張 碩，劉 寧，盧 媞，王 穎，周祖濤，2，劉 梅，2，

胡思順1，2，栗紹文1，2，畢丁仁1，2，李自力1，2＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070；2.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070）

鴨疫里默菌感染是由鴨疫里默菌（R.anatipestifer，RA）引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要接觸性傳染病之一，臨床剖檢病變主要表現(xiàn)為全身漿膜炎性滲出。該病呈世界范圍分布，給各國的養(yǎng)鴨業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失［1－2］。根據(jù)目前分離RA 發(fā)現(xiàn)其與鴨大腸埃希菌混合感染率高，并且混合感染的致病力更強(qiáng)［3］。隨著我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，RA 已成為危害我國養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一。

目前關(guān)于鴨疫里默菌毒力因子的報(bào)道較少。胡清海等［4］利用同源重組的方法構(gòu)建了RA 血清2型的OmpA 基因缺失株，發(fā)現(xiàn)OmpA 是RA 的一個(gè)重要毒力因子，可能主要起黏附入侵作用。周祖濤等［5］報(bào)道了RA－YM 株的基因組序列，發(fā)現(xiàn)RA 的sspA 基因編碼產(chǎn)物與ScpB 蛋白具有高度的同源性，從而預(yù)測sspA 可能是RA 的毒力相關(guān)因子。鄭娟等選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列（SCOTS）技術(shù)篩選體內(nèi)外差異性表達(dá)基因，預(yù)測了幾個(gè)毒力相關(guān)蛋白［6］。

芳香族氨基酸在細(xì)菌中只有一條通往分支酸的合成途徑，aroA 基因是這個(gè)途徑中的關(guān)鍵基因。羅曉松等［7］通過在魚源嗜水氣單胞菌aopB／aopD 缺失株的基礎(chǔ)上缺失aroA 基因從而構(gòu)建無毒菌株，且生長速度明顯慢于親本株；Buzzola R F 等［8］構(gòu)建的金黃色葡萄球菌aroA 基因缺失株的毒力比親本株下降了約16倍；多殺性巴氏桿菌和遲緩愛德華菌等均有關(guān)于aroA 基因缺失減毒株構(gòu)建成功的報(bào)道［9－10］。

構(gòu)建缺失基因菌株的方法較多，利用自殺性質(zhì)粒需要在宿主菌的復(fù)制原點(diǎn)的驅(qū)動(dòng)下才能復(fù)制的特點(diǎn)，使用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)同源重組，這是當(dāng)前構(gòu)建基因缺失菌株的一種比較有效的方法，通過研究發(fā)現(xiàn)鴨疫里默菌只需一次重組就可以成功構(gòu)建基因缺失菌株，并在鴨疫里默菌中待缺失的aroA 基因的左右同源臂之間插入一個(gè)壯觀霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記來篩選基因缺失菌株［11］。本試驗(yàn)通過構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒，缺失RA－YM 株的aroA 基因，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步深入研究RA 的分子致病機(jī)理，構(gòu)建鴨疫里默菌基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和試驗(yàn)用動(dòng)物 大腸埃希菌DH5α由本室保存；鴨疫里默菌血清1 型云夢分離株（RA－YM）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；pBluescriptⅡSK（＋），自 殺 性 質(zhì) 粒pRE112 及 宿 主 菌E.coli X7213由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18－T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司；攜帶壯觀霉素（Spc）抗性基因pIC333質(zhì)粒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院孫明教授惠贈(zèng)；1 日齡非免疫健康櫻桃谷肉鴨共111只購于湖北某種鴨廠。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、Sac Ⅰ、Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ、r TaqTM、ETaqTM、T4DNA 連接酶、DNA marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自Tiangen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。本研究所用引物見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 重組自殺性質(zhì)粒pRE112－LSR 的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)［12］擴(kuò)增模板RA－YM 株aroA 基因。以鴨疫里默菌基因組為模版，用引物L(fēng)eftarm P1／Leftarm P2、Rightarm P3／Rightarm P4 分 別 擴(kuò) 增RA－YMaroA 基因左右側(cè)的基因片段。以pIC333質(zhì)粒為模板，用引物Spc P1／Spc P2擴(kuò)增壯觀霉素抗性基因（Spc），將純化的PCR 產(chǎn)物分別與克隆載體pMD18－T 連 接。用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ將pTRightarm 質(zhì)粒上的aroA 基因右臂插入到pBluescriptⅡSK（＋）載體上，構(gòu)建質(zhì)粒pSK－Rigtarm；用Hind Ⅲ和BamHⅠ將pT－Spc質(zhì)粒上的Spc插入到pSK－Rigtarm 上，構(gòu)建質(zhì)粒pSK－Rigtarm－Spc；用KpnI和Hind Ⅲ將pT－Leftarm 質(zhì)粒上的aroA 基因左臂插入到pSK－Rigtarm－Spc質(zhì)粒上，構(gòu)建質(zhì)粒pSK－LSR；用KpnⅠ和SacⅠ將pSK－LSR質(zhì)粒上的LSR 片段重組到自殺性質(zhì)粒pRE112上，構(gòu)建質(zhì)粒pRE112－LSR；將 質(zhì) 粒pRE112－LSR 轉(zhuǎn) 化E.coli X7213感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氯霉素（12.5μg／mL）和DAP（50μg／mL）的LB 瓊脂固體平板，挑取單菌落，搖菌，小提質(zhì)粒酶切鑒定并測序。

1.2.2 RA－YMaroA 基因缺失菌株的構(gòu)建及鑒定

以含有pRE112－LSR 質(zhì)粒的E.coli X7213菌株為供體菌，鴨疫里默菌血清1 型云夢分離株（RAYM）為受體菌，采用接合轉(zhuǎn)移的方法構(gòu)建缺失株。挑取在含壯觀霉素的平板上生長的細(xì)菌克隆為候選突變株，以引物Spc p1／Spc p2；擴(kuò)增突變株內(nèi)部的Spc抗性基因片段；以引物Y1／Y2、Z1／Z2擴(kuò)增待缺失的aroA 基因。

1.2.3 RA－YMaroA 基因缺失株生化特性鑒定挑取鴨疫里默菌aroA 缺失株與野生株RA－YM 株單菌落接種在TSB培養(yǎng)基中，37℃、200r／min搖床培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接至蔗糖、阿拉伯糖、精氨酸雙水解酶、明膠、尿素等生化鑒定管中，37℃靜置過夜。

1.2.4 鴨疫里默菌aroA 基因缺失株體外生長的測定 將RA－YMaroA 基因缺失株及RA－YM 株菌液分別轉(zhuǎn)接至TSB培養(yǎng)基中，37℃、200r／min振蕩培養(yǎng)，每隔1h分別取菌液測定其OD 600nm 值，繪制細(xì)菌體外生長曲線。

1.2.5 鴨疫里默菌aroA 基因缺失株LD50的測定

將90 只8 日 齡 櫻 桃 谷 肉 鴨 隨 機(jī) 分 為3 組，YM組（A 組）30只，aroA 基因缺失株組（B組）50只，對照組（C組）10只。A 組按照106、107和108CFU／mL；B組按照105、106、107、108和109CFU／mL 進(jìn)行腳蹼注射攻毒，每只0.5mL，C組注射等量PBS。觀察7d，記錄發(fā)病癥狀并記錄死亡數(shù)，計(jì)算LD50。

1.2.6 鴨疫里默菌aroA 基因缺失株在鴨體內(nèi)生長情況的測定 將21只8日齡的櫻桃谷肉鴨隨機(jī)分為3 組，YM 組（D 組）、aroA 基 因 缺 失 株 組（E組）各9只，對照組（F 組）3只。通過對D 組、E 組活鴨計(jì)數(shù)，D、E、F組按照105CFU／mL進(jìn)行腳蹼注射攻毒，每只0.5mL，對照組注射等量PBS。觀察發(fā)病癥狀，從D 組和F 組各取3只鴨于1、4、7d跖骨內(nèi)側(cè)靜脈采血同時(shí)各隨機(jī)選取3 只鴨處死并取心、肝、腦，研磨后倍比稀釋涂布TSA 平板，37℃靜置過夜培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 重 組 自 殺 性 質(zhì) 粒pRE112－LSR 及RA－YM aroA 基因缺失株的構(gòu)建

重 組 自 殺 性 質(zhì) 粒pRE112－LSR 經(jīng)Kpn Ⅰ＋Sac Ⅰ酶切鑒定正確（圖1），RA－YMaroA 缺失株中能擴(kuò)增出Spc基因（圖2）；將篩選到的RA－YM aroA 基因缺失株在含有Spc的TSB 培養(yǎng)基中盲傳，用引物Y1 和Y2、Z1 和Z2 對每一代都進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果顯示連續(xù)傳了5代都沒有擴(kuò)增出已缺失的aroA 基因片段，結(jié)果顯示篩選到的RA－YM aroA 基因缺失株能夠穩(wěn)定的傳代（圖3）。

圖1 pRE－Leftarm－Spc－Rightarm（pRE－LSR）酶切鑒定Fig.1 Identification of pRE－Leftarm－Spc－Rightarm（pRE－LSR）by enzyme digestion

2.2 鴨疫里默菌aroA 基因缺失株的生化鑒定

鴨疫里默菌aroA 缺失株與野生株RA－YM 株的對碳源和氮源的利用情況及其他表型見表2。aroA 缺失株與野生株RA－YM 株的生化特性比較，缺失株不再水解精氨酸。

2.3 鴨疫里默菌aroA 基因缺失株體外生長測定

根據(jù)鴨疫里默菌aroA 基因缺失株和親本株體外生長測定結(jié)果顯示，aroA 基因缺失株在TSB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h時(shí)的活菌數(shù)相比親本株有顯著的減少（圖4）。aroA 基因缺失株在對數(shù)期生長速度稍慢與親本株，并在穩(wěn)定期逐漸趨于一致（圖5）。

圖2 RA－YMaroA 缺失株中的Spc基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplifiction of Spc gene in RA－YM△aroA

圖3 RA－YMaroA 基因缺失株中aroA 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR products of aroA gene in RA－YM△aroA

表2 aroA 基因缺失株與RA－YM 株生化特性比較Table 2 Comparison of the biochemical characterstics between aroA mutant strain and RA－YM strain

2.4 鴨疫里默菌aroA 基因缺失株LD50的測定

鴨疫里默菌aroA 基因缺失株和親本株經(jīng)過腳蹼注射，并記錄死亡情況，通過改良寇氏法計(jì)算出鴨疫里默菌aroA 基因缺失株的LD50為1.9×106CFU，親本株的LD50為5.9×105CFU，毒力下降3倍左右。

2.5 鴨疫里默菌aroA 基因缺失株在鴨體內(nèi)生長情況的測定

鴨疫里默菌aroA 基因缺失株和親本株經(jīng)過腳蹼注射5×104CFU，每只0.5mL，在1、4、7d無菌采取血液及心、肝、腦組織，并對采取的血液及組織選擇合適稀釋度，涂布TSA平板計(jì)數(shù)結(jié)果可知，在櫻桃谷肉鴨體內(nèi)，接種菌等量情況下，鴨疫里默菌aroA 基因缺失株血液與心、肝、腦組織的載菌量與親本株相比有所下降，但差異不顯著（圖6～圖9）。

圖4 RA－YM 和RAΔaroA 在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h活菌計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.4 The live bacterial counts of RA－YM and RAΔaroA cultured in TSB culture medium for 12h

圖5 RA－YM 和RAΔaroA 體外生長曲線的測定結(jié)果Fig.5 The growth curves of RA－YM and RAΔaro Ain vitro

圖6 雛鴨血液載菌量的測定Fig.6 The quantity of isolated bacteria from duckling blood

圖7 雛鴨心臟載菌量的測定Fig.7 The quantity of isolated bacteria from duckling heart

圖8 雛鴨肝臟載菌量的測定Fig.8 The quantity of isolated bacteria from duckling liver

圖9 雛鴨腦載菌量的測定Fig.9 The quantity of isolated bacteria from duckling brain

3 討論

通過構(gòu)建自殺性重組質(zhì)粒，采用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法構(gòu)建RA－YMaroA 基因缺失株，該方法以同源重組為基礎(chǔ)，其同源片段長度是影響重組效率的重要因素之一。研究表明，同源片段在0.3kb～1.2kb范圍內(nèi)時(shí)重組效率較高［13］，本研究同源片段正是在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，并成功構(gòu)建了缺失株。

aroA 基因編碼5－烯醇丙酮酞莽草酸－3磷酸合成酶，是細(xì)菌催化芳香族氨基酸合成的關(guān)鍵基因，該基因被破壞后均可阻斷芳香族氨基酸的合成，導(dǎo)致細(xì)菌不能得到相應(yīng)的化合物。所以，當(dāng)aroA 基因缺失后，可以導(dǎo)致其細(xì)菌的生長能力變慢，毒力下降等生物學(xué)變 化［7－10］，而 其免 疫 原 性 相 對 較 好［14］。通過本研究發(fā)現(xiàn)，aroA 缺失突變株在體外與親本株相比，缺失株不再水解精氨酸，生長能力也有一定下降，證實(shí)了營養(yǎng)缺陷型基因aroA 對細(xì)菌的影響，且致病力試驗(yàn)結(jié)果顯示其LD50較親本株下降了3 倍左右，表明RA－YMaroA 缺失株的毒力有所減弱，與波氏桿菌aroA 基因缺失株的毒力下降類似［15］。

體內(nèi)載菌量試驗(yàn)表明，缺失株較親本株在血液和組織中的載菌量有所減少，其原因可能是由于缺失aroA 基因后導(dǎo)致營養(yǎng)供給不足而影響細(xì)菌的生長；但其差異并無體外培養(yǎng)顯著，發(fā)現(xiàn)其與遲緩愛德華氏菌aroA 基因缺失株體內(nèi)載菌試驗(yàn)有較大差異［10］，推測由于菌株是單基因缺失，其在體內(nèi)繁殖一段時(shí)間后，鴨疫里默菌的代償機(jī)制彌補(bǔ)了aroA基因缺失后對細(xì)菌生長的影響，具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法成功構(gòu)建了鴨疫里默菌aroA 基因缺失株，生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明RAYMaroA 基因缺失株相比野生株毒力有所減弱，生長減緩，為鴨疫里默菌分子致病機(jī)理的深入研究及基因工程疫苗的研制提供了科學(xué)依據(jù)。

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