韓玉霞，孟露萍，孫志華，劉 娟，張 輝，陳創(chuàng)夫

（石河子大學動物科技學院，新疆石河子832000）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是一種重要的動物疫病病原，在全球范圍內(nèi)廣泛分布。它能夠感染牛、羊、駱駝、鹿等動物，引發(fā)牛病毒性腹瀉－黏膜病；還能夠造成動物源性產(chǎn)品如冷凍胚胎、精液等的污染，造成重大的畜牧業(yè)經(jīng)濟損失。BVDV 是黃病毒科瘟病毒屬的成員之一，為單股正鏈RNA 病毒。根據(jù)能否使感染的細胞產(chǎn)生病變，將BVDV 分為致細胞病變型（cp 型）和非致細胞病變型（ncp 型）。BVDV 能夠感染懷孕母畜，造成胎兒免疫耐受，從而發(fā)展為持續(xù)性感染（persistent infection，PI），感染病畜終生帶毒、排毒，是畜群中主要的傳染源［1］。目前，我國尚無有效的疫苗用于控制該病的發(fā)生與流行，因此研究BVDV 致病的分子機制將為研發(fā)新型有效的疫苗提供基礎(chǔ)資料。

類泛素蛋白質(zhì)家族（ubiquitin like protein，UBL）是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一類小分子蛋白質(zhì)，含有與泛素高度同源的結(jié)構(gòu)域，在細胞生長調(diào)控中發(fā)揮多種重要作用［2］。小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin－related modifier，SUMO）是一種重要的類泛素蛋白，在生物進化過程中高度保守［3］。作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，SUMO 調(diào)控蛋白質(zhì)間相互作用、參與DNA 的復(fù)制與修復(fù)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程［4］。研究表明，SUMO 化修飾能夠促進腸道病毒71型3C 蛋白質(zhì)降解，減少病毒的復(fù)制與細胞凋亡［5］；豬瘟病毒核心蛋白與SUMO 化通路蛋白的互作影響了病毒的毒力［6］；牛痘病毒E3蛋白能與細胞SUMO 共價結(jié)合，調(diào)控E3 的轉(zhuǎn)錄活性［7］。BVDV感染能否引起細胞SUMO 通路的改變，進而影響病毒在胞內(nèi)的復(fù)制水平，目前尚未見報道。因此，本文通過實時熒光定量PCR 檢測不同生物型BVDV 感染對MDBK 細胞SUMO 基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期豐富BVDV 致病機制的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 致細胞病變型BVDV 標準株NADL毒株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；非致細胞病變型BVDV 分離株shz132毒株由石河子大學人獸共患病實驗室分離、鑒定并保存。MDBK 細胞，購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清FBS，美國Gibco公司產(chǎn)品；SYBR Green I熒光染料，德國Roche公司產(chǎn)品；超純RNA 提取試劑盒、HiFi－MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒，康為世紀產(chǎn)品；其他生化試劑皆為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主 要 儀 器 LightCycler○R480 Ⅱ熒 光 定 量PCR 儀，德國Roche公司產(chǎn)品；DNP－9162CO2恒溫培養(yǎng)箱；Centrifuge－5415D 低溫高速離心機、微量移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品；NanoDrop－2000核酸定量儀，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；細胞凍存盒，美國Nalgene公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參照GenBank中已公布的牛源SUMO1（登錄號：NM－001035458.1）、SUMO2（登錄號：NM－001005849.1）、SUMO3（登錄號：NP－008867）、Ubc9（登錄號：NM－001099372.1）、GAPDH（登錄號：NM－001034034.2）基因的核苷酸序列，RT－PCR 引物設(shè)計需遵循以下基本原則：①引物長度在18bp～27bp 之間；②引物GC 含量在40%～60%之間，上、下游引物GC 含量相差不能太大；③Tm 值在55℃～65℃之間，上、下游引物Tm值相差不能太大；④產(chǎn)物長度在100bp～250bp之間；⑤引物與模板特異性結(jié)合，不出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體及錯配。根據(jù)以上原則，采用Primer 5.0軟件分別設(shè)計以上基因熒光定量PCR特異性引物（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR 引物設(shè)計Table 1 Primer sequences of fluorescent quantitative PCR

1.2.2 MDBK 細胞的培養(yǎng) 用含100 mL／L FBS的DMEM 細胞培養(yǎng)液復(fù)蘇MDBK 細胞，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行細胞常規(guī)培養(yǎng)。待細胞長成單層且融合度接近100%時，用含0.2g／L EDTA－Na2的2.5g／L 的胰酶進行消化傳代培養(yǎng)。

1.2.3 BVDV 毒株的增殖 待MDBK 細胞長成單層且融合度達到70%～80%時，棄去原培養(yǎng)液，PBS清洗細胞3遍，加入一定體積的無血清的DMEM 原液，并按培養(yǎng)液體積與病毒液體積10∶1的比例接種BVDV NADL 和BVDV shz132病毒，在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中病毒吸附細胞2h后，更換為含20 mL／L FBS 的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48h后待BVDV NADL 接種組細胞病變達到80%以上時，反復(fù)凍融細胞3次，使之完全破裂釋放病毒，收集病毒液，1 000r／min 離心5min，0.45μm 濾膜過濾后保存在－80 ℃冰箱。接種病毒48h后，BVDV shz132接種組細胞并不產(chǎn)生病變，用相同的方法收集病毒液。

1.2.4 BVDV 病毒液的濃縮 采用Millipore超濾管對收集的病毒液進行濃縮。將收集的所有病毒液充分混勻，0.45μm 濾膜再次過濾后，取15mL濾液加入超濾管，4 ℃、5 000r／mim 離心30 min～60 min，至超濾管中濃縮液體積達1mL 左右。將收集的所有濃縮液混勻，分裝，保存在－80 ℃冰箱。

1.2.5 BVDV 病毒拷貝數(shù)的測定 通過熒光定量PCR，絕對定量的方法測定BVDV NADL 和BVDV shz132濃縮病毒液的拷貝數(shù)。濃縮后分裝的BVDV NADL 和BVDV shz 132 病 毒 液 各 取3 管，每 管0.5mL，按照康為世紀超純RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA。采用NanoDrop－2000核酸定量儀測定收集的RNA 溶液濃度及純度。取相同體積的RNA 溶液，使用康為世紀HiFi－MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

通過Roche LightCycler○R480 Ⅱ熒光定量PCR儀測定兩種BVDV 病毒液的Ct值。熒光定量PCR反應(yīng) 為10μL 體 系：SYBR Green Ⅰ5 μL，無 菌ddH2O 3.6μL，E0基因10μmol／L 上、下游引物各0.2μL，cDNA 模板1μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃5min；95 ℃15s，58 ℃30s，在58 ℃收集熒光，50個循環(huán)。基因擴增曲線、熔解曲線及樣品Ct值由熒光定量PCR 儀軟件自動生成，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

根據(jù)實驗室已構(gòu)建成功的BVDV E0 基因標準曲線：y＝－3.401x＋11.80，其中x 表示質(zhì)粒濃度的對數(shù)值，y值表示Ct值，計算E0基因重組質(zhì)粒濃度的對數(shù)值。依據(jù)以下公式計算得到病毒拷貝數(shù)：

其中，質(zhì)粒濃度μg／mL；NA，阿伏伽德羅常數(shù)，6.02×1023；DNA 片段長度：載體長度＋基因片段長度；DNA 片段100bp相當于分子量為6.6×105dt；拷貝數(shù)的最后單位是copies／mL。

1.2.6 BVDV NADL病毒TCID50的測定 將長成單層且融合度接近100%的MDBK 細胞消化后接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種約1×104個細胞。待每個孔的細胞長成單層約60%的豐度即可接種病毒。使用多道加樣器吸去原培養(yǎng)液，PBS清洗細胞3遍，每孔加入100μL 無血清的DMEM 原液。在無菌EP管中用無血清的DMEM 原液將NADL 濃縮病毒液進行10倍倍比稀釋（10－1，10－2，...，10－10），每個稀釋度接種8個孔，每孔加入100μL 病毒液。設(shè)空白細胞對照組。將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱吸附2h，更換為含20mL／L FBS的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，顯微鏡下觀察細胞病變，記錄每個稀釋度病變的孔數(shù)，按照Reed－Muench法計算病毒的TCID50。試驗重復(fù)3次。計算公式如下：

1.2.7 病毒感染MDBK 細胞 將MDBK 細胞按照5.0×105個／孔接種于六孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長成單層且融合度達到70%～80%時，按照100 TCID50接種BVDV NADL，且根據(jù)100 TCID50BVDV NADL所含有的病毒拷貝數(shù)，接種相同拷貝數(shù)的BVDV shz132。接種病毒后，在37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中吸附2h，更換為含20 mL／L FBS 的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)空白細胞對照。病毒感染后4、12、24、48h，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。PBS清洗細胞2遍，每孔加入1mL 裂解液buffer RLT，反復(fù)吹打后收集細胞，置于－80 ℃冰箱保存。

1.2.8 RT－qPCR 檢測細胞中類泛素基因的mRNA 水平 按照康為世紀超純RNA 提取試劑盒說明書提取收集的所有細胞的總RNA，按照2μg對總RNA 進行定量，并將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，進行RT－qPCR 檢測。熒光定量PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)與1.2.5相同。以GAPDH 基因為內(nèi)參基因，采用2－△△Ct法對每個基因的相對表達量進行分析。采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 BVDV 拷貝數(shù)的測定

提取NADL和shz 132病毒相同體積病毒液的總RNA，并將相同體積的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以1μL cDNA 為模板進行熒光定量PCR 反應(yīng)，并計算病毒拷貝數(shù)。圖1為兩種病毒液E0基因的擴增曲線與熔解曲線。NADL 和shz 132 病毒液E0基因的Ct值分別為33.72±1.34，33.06±0.81，兩者差異不顯著（P＞0.05）。通過E0 基因標準曲線及公式計算可得，NADL 和shz 132 病毒液拷貝數(shù)分別為1.13×1011copies／mL 和1.77×1011copies／mL。

2.2 BVDV NADL TCID50的測定

病毒接種細胞48h 后，顯微鏡下觀察細胞病變，記錄每個稀釋度病變的孔數(shù)，按照Reed－Muench法計算病毒的TCID50。每個稀釋度的細胞病變孔數(shù)見表2。按照公式計算可得BVDV NADL病毒液TCID50為10－4.9TCID50／0.1mL。

2.3 BVDV 感染后MDBK 細胞形態(tài)的變化

按照100TCID50接種cp BVDV NADL 及相同病毒拷貝數(shù)的ncp BVDV shz 132，接毒后分別培養(yǎng)4、12、24、48h，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。接種NADL 4h和12h 后，MDBK 細胞沒有發(fā)生病變，24h后細胞出現(xiàn)輕微的病變，48h后細胞發(fā)生大量的病變，細胞核濃縮，胞膜不整齊、模糊，部分細胞出現(xiàn)裂解。對照組及shz 132病毒接種組細胞在任何時間點都未發(fā)生病變。

2.4 RT－qPCR檢測細胞中類泛素基因的mRNA水平

兩種生物型BVDV 感染MDBK 細胞4、12、24、48h，以GAPDH 基因為內(nèi)參基因，通過RT－qPCR方法分別對細胞類泛素基因SUMO1、SUMO2、SUMO3及Ubc9的表達量進行相對定量分析。

2.4.1 基因的擴增曲線與熔解曲線分析 如圖2所示，可見各個基因擴增曲線拐點清晰，整體平行性好，斜率大，擴增效率高，且基因的熔解曲線都只存在一個特異性的峰值，Tm 值在80 ℃～90 ℃之間，不存在非特異性擴增，因此RT－qPCR 所用引物特異性高，所得Ct值有效可靠。

圖1 BVDV E0基因的擴增曲線與熔解曲線Fig.1 Amplification curves and melting curves of E0gene of BVDV

表2 病毒TCID50計算表Table 2 Table for calculating TCID50of virus

2.4.2 類泛素基因的相對表達量分析 致細胞病變型和非致細胞病變型BVDV 感染MDBK 細胞不同時間段后，對類泛素基因的表達量進行熒光定量PCR 檢測。從圖3中可以看出，隨著感染時間的延長，對照組細胞SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9基因的相對表達量都基本保持不變（P＞0.05）。在BVDV NADL 株感染組和BVDV shz 132 株感染組，SUMO1、SUMO2 及SUMO3 基 因 的 相 對 表 達量都呈現(xiàn)相同的變化趨勢，在感染后12h上升，感染后24h下降，感染后48h再次上升。在感染后24 h，它們的相對表達量降至最低值，與對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。不同的是，在BVDV shz 132株感染的細胞中SUMO1、SUMO2及SUMO3基因的相對表達量都高于或接近于BVDV NADL 株感染的細胞。Ubc9 基因的相對表達量呈現(xiàn)出完全相反的變化趨勢，在感染后12h下降，感染后24h上升，感染后48h再次下降。重要的是，除48h外，在其余感染時間BVDV shz 132株感染組中Ubc9基因的相對表達量都低于BVDV NADL株感染組。

3 討論

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是細胞蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學功能的重要調(diào)節(jié)機制之一。SUMO 是一種新發(fā)現(xiàn)的泛素樣分子，能夠動態(tài)可逆的修飾靶蛋白，參與靶蛋白的定位、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性、參與維持基因組的完整性、調(diào)節(jié)蛋白的核漿轉(zhuǎn)運及信號轉(zhuǎn)導、調(diào)節(jié)病毒感染［8－9］。目前，已發(fā)現(xiàn)哺乳動物4種SUMO 基因，分別是SUMO1、SUMO2、SUMO3 和SUMO4。SUMO1、SUMO2和SUMO3 基因在大部分組織中表達，而SUMO4 主要在腎臟、淋巴結(jié)和脾臟中表達［10］。Ubc9是SUMO 修飾中唯一的E2 結(jié)合酶，將SUMO 分子與靶蛋白相結(jié)合。由于SUMO4 基因核苷酸序列未公布，本文以SUMO1、SUMO2、SUMO3和Ubc9 為研究對象，探索BVDV 感染對細胞SUMO 系統(tǒng)的影響。

圖2 類泛素基因的擴增曲線與熔解曲線Fig.2 Amplification curves and melting curves of ubiquitin like genes

圖3 不同生物型BVDV 感染MDBK 后，類泛素基因SUMO1、SUMO2、SUMO3及Ubc9的相對表達量Fig.3 Relative expression values of SUMO1，SUMO2，SUMO3，Ubc9genes of MDBK cells infected with different biotype BVDV strains

本研究發(fā)現(xiàn)，BVDV 感染調(diào)控了細胞SUMO 化修飾的轉(zhuǎn)錄水平，感染后24h，SUMO1、SUMO2及SUMO3基因的相對表達量下降，差異極顯著，表明病毒感染抑制了宿主SUMO 化水平，這與Chen L M 等［11］的 觀點一 致，也 說 明MDBK 細 胞SUMO 化修飾參與了BVDV 病毒在胞內(nèi)的活動。向巨噬細胞中過表達SUMO1蛋白，能夠提高布魯菌引起的細胞凋亡，抑制布魯菌在胞內(nèi)的生存［12］，那么SUMO 能否調(diào)控CP BVDV 感染誘導的MDBK細胞凋亡［13］，仍有待于進一步研究。在大多數(shù)情況下，病毒蛋白發(fā)生SUMO 化修飾能夠促進病毒的復(fù)制，有利于持續(xù)性感染［11］，與此結(jié)論一致的是，在本研究中，BVDV shz 132 毒株感染細胞后SUMO1、SUMO2及SUMO3基因的相對表達量都要高于或接近于BVDV NADL株感染的細胞。也就是說，不同生物型BVDV 毒株感染引起細胞SUMO 基因轉(zhuǎn)錄水平不同程度的變化，可能與臨床上不同的病理變化相關(guān)。宿主細胞SUMO 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，如何影響B(tài)VDV 在胞內(nèi)的復(fù)制；SUMO 蛋白可與哪些病毒蛋白共價結(jié)合，進而影響病毒在胞內(nèi)的活動。以上問題都有助于闡述BVDV 復(fù)雜的致病機制，也可能為新型疫苗的研發(fā)提供一個新的靶點。

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