的活化和神經炎癥中起著關鍵作用。

CREB是介導細胞增殖分化和炎癥免疫等作用的關鍵性轉錄因子。有研究表明在LPS誘導的巨噬細胞炎癥模型中，rolipram抑制胞內cAMP的水解，cAMP水平的升高可通過cAMP/PKA/CREB的途徑誘導MAPK磷酸酶-1(MAPK phosphatase-1，MKP-1)的表達增加，從而減少p38 MAPK激活及由p38MAPK激活引起的炎癥因子的表達[12]。此外，有研究還證明，提高內皮細胞內cAMP濃度可抑制p38MAPK的活化，并進一步抑制NF-κB p65/p65亞基的磷酸化，以及結合后的NF-κB p65的轉錄活性[13]，因此NF-κB p65還是受p38MAPK調控的下游信號。本研究通過WB檢測發(fā)現(xiàn)Aβ25-35海馬內注射可以導致p-PKA和p-CREB蛋白水平明顯降低，這與之前關于Aβ海馬內或者腦室微注射可以導致p-CREB水平降低的研究相一致[14]。而roflupram處理之后可以逆轉由Aβ25-35導致的p-PKA和p-CREB水平的降低，由于roflupram還能抑制由Aβ25-35導致的p38MAPK和NF-κB p65的過度激活及下游的炎癥相關蛋白和炎癥因子的表達，因此可以推測，roflupram緩解Aβ25-35導致的神經炎癥可能是通過cAMP/PKA/CREB進而影響p38MAPK和NF-κB p65的信號通路起作用的。

實驗中還設置兩個作為對照的藥物處理：多奈哌齊和rolipram。多奈哌齊是第2代膽堿酯酶(AchE)抑制劑，其治療作用是可逆性地抑制乙酰膽堿酯酶 (AchE)，引起的乙酰膽堿水解而增加受體部位的乙酰膽堿含量，近年來又有文獻報道表明多奈哌齊還有明顯地抗神經炎癥的作用，例如多奈哌齊可以對抗Aβ低聚物海馬內注射引起的神經炎癥，其作用機制是通過抑制p38MAPK和NF-κB p65的激活，從而抑制小膠質細胞和星形膠質細胞活化引起的炎癥反應[15]，我們的實驗結果也與這些報道相一致。之前還有研究表明給予大鼠或小鼠多奈哌齊處理之后可以升高海馬p-CREB的蛋白水平[16-17]，而我們的研究也證實了這一點，但是至于多奈哌齊升高p-CREB的蛋白水平是通過何種作用機制的還未有報道，并且這是否與其具有抗炎作用的機制相關？根據(jù)我們的研究結果以及前面的分析，多奈哌齊的抗炎作用很有可能是通過，或者至少是部分通過p-CREB介導的。rolipram為經典的第1代PDE4抑制劑，已經有大量的研究證明具有良好的改善認知功能障礙的作用，并且也具有很好的抗炎作用，但由于有導致嘔吐的不良反應限制了它在臨床上的應用。盡管現(xiàn)有的大量研究表明PDE4抑制劑具有治療神經炎癥相關的中樞神經系統(tǒng)疾病如AD、帕金森綜合征等的作用，但是多年的努力卻始終不能擺脫PDE4抑制劑伴隨的致嘔吐副作用。roflupram是基于rolipram進行結構改造，成功合成并篩選出的一個新型PDE4高選擇性抑制劑，本實驗室前期采用比格犬的研究發(fā)現(xiàn)具有極低甚至可能不具有致嘔吐的潛能，本研究又發(fā)現(xiàn)roflupram能對抗Aβ25-35誘導癡呆大鼠的學習記憶功能障礙，并且該作用與其抗神經炎癥密切相關，因此roflupram具有開發(fā)成為有臨床應用價值治療阿爾茨海默病藥物的潛力。

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The new PDE4 inhibitor Roflupram ameliorated cognitive deficits and neuroinflammation in a rat model of Alzheimer’s disease

WANG Can-mao, CHENG Yu-fang,WU Jin-gang, GAN Dan-na, JIANG Yi-Ping,XU Jiang-Ping

(DeptofPharmacology，SchoolofPharmaceuticalSciences，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，China)

Aim To investigate whether the new PDE4 inhibitor Roflupram can ameliorate Aβ25-35induced cognitive deficits through the anti-neuroinflammation effects. Methods The Alzheimer’s disease model was produced by microinjection of amyloid-β(Aβ)25-35fibrils into the bilateral hippocampal CA1 area of male rats. Then the rats were randomly divided into sham-operated control group, Aβ25-35microinjected group, Aβ25-35microinjected followed by donepezil hydrochloride or Rolipram treated group, Aβ25-35microinjected combined Roflupram treated group with different doses. Treatment was given (i.g.) 24 h after microinjection surgery operation for consecutive 23 days. Morris water maze and passive avoidance test were used to test the behavior performance after drug treatments of 14 and 20 days. The protein level of cAMP downstream signaling molecules(p-PKA,P-CREB), proinflammatory cytokines (iNOS,COX-2,TNF-α,IL-1β), microglia and astrocyte activation marker(Iba-1,GFAP) and inflammation related protein (nuclear NF-κB p65,p-p38) in hippocampus were detected by Western blot. The mRNA level of proinflammatory cytokines was measured by semi-quantitative PCR. Results The results of behavioral manifestations indicated that Roflupram could significantly ameliorate the spatial learning and memory ability and the passive avoidance learning and memory ability impairment induced by microinjection of Aβ25-35. Biochemical analysis revealed that the hippocampus protein level of p-CREB and p-PKA of rats was significantly decreased induced by microinjection of Aβ25-35,while the level of NF-κBp65(Nucleus), p-p38, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, GFAP and Iba-1 was increased, and these effects were reversed by each kind of drug treatment. Semi-quantitative PCR test showed that each treatment could reduce the mRNA level of proinflammatory cytokines compared to the Aβ25-35microinjection animal. Conclusion The new PDE4 inhibitor Roflupram can ameliorate cognitive impairment induced by Aβ25-35infusion rat, which is related to its antigliosis, inflammatory cytokines expression reducing and neuroinflammation amelioration effect.

roflupram; Alzheimer’s disease; PDE4 inhibitor; neuroinflammation; amyloid beta-protein; cognitive; microglial

時間：2015-3-3 11:08 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.008.html

2014-12-03,

2015-01-04

國家自然科學基金委員會-廣東省人民政府聯(lián)合基金資助項目(No U1032006)；國家自然科學基金資助項目(No 81373384)

王燦茂(1988-)，男，碩士生，研究方向：神經藥理與新藥臨床前評價，Tel：020-61648235，E-mail: wangcanmao@sina.cn; 徐江平(1967-),男，博士，教授，博士生導師，研究方向：神經藥理與新藥臨床前評價，Tel：020-61648236, E-mail: jpx@smu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.008

A

1001-1978(2015)03-0327-07

R-332；R322.81；R338.64；R745.7；R977.3