陸玉建, 張韓杰, 劉南南

(1.濱州學(xué)院生命科學(xué)系/山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心,山東濱州 256603；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600）

大腸桿菌otsA基因的克隆和轉(zhuǎn)化本生煙草

陸玉建1,2, 張韓杰1, 劉南南1

(1.濱州學(xué)院生命科學(xué)系/山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心,山東濱州 256603；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600）

海藻糖是一類(lèi)重要的滲透調(diào)節(jié)劑,可以提高植物抵抗多種非生物脅迫的能力。6-磷酸海藻糖合成酶(TPS）是海藻糖生物合成的關(guān)鍵酶,在大腸桿菌中,otsA基因編碼TPS。本試驗(yàn)通過(guò)PCR技術(shù)克隆otsA基因,構(gòu)建p2300-otsA-GFP表達(dá)載體,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將otsA基因?qū)氲奖旧鸁煵葜?。?duì)篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)表明,otsA基因已成功整合到本生煙草的基因組中,并能進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄。而且研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因幼苗在含有150 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng),具有一定的抗鹽脅迫能力。

海藻糖；大腸桿菌；otsA基因；本生煙草；根癌農(nóng)桿菌

環(huán)境脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素,其中又以干旱和鹽脅迫對(duì)植物的影響最為嚴(yán)重[1-3]。土壤中鹽分過(guò)高,會(huì)降低植物的滲透勢(shì),導(dǎo)致植物失水,此外,過(guò)多的鹽分還可對(duì)植物產(chǎn)生離子毒害作用,造成細(xì)胞膜損傷,膜透性增強(qiáng),酶活性降低,葉綠體降解,呼吸作用受阻,氣孔關(guān)閉,光合作用受到抑制等,最終導(dǎo)致植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育受阻[1,4]。植物為了消除鹽脅迫所造成的傷害,除了將鹽積累到液泡或排出細(xì)胞外,還可以通過(guò)在細(xì)胞中積累一些小分子有機(jī)化合物來(lái)維持細(xì)胞質(zhì)的高滲透壓,從而有利于植物在高鹽條件下對(duì)水分的吸收[1-2,5]。海藻糖就是其中一類(lèi)重要的滲透調(diào)節(jié)劑,廣泛存在于生物界,是一種由2分子葡萄糖縮合而成的非還原性雙糖[6]。在非生物脅迫的條件下,海藻糖可以避免細(xì)胞失水而損失養(yǎng)分,保護(hù)細(xì)胞免受自由基的傷害,還可增加膜脂的流動(dòng)性和酶的穩(wěn)定性[1,7-10]。在細(xì)菌和酵母中,海藻糖的合成包括2個(gè)過(guò)程：首先, UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在6-磷酸海藻糖合成酶(TPS）的催化下形成6-磷酸海藻糖；然后,6-磷酸海藻糖在6-磷酸海藻糖磷酸化酶(TPP）的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楹Ｔ逄荹10-12]。在大腸桿菌中,otsA和otsB基因分別編碼TPS和TPP,在逆境脅迫下,海藻糖合成相關(guān)酶類(lèi)能顯著提高細(xì)胞中海藻糖的含量,從而增強(qiáng)大腸桿菌適應(yīng)不良環(huán)境的能力[11,13]。在水稻中,大腸桿菌otsA-otsB融合基因過(guò)表達(dá)可明顯提高水稻抗脅迫能力[10,13]。在擬南芥中,AtTPS1插入突變將使胚胎發(fā)育受到抑制,tps1突變體胚胎的細(xì)胞壁變厚,細(xì)胞分裂明顯減少；而AtTPS1過(guò)表達(dá)則可增強(qiáng)擬南芥的耐旱能力[14-15]。

海藻糖與生物抗逆能力之間具有密切的關(guān)系,但海藻糖在植物細(xì)胞中含量很低[11,14],其作用的相關(guān)機(jī)制還不十分清楚,因此有必要進(jìn)行深入的研究。本試驗(yàn)擬通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將克隆的大腸桿菌otsA導(dǎo)入到本生煙草中,從而初步建立起本生煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系,并篩選出具有一定抗脅迫能力的轉(zhuǎn)基因植株,以期為今后通過(guò)基因工程手段增強(qiáng)植物的耐鹽能力提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料為本生煙草(Nicotiana benthamiana）種子,由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens）GV3103由本實(shí)驗(yàn)室保存,p2300-GFP質(zhì)粒由蘭州大學(xué)細(xì)胞研究所提供, pTZ57R/T載體購(gòu)自蘭州鵬程生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 常用試劑及酶類(lèi)Taq酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購(gòu)自蘭州鵬程生物技術(shù)有限公司,限制性?xún)?nèi)切核酸酶和Primer STARTMHS DNA ploymerase購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 試驗(yàn)各階段所用的最佳培養(yǎng)基組成見(jiàn)表1,各培養(yǎng)基中均含3%蔗糖和0.8%瓊脂,pH為5.8,培養(yǎng)條件：每天16 h光照、8 h黑暗,濕度約80%,溫度25℃左右,光照度為2 000 lx[16]。

表1 本生煙草遺傳轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基的組成及編號(hào)Table 1 The composition and coding of the media for Nicotiana benthamiana

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌otsA基因的克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的otsA基因(Accession：X69160）序列設(shè)計(jì)引物otsA-F：5′-GAGGAGCTCATGAGTCGTTTAGTCGTAGT-3′(下劃線為SacⅠ酶切位點(diǎn)）和otsA-R：5′-ATAGGTACCCGCAAGCTTTGGAAAGGTAG-3′(下劃線為KpnⅠ酶切位點(diǎn)）,用于克隆otsA基因完整的CDS序列,所用引物由大連寶生物工程有限公司進(jìn)行合成。以大腸桿菌基因組DNA為模板,高保真PCR擴(kuò)增otsA,將回收產(chǎn)物連入pTZ57R/T載體(圖1A）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,并對(duì)重組克隆進(jìn)行PCR和酶切鑒定。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,60℃復(fù)性30 s,72℃延伸1 min 30 s, 35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。將含有目的基因的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序(由上海生工生物工程有限公司完成）。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 用限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ-KpnⅠ分別酶切質(zhì)粒p2300-GFP和pTZ57R/T-otsA,回收目的片段,用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,從而構(gòu)建p2300-otsA-GFP載體(圖1B）。將含目的基因的p2300-otsA-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

圖1 大腸桿菌otsA基因表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of otsA expression vectors

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)本生煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 將含有p2300-otsA-GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),待其OD600約為0.5時(shí)離心,加入等體積的Y1培養(yǎng)基懸浮菌體；切取本生煙草的葉片,置于菌液中侵染3～5 min；然后接種到Y(jié)2培養(yǎng)基中,共培養(yǎng)2 d；將葉片轉(zhuǎn)入到Y(jié)3培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng),誘導(dǎo)葉片分化,產(chǎn)生不定芽；轉(zhuǎn)移至Y4中進(jìn)行增殖培養(yǎng),切取生長(zhǎng)良好的不定芽,在Y5中誘導(dǎo)生根；獲得轉(zhuǎn)基因試管苗,馴化移栽,篩選鑒定。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè) 用CTAB法提取野生型和轉(zhuǎn)化植株葉片DNA,PCR檢測(cè)大腸桿菌otsA整合到本生煙草染色體上的情況；Trizol法提取野生型和轉(zhuǎn)化植株的總RNA,RT-PCR檢測(cè)大腸桿菌otsA在轉(zhuǎn)基因植株中的轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌otsA基因編碼產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域分析

大腸桿菌otsA基因全長(zhǎng)1 425 bp,其編碼的蛋白由474個(gè)氨基酸構(gòu)成,預(yù)測(cè)其分子量大小約54 000。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Conserved Domain Search工具對(duì)otsA蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明(圖2）,在該蛋白的內(nèi)部存在1個(gè)GT1_TPS保守結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域是糖基轉(zhuǎn)移酶GTB類(lèi)家族(Glycosyltransferase_GTB_type）的成員,由460個(gè)氨基酸組成,屬于TPS的催化結(jié)構(gòu)域,參與6-磷酸葡萄糖形成6-磷酸海藻糖的催化過(guò)程。

圖2 大腸桿菌otsA基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 The analysis of conserved domain of otsA encoded protein

2.2 大腸桿菌otsA蛋白序列比對(duì)與保守性分析

在逆境脅迫下,otsA能顯著提高大腸桿菌細(xì)胞中海藻糖的含量,從而增強(qiáng)其適應(yīng)不良環(huán)境的能力；在酵母和擬南芥中,海藻糖合成的關(guān)鍵酶分別為ScTPS1和AtTPS1,它們分別由495和942個(gè)氨基酸組成。運(yùn)用clustalW軟件對(duì)otsA、ScTPS1和AtTPS1蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)[17],結(jié)果顯示(圖3）,otsA和ScTPS1一致的氨基酸有158個(gè),相似的氨基酸有70個(gè),序列相似性為45.1%；otsA和At-TPS1一致的氨基酸有167個(gè),相似的氨基酸有81個(gè),序列相似性為26.2%；ScTPS1和AtTPS1一致的氨基酸有243個(gè),相似的氨基酸有68個(gè),序列相似性為32.8%。通過(guò)分析比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),otsA和ScTPS1存在較高的相似性,而與AtTPS1存在一定的差異,但它們一致或相似的氨基酸數(shù)量較多,因此,可以推測(cè),這三種蛋白至少在部分功能上應(yīng)該是相似的。

圖3 大腸桿菌otsA、ScTPS1和AtTPS1蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(其中AtTPS1 C端部分氨基酸序列沒(méi)有顯示）Fig.3 Sequence alignment between proteins otsA,ScTPS1 and AtTPS1(C-terminal amino acid sequence of AtTPS1 were not shown）

2.3 大腸桿菌otsA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

用clustalW軟件對(duì)大腸桿菌和其他12種生物的TPS氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),通過(guò)MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示(圖4）,在所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中,大腸桿菌和果蠅聚類(lèi)在一起,表明它們之間有更近的親緣關(guān)系和更相似的蛋白質(zhì)序列特征。大腸桿菌、啤酒酵母和擬南芥處于不同的進(jìn)化分支,但大腸桿菌與啤酒酵母之間的距離較近,而與擬南芥之間的距離較遠(yuǎn),所以可以推測(cè),大腸桿菌otsA的功能很可能與酵母相似,但與擬南芥中的TPS存在較大的差異。

2.4 大腸桿菌otsA的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

以大腸桿菌DH5α基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增otsA基因。將回收的PCR克隆片段與pTZ57R/T載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提質(zhì)粒,PCR和酶切鑒定。試驗(yàn)結(jié)果顯示,質(zhì)粒PCR和雙酶切都可得到大小介于1 200～2 000 bp的條帶,表明目的片段已連入pTZ57R/T(圖5A和圖5B）。對(duì)pTZ57R/T-otsA和p2300-GFP質(zhì)粒進(jìn)行酶切,將回收的目的片段進(jìn)行連接。PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒,結(jié)果表明,目的片段已連入p2300-GFP,從而實(shí)現(xiàn)p2300-otsAGFP表達(dá)載體的構(gòu)建(圖5C和圖5D）。將p2300-otsA-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中。

2.5 本生煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

圖4 基于不同生物海藻糖合成酶氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on the biological amino acid sequences of the trehalose synthesis enzymes

圖5 載體的構(gòu)建與鑒定Fig.5 Construction and identification of the vectors

活化含目的基因的根癌農(nóng)桿菌,葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化本生煙草。將葉片浸入農(nóng)桿菌液中,然后取出接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(圖6 A）。將共培養(yǎng)2 d的外植體接種到篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。經(jīng)過(guò)20 d的培養(yǎng),可以觀察到本生煙草卷曲的葉片上面分布著大量的芽點(diǎn)(圖6B）。到了第35 d,葉片上產(chǎn)生大量明顯的不定芽(圖6C）。選擇生長(zhǎng)情況較好的抗性芽,切取后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。6周后,不定芽基部已產(chǎn)生大量的根,試管苗生長(zhǎng)健壯(圖6D）。當(dāng)根布滿(mǎn)培養(yǎng)基底部,幼苗高8～10 cm時(shí),便可進(jìn)行馴化和移栽。圖6E顯示的是培養(yǎng)室中生長(zhǎng)2周的轉(zhuǎn)基因本生煙草。對(duì)篩選出的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明,大腸桿菌otsA基因已成功的整合到本生煙草的基因組中(圖6G）。RT-PCR檢測(cè)大腸桿菌otsA基因表達(dá)情況,顯示該基因在本生煙草中可以有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄(圖6H）。將生長(zhǎng)2周的野生型和轉(zhuǎn)基因幼苗轉(zhuǎn)移到含150 mmol/L NaCl培養(yǎng)基,1周后發(fā)現(xiàn),野生型幼苗葉片變黃,生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈的抑制；而轉(zhuǎn)基因幼苗則對(duì)NaCl具有明顯抗性(圖6F）。

圖6 本生煙草的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定Fig.6 Genetic transformation and identification of Nicotiana benthamiana

3 討論

海藻糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)劑,可以使生物具有抗環(huán)境脅迫的能力[1,6]。在惡劣環(huán)境下,低等生物中海藻糖含量較豐富,但是在植物中含量卻很少[11,15]。TPS是海藻糖生物合成的關(guān)鍵酶,在大腸桿菌中,otsA基因編碼TPS[9,12-13]。通過(guò)利用Conserved Domain Search工具對(duì)otsA蛋白保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析顯示,在該蛋白的內(nèi)部存在一個(gè)GT1_TPS保守結(jié)構(gòu)域,這與otsA的功能一致。序列比對(duì)結(jié)果表明,otsA和ScTPS1分享45.1%的相似性,而與At-TPS1序列相似性只有26.2%；系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),大腸桿菌、啤酒酵母和擬南芥處于不同的進(jìn)化分支,但大腸桿菌與啤酒酵母之間的距離較近,而與擬南芥之間的距離較遠(yuǎn),所以可以推測(cè),otsA的功能很可能與酵母相似,而與擬南芥存在較大的差異,但它們?cè)诒Ｊ貐^(qū)域存在一致或相似的氨基酸序列,因此,這三種蛋白至少在部分功能上應(yīng)該是相似的。根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果可以預(yù)測(cè),在植物中異源表達(dá)otsA基因有可能像在大腸桿菌中一樣,能夠增強(qiáng)其抗脅迫能力。

本試驗(yàn)克隆了大腸桿菌的otsA基因,并構(gòu)建了p2300-otsA-GFP表達(dá)載體。為了研究大腸桿菌6-磷酸海藻糖合成酶對(duì)提高植物抗逆性的作用,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將otsA導(dǎo)入到本生煙草中。對(duì)篩選得到的抗性植株進(jìn)行檢測(cè)表明,otsA已整合到本生煙草的基因組中并能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。此外,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因幼苗耐鹽能力明顯提高。本試驗(yàn)成功的建立起本生煙草的轉(zhuǎn)化體系,對(duì)于今后通過(guò)基因工程技術(shù)提高植物抵抗多種非生物脅迫的能力,促進(jìn)糧食增產(chǎn)以及培育出更優(yōu)良的農(nóng)作物都具有非常重要的意義。

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(責(zé)任編輯：陳海霞）

Cloning of otsA gene in Escherichia coli and its transformation into Nicotiana benthamiana

LU Yu-jian1,2, ZHANG Han-jie1, LIU Nan-nan1

(1.Department of Life Sciences,Binzhou University/Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application in Yellow River Delta,Binzhou 256603,China；2.Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy of Shandong Province,Binzhou 256600,China）

Trehalose,as an important osmotic regulator,improves plant tolerance to multiple abiotic stress.InEscherichia coli,TPSis a key enzyme for the biosynthesis of trehalose encoded byotsAgene.In this experiment,otsAgene was cloned and transferred into the genome ofNicotiana benthamianabyAgrobacterium-mediated method.The transgenic seedlings in the medium containing 150 mmol/L NaCl grew much better than wild-type seedlings,indicative of the salt tolerance ofotsA-transgenic seedlings.

trehalose；Escherichia coli；otsAgene；Nicotiana benthamiana；Agrobacterium tumefaciens

Q 785；S572

A

1000-4440(2015）01-0032-07

陸玉建,張韓杰,劉南南.大腸桿菌otsA基因的克隆和轉(zhuǎn)化本生煙草[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,31(1）：32-38.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.01.005

2014-06-30

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2012CL14）；濱州學(xué)院博士基金項(xiàng)目(2010Y08）

陸玉建(1979-）,男,河南南陽(yáng)人,博士,講師,主要從事細(xì)胞工程及分子生物學(xué)研究。(Tel）0543-3190096；(E-mail） luyujian79@163.com