劉英玉，夏利寧，劉俊飛，姚 剛，何啟蓋

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆天康畜牧科技有限公司，新疆昌吉830011；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北武漢430070）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬群上呼吸道的一種常在菌，但在特定條件下可以侵入機(jī)體并引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征，該病又稱為Glasser′s disease［1］。蔡旭旺等［2］對HPS做 了生化鑒定，大多數(shù)生化反應(yīng)較弱，對糖類發(fā)酵多不穩(wěn)定，可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D－核糖和麥芽糖，不發(fā)酵甘露糖、木糖、L－阿拉伯糖、蜜三糖，少數(shù)菌株發(fā)酵乳糖。

β－半乳糖苷酶（β－galactosidase，BgaC）又稱乳糖酶，是一種能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶，是白色或淡黃色粉末，無臭，微甜，分子質(zhì)量為100ku～850ku。在水中呈混沌液（大部分溶解），不溶于乙醇、丙酮。該酶主要分布在植物、微生物及哺乳動(dòng)物腸內(nèi)，其與食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生較為密切，因而研究較多。不同來源的微生物BgaC 在酶學(xué)性質(zhì)上差別較大，如分子質(zhì)量、最適溫度、最適pH 和熱穩(wěn)定性等。一般說來，霉菌產(chǎn)生的BgaC 是胞外酶，較耐熱、耐酸，不需要活化劑和穩(wěn)定劑，穩(wěn)定性較高，最適pH 偏酸性，一般在3～4 左右［3］。細(xì)菌BgaC 通常也是胞內(nèi)酶，最適pH 中性附近，最適溫度比酵母菌稍高，但高溫菌BgaC 的最適溫度可以很高，熱穩(wěn)定性也較好。大腸埃希菌（Escherichia coli）BgaC 是迄今為止研究最深入、了解最透徹的一種酶，商品化產(chǎn)品已大量應(yīng)用于生化分析中。近年來，肺炎鏈球菌β－半 乳 糖 苷 酶 的 研 究 比 較 多，Campuzano S 等［4］對輕型鏈球菌NCTC 12261菌株進(jìn)行β－半乳糖苷酶的克隆表達(dá)和酶活性特性研究，該酶編碼2 411個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為268ku，推測該蛋白包含1 個(gè)N－末端的信號肽和C－末端的膽堿結(jié)合域由5 個(gè)固定重復(fù)結(jié)構(gòu)組成，此結(jié)構(gòu)便于定向?yàn)榧?xì)胞壁分泌酶。酶比活力為2 500U／mg，最適pH 為6.0～6.5，最適溫度為30 ℃～40 ℃，在生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用具有特有的特性。

β－半乳糖苷酶基因被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究當(dāng)中，包括載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因研究、基因治療等多個(gè)領(lǐng)域。不同來源BgaC 在性質(zhì)上的差異為尋找優(yōu)良特性的酶源提供了可能性。副豬嗜血桿菌SH0165 菌株基因組DNA（GenBank accession number：CP001321）已完成測序［5］。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)存在BgaC 基因，本研究進(jìn)一步對BgaC氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并通過原核表達(dá)和β－半乳糖苷酶的活性測定來研究其的酶學(xué)特性，為其生產(chǎn)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 副豬嗜血桿菌SH0165用胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）培養(yǎng)基中加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）和新生牛血清來培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是在37 ℃，靜置培養(yǎng)24h～48h。E.coli菌株用LB 固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。副豬嗜血桿菌SH0165、質(zhì)粒pET32a、大腸埃希菌BL21（DE3）和感受態(tài)細(xì)菌DH5α，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物病原分子流行病學(xué)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 鄰硝基苯β－D－半乳吡喃糖苷（o－nitropheyl－β－D－galactopyranoside，ONPG）、β－巰基乙醇、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素，Sigma公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ和HindⅢ）、T4DNA 連接 酶、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；新生牛血清，四季青公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、小提質(zhì)粒試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；PCR 儀、SDS－PAGE垂直電泳儀、酶標(biāo)儀、TSA，Bio－Rad公司產(chǎn)品；凝膠電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Gene Company公司產(chǎn)品；NAD，中國上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；Ni－NTA 親和層析樹脂，Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BgaC 基因的克隆和分析 參考GenBank中HPS SH0165基因組的序列設(shè)計(jì)BgaC 基因的全長引物，引物序列為BgaC－S：CGGGATCCATGCCTTTCCAAATCGGCGAAA；BgaC－A：GGAAGC TTTTATAAGTTCTTCGTATTCAAC。引物序列增加了酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ，引物濃度10 μmol／L。通過煮沸法提取副豬嗜血桿菌SH0165的模板，反應(yīng)體系50μL：10×buffer 5μL dNTPs 4μL，Taq 酶0.25μL，模板4μL，引物各1μL，H2O 46.75μL。反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94℃30s，58 ℃30s，72 ℃2min，35循環(huán)；72 ℃10 min。取7μL反應(yīng)液進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)目的條帶則用天根公司的膠回收試劑盒回收目的條帶，將目的片段用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)過同樣酶切處理的pET－32a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，以PCR 和限制性酶切篩選獲得陽性克隆進(jìn)行測序，將測序得到的序列進(jìn)行拼接，然后利用Blastn對核苷酸序列進(jìn)行比對，用Blastp及ExPASy在線分析軟件對蛋白序列進(jìn)行分析，用Mega軟件對B－Gal基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.2 BgaC基因的表達(dá)和純化 測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌BL21，采用限制性酶切篩選獲得陽性克隆的BL21菌體培養(yǎng)至OD 600nm≈0.6，加終濃度為0.1mmol／L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5h，收集菌液，6 500r／min離心5min，去上清后用0.1倍體積的ddH2O 將菌體混懸均勻，在冰上用超聲波破碎菌體，12 000r／min離心30min，收集上清液。用Ni－NTA 親和層析樹脂（Invitrogen）純化含有（his）6標(biāo)簽的重組蛋白，參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。蛋白的純度用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）進(jìn)行分析驗(yàn)證，純化后的蛋白采用1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法）測定［6］，蛋白含量以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物。最終，重組蛋白HP0245EC凍存于－20 ℃。

1.2.3 β－半乳糖苷酶活性的測定 酶活性測定方法根據(jù)文獻(xiàn)［6］：將BgaC 蛋白用1mL 反應(yīng)液中［Z buffer，每50 mL：0.80 g Na2HPO4·7H2O（0.06mol／L），0.28 g NaH2PO4·H2O（0.04 mol／L），0.5mL KCl（0.01mol／L）；0.05mL Mg－SO4（0.001 mol／L），0.135 mLβ－巰基乙醇（BME）（0.05mol／L），加入40mL H2O 后調(diào)整pH 為7.0，定容至50mL，保存于4 ℃］混勻后，加入0.1mL生色底物ONPG（0.008g／mL）；在37 ℃下孵育30 min；加入0.5mL終止液（1mol／L Na2CO3）終止反應(yīng)；取溶液上清，測量420nm 和550nm 下的吸光度。酶活性測定采用一式3 份。1 個(gè)酶活性單位（U）是指在特定條件下，在1 min內(nèi)能水解1nmol底物的酶量。比活性為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用U／mg蛋白質(zhì)表示。

測定反應(yīng)液pH 對重組菌酶活性作用的影響，根據(jù)酶活性測定方法選擇pH5～9，孵育30min來測定420nm 和550nm 下的吸光度，其中pH5～5.5用弱鹽酸溶液調(diào)節(jié)，pH6～9用低濃度NaOH 調(diào)節(jié)。測定溫度對重組菌酶活性作用的影響，根據(jù)酶活性測定方法選擇溫度范圍在0 ℃～64 ℃［7］，孵育30min測定420nm和550nm 的吸光度。酶活性測定采用一式3份。

2 結(jié)果

2.1 副豬嗜血桿菌BgaC基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1 副豬嗜血桿菌BgaC 氨基酸序列同源性分析 通過BgaC－S和BgaC－A 引物擴(kuò)增副豬嗜血桿菌SH0165 菌 株，得 到1 791bp 的DNA 條 帶，將PCR 產(chǎn)物酶切后與載體pET－32a進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，挑取鑒定正確的重組菌進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中副豬嗜血桿菌SH0165 的BgaC 基 因 序 列（ACL31886.1）具 有100%的符合率。Blastp比對結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌BgaC 氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他微生物的BgaC基因氨基酸序列的相似性不高。其中，副豬嗜血桿菌BgaC 氨基酸序列與溶血性曼氏桿菌A1／A6PKL10BgaC（EXI62636.1）的相似性最高為82%。ExPASy 在線分析表明，副豬嗜血桿菌BgaC氨基酸序列是屬于糖苷水解酶家族35（glycoside hydrolase family 35，CH35）的成員家族，EC 3.2.1.－，催化質(zhì)子的供體是谷氨酸（Glu），β－半乳糖苷酶有1個(gè)TIM 筒結(jié)構(gòu)和2個(gè)完整的β區(qū)域。

所有序列是通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載的（NCBI數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址：www.ncbi.nlm.nih.gov）。多序列比對是根據(jù)Cheng W［8］和Jeong J K［9］，使用的軟件是Lasergene7.1和MEGA6。如圖1 所示，采用黑色三角形標(biāo)記半乳糖結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸，采用黑色圓形標(biāo)記3 個(gè)芳香族殘基位點(diǎn)色氨酸240 和色氨酸243，酪氨酸455，環(huán)LA（Trp240－Asp255）和環(huán)LB（Glu448－Ala461）結(jié)構(gòu)采用黑色箭頭表示，守衛(wèi)在活性位點(diǎn)口袋狀區(qū)域的表面啞鈴型通道處，且發(fā)現(xiàn)3個(gè)芳香族殘基位點(diǎn)色氨酸240和色氨酸243，酪氨酸455是此通道的峽部。副豬嗜血桿菌BgaC 有7 個(gè)高度保守的區(qū)域，采用灰色方框標(biāo)記，2個(gè)氨基末端區(qū)域（domains 1 和2），3 個(gè) 小 的 中 心 區(qū) 域 群（domains 3，4和5），2個(gè)小的羧基末端區(qū)域（domains 6和7）和NHL 同源序列（the NHL repeat homologous domain）。

圖1 序列比較不同病原體的BgaC同源性Fig.1 BgaC homology of sequence comparison of various organisms

2.1.2 副豬嗜血桿菌BgaC氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析 用Mega 6.0軟件對β－半乳糖苷酶基因的氨基酸序列與GenBank中已登錄的其他細(xì)菌的β－半乳糖苷酶基因氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，如圖2所示，12類的β－半乳糖苷酶基因被聚為3個(gè)大類群，副豬嗜血桿菌SH0165BgaC 基因與溶血性曼氏桿菌PKL10 親緣關(guān)系最近，并且與糞腸球菌DENG1（BgaB）、肺炎鏈球菌TIGR4、科里氏桿菌屬PW2、蘇云金芽胞桿菌和糞腸球菌DENG1（LacZ）聚為一類，擬南芥、大熊貓、芽胞桿菌、鏈霉菌屬M(fèi)g1和多形擬桿菌VPI－5482聚為一類，而乳酸桿菌單獨(dú)成一類，與副豬嗜血桿菌SH0165的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.2 重組pET－32a＋BgaC的表達(dá)和生物學(xué)特征

2.2.1 重組pET－32a＋BgaC 基因克隆與表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET32a＋BgaC轉(zhuǎn)入受體菌BL21，經(jīng)PCR鑒定轉(zhuǎn)化成功后，用IPTG 對重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體后進(jìn)行破碎，離心取上清作為粗體重組菌pET32a＋BgaC。用His標(biāo)簽純化樹脂純化離心后的上清，最后洗脫的蛋白是攜帶His標(biāo)簽的BgaC蛋白。通過SDS－PAGE 檢測重組菌pET32a＋BgaC和純化后BgaC 蛋白的表達(dá)情況（圖3），pET32a＋BgaC重組菌表達(dá)蛋白為82.4ku。

圖2 不同來源β－半乳糖苷酶基因的氨基酸序列聚類分析（括號中為各物種氨基酸序列GenBank登錄號）Fig.2 The cluster analysis based on alignment of amino acid sequences among UPGMA and some publishedβ－Gal genes of other species in GenBank database.Amino acid sequences accession №in GenBank of different species is in brackets

圖3 SDS－PAGE鑒定誘導(dǎo)表達(dá)pET32a＋BgaC重組蛋白和純化BgaC蛋白Fig.3 Identification of induced expression of pET32a＋BgaC recombinant protein and purified BgaC protein by SDS－PAGE

2.2.2 測定純化BgaC蛋白的酶活性和pET－32a＋BgaC重組蛋白的生物學(xué)特征 采用考馬斯亮藍(lán)法做出標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2＝0.978 4。在OD 595nm 處分別測定pET32a＋BgaC 重組蛋白和BgaC 純 化 蛋 白 的 含 量 為3.8 mg／mL 和0.7 mg／mL。按照酶活性測定方法取4μL BgaC純化蛋白（0.7mg／mL）作為底物來測定酶的活性，該酶的活性單位為5U，酶比活力為1 795U／mg。

取6μL 粗提的pET32a＋BgaC 重組蛋白（3.8 mg／mL）測定pH5～9范圍內(nèi)的酶活性（圖4），pH6～7時(shí)的酶活性可達(dá)到180U，在此pH 范圍內(nèi)副豬嗜血桿菌的BgaC活性能夠起到較理想的催化作用。取6 μL 粗 提 的pET32a＋BgaC 重 組 蛋 白（3.8 mg／mL）測定溫度在0℃～64℃的酶活性（圖5），溫度在30 ℃～37 ℃時(shí)的酶活性可達(dá)到180 U，30 ℃～37 ℃時(shí)副豬嗜血桿菌的BgaC活性的最佳溫度。

圖4 不同pH 的酶活性測定Fig.4 Detection of enzyme activities in various pHs

圖5 測定不同溫度的酶活性Fig.5 Detection of enzyme activities in various temperatures

3 討論

β－半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）廣泛的應(yīng)用于乳品工業(yè)和分子生物學(xué)研究［10－11］。β－半乳糖苷酶是糖苷水解酶的一種，可以將乳糖等含β－半乳糖苷雙糖和寡糖降解為單糖，為生物提供可利用的碳素營養(yǎng)［12］。經(jīng)過長期的自然進(jìn)化，微生物為了適應(yīng)不同的生活環(huán)境，自然界的廣泛分布的β－半乳糖苷酶被分成了許多種類。根據(jù)氨基酸序列的相似性和系統(tǒng)進(jìn)化分析，β－半乳糖苷酶可以分別歸入糖苷水解酶1、2、35 和42 家 族（glycoside hydrolase family，GHF）［13］。家族之間的氨基酸序列相似性很低，每個(gè)家族具有獨(dú)特的保守結(jié)構(gòu)域。為了方便研究糖苷酶的作用機(jī)理，Henrissat B［14］提出了一種新的序列分類法，該方法具有方便獲取糖苷酶結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)理信息，顯示酶之間相互進(jìn)化關(guān)系，預(yù)測未知酶的功能區(qū)域的優(yōu)點(diǎn)。隨著細(xì)菌全基因組測序的進(jìn)行，在更多的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了該酶。副豬嗜血桿菌BgaC是屬于CH35家族的成員，但其具體生物活性研究還沒有報(bào)道。Jeong J K 等［15］報(bào)道肺炎鏈球菌BgaC的序列比較，發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌BgaC 氨基酸序列中存在7個(gè)高度保守的區(qū)域，2個(gè)氨基末端區(qū)域，3個(gè)小的中心區(qū)域群，2個(gè)小的羧基末端區(qū)域和NHL同源序列［9］，通過構(gòu)建突變株研究發(fā)現(xiàn)BgaC蛋白在鏈球菌的黏附性和致病性方面具有重要意義。副豬嗜血桿菌BgaC氨基酸序列與肺炎鏈球菌TIGR4β－半乳糖苷酶的相似性雖然只有54%，但通過多序列比對，發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌BgaC也存在7個(gè)高度保守的區(qū)域，與肺炎鏈球菌報(bào)道的一致。越來越多的證據(jù)證明感染肺炎球菌可以導(dǎo)致宿主中聚糖發(fā)生變化，肺炎鏈球菌可以通過胞外糖苷酶活性修飾N 端－連接的聚糖，O 端－連接的聚糖和氨基多糖途徑。鏈球菌和副豬嗜血桿菌都是上呼吸道病原菌，且都是營養(yǎng)苛刻性細(xì)菌，菌落形態(tài)相似，豬只感染后臨床癥狀會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液，胸膜炎和腦膜炎的癥狀，預(yù)測肺炎鏈球菌與副豬嗜血桿菌在β－半乳糖苷酶具有類似的功能，值得我們進(jìn)一步研究。

1998年β－半乳糖苷酶被中國食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)列為食品添加劑新酶種。目前應(yīng)用于乳品工業(yè)的β－半乳糖苷酶多來自于酵母、曲霉菌或乳酸菌。Nguyen等提純了嗜酸乳桿菌R22菌株的LacLM，通過研究酶學(xué)特性確認(rèn)該酶可用于乳品工業(yè)［16］。BgaC除參與乳糖的消化吸收外，也是水解蛋白多糖的重要水解酶。主要用于乳品工業(yè)，加入乳品中可使乳糖分解為半乳糖和果糖而促進(jìn)其消化的酶，降低乳糖結(jié)晶析出并增加甜度。Campuzano S等［4］對慢型鏈球菌NCTC 12261菌株進(jìn)行β－半乳糖苷酶的研究，發(fā)現(xiàn)β－半乳糖苷酶由2 411個(gè)氨基酸編碼，分子質(zhì)量為268ku，酶比活力為2 500U／mg，最適pH為6.0～6.5，最適溫度為30 ℃～40 ℃。本研究發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)的副豬嗜血桿菌β－半乳糖苷酶分子質(zhì)量為82.4ku，酶比活力為1 795 U／mg，最適pH 為6.0～7.0，最適溫度為30 ℃～37 ℃。與慢型鏈球菌NCTC 12261菌的BgaC進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌BgaC 蛋白的分子質(zhì)量較小，但酶比活力、最適pH 和最適溫度的差別不是很大。副豬嗜血桿菌BgaC蛋白具有糖苷酶活性，能夠介導(dǎo)糖蛋白的降解。

β－半乳糖苷酶可用作酶免分析的標(biāo)記酶，中性β－半乳糖苷酶（SA－β－gal）是一種很好的可用于體內(nèi)外衰老研究的生物學(xué)標(biāo)志［3］。β－半乳糖苷酶基因在基因工程中的應(yīng)用包括作為報(bào)告基因構(gòu)建載體轉(zhuǎn)基因研究和基因治療等多個(gè)分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。目前分子生物學(xué)研究中使用的克隆載體一般都具有一段大腸埃希菌β－半乳糖苷酶的啟動(dòng)子及其α肽鏈的DNA 序列，可通過藍(lán)白菌的顏色變化篩選出陽性重組載體菌［17］。在基因治療方面，F(xiàn)ukui T 等［18］為了探討基因治療用于口腔癌的可能性，將含β－半乳糖苷酶基因的腺伴隨病毒載體轉(zhuǎn)染人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株，通過檢測β－半乳糖苷酶的表達(dá)情況來研究轉(zhuǎn)染的效率。Terra V S等［19］研究表明肺炎鏈球菌中β－半乳糖苷酶能夠從宿主糖苷類代謝中獲得能量，證明宿主體內(nèi)有效的糖蛋白降解與肺炎球菌的毒力有關(guān)，該蛋白可用于分子診斷和亞單位疫苗的候選基因。副豬嗜血桿菌β－半乳糖苷酶是分子質(zhì)量較小的糖苷酶蛋白，在氨基酸序列上存在高度保守的區(qū)域，該蛋白也具有較高糖苷酶活性，因此，在生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

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