岳 軍，高玉玲，張立弟，王繼艷，徐友海，胡世洋，惠繼星

(中國(guó)石油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132021)

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)人類(lèi)世界面臨著前所未有的資源、能源、環(huán)境問(wèn)題，一方面對(duì)于不可再生的化石燃料需求量不斷增加，另一方面化石燃料燃燒排放的大量二氧化碳，造成了嚴(yán)重的溫室效應(yīng)。

面對(duì)日益嚴(yán)峻的資源環(huán)境等問(wèn)題，尋求環(huán)境友好且可再生的新能源成為急需解決的問(wèn)題。當(dāng)前利用生物質(zhì)生產(chǎn)以燃料乙醇為代表的可再生能源正受到廣泛的關(guān)注，目前的普遍做法是將燃料乙醇添加在汽柴油中，以部分降低汽柴油的使用，燃料乙醇取代MTBE添加在汽柴油中，可避免對(duì)地下水和空氣的污染,提高汽油的辛烷值和含氧量，改善汽車(chē)尾氣的質(zhì)量，減輕污染。而從國(guó)家能源安全角度而言，我國(guó)已成為世界上第2大原油消費(fèi)國(guó)，然而我國(guó)石油資源儲(chǔ)量有限，石油年開(kāi)采量已經(jīng)滿(mǎn)足不了對(duì)原油的需求量，近年來(lái)對(duì)于進(jìn)口原油的依存度更是接近了60%，對(duì)于國(guó)家的能源安全造成了一定的威脅。此外近年來(lái)我國(guó)霧霾頻發(fā)，相關(guān)研究表明，汽車(chē)排放的尾氣是霧霾產(chǎn)生的原因之一，推廣使用燃料乙醇對(duì)我國(guó)的能源安全及減輕霧霾都有著重要的意義[1-2]。

目前我國(guó)已是世界第3大燃料乙醇生產(chǎn)國(guó)，目前生產(chǎn)燃料乙醇的主要原料是玉米為主的糧食，由于我國(guó)人口眾多，發(fā)展糧食乙醇將危及國(guó)家的糧食安全，因此以木薯及木質(zhì)纖維素材料為主的非糧原料是燃料乙醇的發(fā)展方向，在纖維素乙醇大規(guī)模推廣之前，木薯乙醇無(wú)疑將是不二的選擇[3-4]。濃醪發(fā)酵是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，濃醪發(fā)酵增加乙醇發(fā)酵終濃度，從而降低蒸餾的能量消耗[5-7]，作者以木薯濃醪發(fā)酵為著眼點(diǎn)，研究了高底物濃度對(duì)于液化及發(fā)酵的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

木薯粉：含水率14.503%，w(淀粉)=78.5%；α-淀粉酶：16.25萬(wàn)U/mL；糖化酶：22.13萬(wàn)U/mL；高活性釀酒干酵母、蛋白胨、酵母抽提物、NaCl:分析純，NaHO:分析純，(NH4)2SO4:分析純，C6H12O6:分析純，均為市售。

HHS 型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；BS-1E振蕩培養(yǎng)箱：金壇市富華儀器有限公司；四聯(lián)發(fā)酵罐：瑞士比歐；Anke TGL-16G離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；SBA-40X生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；微孔板光譜儀：美國(guó)Molecular Device；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器：常州澳華儀器有限公司；PP-25 pH計(jì)：德國(guó)Sartorius；AND快速水分測(cè)定儀：日本AND公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉液化

將一定量的木薯粉按照實(shí)驗(yàn)需求的料水比[為木薯粉質(zhì)量(g)與水體積(L)比，以下同]與水混合后，用pH計(jì)測(cè)定醪液pH=2.41～2.43，并使用飽和氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)醪液pH=5.8～6.2，隨后將裝有醪液的三角瓶置于恒溫水浴鍋中，糊化10 min后加入α-淀粉酶，在電動(dòng)攪拌器攪拌下，液化一定時(shí)間，液化過(guò)程中定時(shí)取液化液測(cè)定還原糖與DE值。

1.2.2 同步糖化發(fā)酵(SSF)

將已液化的木薯粉醪液冷卻至室溫，并調(diào)整pH=4.5～5.0，加入糖化酶，釀酒酵母，以及蛋白胨、酵母抽提物、氯化鈉等酵母生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，隨后將裝有上述醪液的三角瓶置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行乙醇發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)取樣，并使用生物傳感分析儀測(cè)定發(fā)酵液中的ρ(葡萄糖)與ρ(乙醇)。

1.3 分析方法

1.3.1 還原糖含量測(cè)定

還原糖含量按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行[8]。

1.3.2 ρ(葡萄糖)與ρ(乙醇)的測(cè)定

吸取2 mL發(fā)酵醪液，離心后取上清液，并稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后，用SBA-40X型生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖與乙醇的濃度，乘以稀釋倍數(shù)后即為發(fā)酵醪中ρ(葡萄糖)與ρ(乙醇)。

ρ(葡萄糖)=測(cè)定值×稀釋倍數(shù)/100

(1)

ρ(乙醇)=測(cè)定值×稀釋倍數(shù)/100

(2)

1.3.3 DE值測(cè)定

吸取一定量的液化醪液，按照1.3.2所述方法測(cè)定其中還原糖的量，并使用快速水分測(cè)定儀測(cè)定其中干物質(zhì)的量。DE值的計(jì)算公式如下。

(3)

1.3.4 淀粉含量測(cè)定

按照GB/T 5009.9—2008所述方法測(cè)定木薯粉中的淀粉含量。

1.3.5 木薯粉干物質(zhì)含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量已經(jīng)風(fēng)干的木薯粉，放入AND快速水分測(cè)定儀并于150 ℃下烘至質(zhì)量恒定。按公式(2)計(jì)算干物質(zhì)比率，其中m0為干燥前樣品質(zhì)量，m1為干燥后樣品質(zhì)量。

(4)

2 結(jié)果與討論

2.1 液化條件研究

在以淀粉質(zhì)為原料生產(chǎn)乙醇工藝中，必須通過(guò)液化及糖化反應(yīng)將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，然后將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇，因此液化是淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇關(guān)鍵步驟之一。通常采用DE值作為衡量液化效果標(biāo)準(zhǔn)[9]。

影響液化效果的因素，主要有溫度、酶用量(濃度)、液化時(shí)間、料水比。為了取得較好的液化效果，研究了上述4個(gè)參數(shù)對(duì)于液化效果影響。

2.1.1 液化溫度對(duì)DE值的影響

料水比=1∶3.0(干重)條件下，稱(chēng)取50 g木薯粉于三角瓶中，分別加入150 mL水，加入3.4 mLα-淀粉酶(1 000倍原酶稀釋液)，使木薯粉醪液中液化酶用量為10 U/g木薯粉，液化時(shí)間1 h，研究70、80、90、100 ℃對(duì)木薯粉醪液中淀粉液化的影響，測(cè)定還原糖濃度，計(jì)算DE值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

t/℃圖1 溫度對(duì)液化效果的影響

由圖1可見(jiàn)，隨著液化溫度的增加，DE值呈上升趨勢(shì)，液化溫度為90 ℃時(shí)DE值最高，溫度為100 ℃時(shí)DE值有所降低。分析原因可能是溫度超過(guò)90 ℃，液化酶大量失活，影響了液化效果，降低了DE值。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)DE=18%～20%時(shí)液化效果最佳，DE值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)后續(xù)糖化反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，不利于乙醇發(fā)酵，造成原料浪費(fèi)。從實(shí)驗(yàn)中可以初步得出結(jié)論，液化溫度為70～80 ℃液化效果較好，實(shí)驗(yàn)中液化溫度為80 ℃時(shí)液化醪黏度下降較快，因此液化溫度選擇80 ℃為宜。

2.1.2 液化酶用量對(duì)DE值的影響

料水比=1∶3.0(干重)條件下，稱(chēng)取50 g木薯粉加入150 mL 水，80 ℃液化1 h，α-淀粉酶用量分別為：5、10、30、50、100 U/g木薯粉。測(cè)定還原糖濃度，計(jì)算DE值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

液化酶用量是影響液化效果的另一重要因素。圖2表明，隨著酶用量增加，DE值呈上升趨勢(shì)。當(dāng)液化酶用量為5 U/g木薯粉時(shí)，DE值即可達(dá)到22%以上，增加酶的用量DE值雖然大幅增加，但已不利于后續(xù)的糖化，從節(jié)約酶及不影響DE值的前提條件下，考慮到不過(guò)低地降低后續(xù)糖化的速率，酶用量選擇10 u/g木薯粉。

液化酶用量/[U·(g木薯粉)-1]圖2 液化酶用量對(duì)液化效果的影響

2.1.3 液化時(shí)間對(duì)DE值的影響

料水比=1∶3.0(干重)條件下，稱(chēng)取50 g木薯粉，加入150 mL 水，80 ℃條件下，α-淀粉酶用量為10 U/g木薯粉?？疾煲夯瘯r(shí)間，分別為：20、40、60、80、100、120 min對(duì)于DE值的影響。測(cè)定還原糖濃度，計(jì)算DE值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

液化時(shí)間/min圖3 液化時(shí)間對(duì)液化效果的影響

圖3表明，液化時(shí)間在40～60 min時(shí)DE值已經(jīng)達(dá)到了約20%(分別為：19.81%，25.32%)，表明液化時(shí)間為60 min較為適宜。

2.1.4 料水比對(duì)DE值的影響

80 ℃條件下液化1 h，α-淀粉酶用量為10 U/g木薯粉。稱(chēng)取50 g木薯粉，分別加入68.40 mL 水(料水比=1∶1.4)、98.33 mL 水(料水比=1∶2.0)、128.25 mL 水(料水比=1∶2.6)、150 mL 水(料水比=1∶3.0)。測(cè)定還原糖濃度，計(jì)算DE值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

料水比不僅影響液化效果，而且對(duì)發(fā)酵醪液中乙醇終濃度及淀粉轉(zhuǎn)化率有很大影響。因此，選擇適宜料水比對(duì)乙醇發(fā)酵非常重要。實(shí)驗(yàn)中比較分析了4個(gè)料水比對(duì)于液化效果影響。結(jié)果表明，隨著料水比由1∶1.4變化到1∶3.0時(shí)，DE值整體呈上升趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)料水比為1∶1.4及1∶2.0液化過(guò)程中，木薯粉醪液黏度過(guò)大，傳質(zhì)效果較差，影響酶解的效率，因此為保證較高的乙醇濃度及轉(zhuǎn)化率，同時(shí)減少液化酶及糖化酶的用量，料水比為1∶2.6或是1∶3.0為宜。

料水比/(g·L-1)圖4 料水比對(duì)液化效果的影響

2.2 5 L發(fā)酵罐木薯乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)，在35 ℃條件下采用SSF發(fā)酵方式，開(kāi)展了5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)。

分別稱(chēng)取500 g木薯粉(干重427.5 g)、1423 mL 水(料水比1∶3.0)、1 210 mL 水(料水比1∶2.6)，分別置于5 L 瑞士比歐發(fā)酵罐；溫度升至65 ℃時(shí)，加入α-淀粉酶，用量為10 U/g木薯粉，80 ℃轉(zhuǎn)速1 000 r/min，液化反應(yīng)1 h；調(diào)pH=4.5～4.7，加入糖化酶用量150 U/g木薯粉,釀酒酵母(酵母數(shù)量4.6×107/mL)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[w(蛋白胨)=0.5%，w(酵母抽提物)=0.5%，w(氯化鈉)=0.5%]；35 ℃轉(zhuǎn)速700 r/min開(kāi)始發(fā)酵，每隔4 h取樣檢測(cè)ρ(葡萄糖)與ρ(乙醇)。由圖5、圖6可見(jiàn),料水比=1∶2.6木薯粉醪液乙醇發(fā)酵在第28 h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，最高值出現(xiàn)在約32 h，ρ(乙醇)=140 g/L，每克淀粉可轉(zhuǎn)化乙醇0.520 4±0.015 g；料水比=1∶3.0木薯粉醪液乙醇發(fā)酵在第28 h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，最高值出現(xiàn)在約28 h，ρ(乙醇)≥120 g/L，每克淀粉可轉(zhuǎn)化乙醇(0.516±0.002)g。

t/h圖5 5 L發(fā)酵罐中ρ(乙醇)和淀粉轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化趨勢(shì)(料水比1∶3.0)

t/h圖6 5 L發(fā)酵罐中ρ(乙醇)和淀粉轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化趨勢(shì)(料水比1∶2.6)

3 結(jié) 論

綜上所述，料水比在1∶2.6和1∶3.0之間，溫度為80 ℃條件下，液化酶用量為10 U/g木薯粉，液化反應(yīng)1 h；采用SSF發(fā)酵方式，溫度為35 ℃，糖化酶用量150 U/g木薯粉，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的安琪釀酒酵母，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的酵母抽提物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的氯化鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的胰蛋白胨，發(fā)酵時(shí)間在約28～32 h可以獲得較高的乙醇質(zhì)量濃度及轉(zhuǎn)化率。

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