孔祥溢 關(guān) 健 楊 義 李永寧 馬文斌 幸 兵 王任直

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蜂蜜促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的免疫調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

孔祥溢 關(guān) 健 楊 義 李永寧 馬文斌 幸 兵 王任直

蜂蜜是地球上現(xiàn)存的最古老的食物之一，不僅具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，而且近年來在促進(jìn)傷口愈合方面的作用越來越被重視。蜂蜜有著廣譜的抗菌作用，這是其在促進(jìn)傷口快速愈合方面獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，其具體機(jī)制目前已被較為完備地闡述。近年來，蜂蜜在免疫調(diào)控方面的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)并廣泛探索，包括：①刺激或抑制單核-吞噬細(xì)胞合成與釋放特定細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、白介素(interleukin, IL)-1β等；②調(diào)控氧化應(yīng)激，如中性粒細(xì)胞釋放活性氧簇(reactive oxygen species, ROSs)等；③調(diào)控角化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等的炎性反應(yīng)。對(duì)蜂蜜免疫調(diào)控作用的闡述和探索，對(duì)于更好地將蜂蜜應(yīng)用于創(chuàng)傷的臨床治療至關(guān)重要。

蜂蜜 創(chuàng)傷愈合 細(xì)胞因子 氧化應(yīng)激 炎性反應(yīng)

蜂蜜是地球上現(xiàn)存的最古老的食物之一，不僅可以食用、營(yíng)養(yǎng)美味，而且不會(huì)變質(zhì)。早在20世紀(jì)初，研究者就發(fā)現(xiàn)蜂蜜具有促進(jìn)傷口愈合的功效。隨著1940年抗生素的誕生，蜂蜜的這一應(yīng)用逐漸減少[1]。然而，隨著近年來抗生素濫用引起的細(xì)菌耐藥現(xiàn)象的不斷出現(xiàn)，蜂蜜促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用再次被世人重視[2]。

蜂蜜有著廣譜的抗菌作用，這種抗菌作用是蜂蜜在促進(jìn)傷口快速愈合方面獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)。過去幾十年，蜂蜜的抗菌活性被廣泛研究[3～5]。Majtan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，防御素-1是蜂蜜中主要的抗菌因子，不同花粉來源的蜂蜜其含量有著很大的不同。Kwakman等[7]則發(fā)現(xiàn)，某些蜂蜜中植物素的含量明顯高于其他花粉來源的蜂蜜，而這些蜂蜜的抗菌能力似乎更強(qiáng)。許多具有抗菌活性的蜂蜜，如新西蘭的麥盧卡蜂蜜、荷蘭的RS蜂蜜已經(jīng)被列為“醫(yī)療級(jí)蜂蜜”，并已用于臨床[5, 7]。除防御素、植物素等抗菌成分外，蜂蜜中還含有蜜蜂來源或植物來源的免疫調(diào)節(jié)成分，同樣可以促進(jìn)傷口或潰瘍的愈合[8]。蜂蜜中的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)近年來同樣被廣泛研究，幾種主要的免疫調(diào)節(jié)因子見表1。

一、蜂蜜對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)控作用

表1 不同種類蜂蜜的免疫調(diào)控成分及其在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合方面的生物學(xué)功能

皮膚覆蓋全身，它使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機(jī)械性、化學(xué)性和病原微生物性的侵襲。皮膚具有兩個(gè)方面的屏障作用：一方面防止體內(nèi)水分、電解質(zhì)、其他物質(zhì)丟失；另一方面阻止外界有害物質(zhì)的侵入。皮膚受損后，多種免疫細(xì)胞被激活，其中最主要的即巨噬細(xì)胞，具有強(qiáng)大的吞噬作用和抗原遞呈作用。皮膚中的巨噬細(xì)胞主要由外周血液中的單核細(xì)胞演變而來。當(dāng)皮膚受損后，單核細(xì)胞透過血管壁并釋放酶類裂解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，隨后遷往皮膚創(chuàng)面。巨噬細(xì)胞可以通過經(jīng)典途徑(即脂多糖和干擾素-γ)被激活，也可被IL-4和IL-13激活[14]。由脂多糖激活的巨噬細(xì)胞能夠合成并分泌炎性介質(zhì)，包括TNF-α、NO和IL-6。而IL-4或IL-13激活的巨噬細(xì)胞則在促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)、促進(jìn)血管生成方面起到重要作用。此外，巨噬細(xì)胞尚可分泌多種其他細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)新鮮毛細(xì)血管的生長(zhǎng)、膠原合成及纖維化[15]。

近年來，為了探究蜂蜜促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面的分子機(jī)制，巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞逐漸發(fā)展為一種較為成熟的用來監(jiān)測(cè)和驗(yàn)證蜂蜜中免疫調(diào)節(jié)因子活性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。Tonks等[16]認(rèn)為蜂蜜之所以可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其機(jī)制就在于創(chuàng)周單核-吞噬細(xì)胞分泌促炎因子，調(diào)控炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，用1%(w/v)的麥蘆卡蜂蜜或蜂王漿孵化后，單核細(xì)胞系MM6(Mono Mac 6)及人外周單核細(xì)胞能釋放細(xì)胞因子，顯示出較強(qiáng)的免疫調(diào)控作用。與普通糖水(人造蜂蜜)相比較，各種類型的蜂蜜都可誘導(dǎo)并刺激MM6、人外周血單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β及IL-6。這其中尤以蜂王漿的效應(yīng)最強(qiáng)。研究人員同時(shí)指出，蜂蜜中雖存在濃度為56～690pg/ml的濃縮內(nèi)毒素，但其不良反應(yīng)基本可以忽略不計(jì)，而蜂蜜對(duì)MM6的刺激作用與內(nèi)毒素并無關(guān)系[17]。值得注意的是，MM6細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素很敏感，蜂蜜中的內(nèi)毒素可能對(duì)MM6起作用。內(nèi)毒素又稱“熱源”，其化學(xué)成分有磷脂多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，其毒性成分主要為類脂質(zhì)A，可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等；多黏菌素B可拮抗內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的危害作用。低至3.1pg/ml的內(nèi)毒素即可對(duì)MM6產(chǎn)生刺激作用，而100pg/ml的內(nèi)毒素將刺激MM6細(xì)胞釋放大量的IL-6[18]。

Timm等[17]曾比較了4種不同蜂蜜(含麥盧卡蜂蜜)刺激MM6細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子IL-6的能力，結(jié)果顯示18h后，天然蜂蜜刺激產(chǎn)生IL-6的量最大。他們認(rèn)為蜂蜜中具有免疫調(diào)控作用的成分具有以下特點(diǎn)：①耐熱；②相對(duì)分子質(zhì)量非常大(>20kDa)；③多黏菌素B(具有內(nèi)毒素拮抗活性)可破壞蜂蜜的免疫調(diào)控作用。這些特點(diǎn)與內(nèi)毒素完全相符。然而，Tonks等[10]則認(rèn)為蜂蜜被加熱以后，其刺激MM6細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的活性大大下降；而且即便在多黏菌素B存在的情況下，蜂蜜刺激MM6細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用依然能被觀察到。Gannabathula等[9]也做了類似研究，對(duì)新西蘭蜂蜜刺激單核細(xì)胞系THP-1和U937產(chǎn)生TNF-α的作用進(jìn)行了觀察和對(duì)比。

很多天然多肽、天然蛋白都有非特異性的免疫調(diào)控作用。一般認(rèn)為，這種免疫調(diào)控作用的生物學(xué)機(jī)制即上述天然多肽或蛋白可特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的特定受體，激活下游的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終影響免疫因子的合成和分泌。業(yè)已證明，糖基化蛋白即具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的能力，而TNF-α可介導(dǎo)組織損傷的修復(fù)。Majtan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，天然合金歡蜂蜜可刺激鼠類巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，而去蛋白的蜂蜜則無此作用，這表明蜂蜜中起免疫調(diào)控作用的可能是其蛋白成分(主要為55kDa的蜂王漿糖蛋白)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，蜂王漿糖蛋白經(jīng)過適當(dāng)?shù)慕怆孟?，其免疫調(diào)節(jié)作用更強(qiáng)；蜂王漿蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域才是免疫調(diào)控的核心部分[11]。因此，可以推測(cè)蜂蜜中的內(nèi)毒素可能在單核-吞噬細(xì)胞的激活過程中起重要作用。另外，Majtan等[12]發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的表皮角化細(xì)胞在濃度為25μg/ml的蜂王漿糖蛋白的刺激作用下，產(chǎn)生TNF-α mRNA的量是原來的兩倍。在蜂王漿糖蛋白作用下，人角化細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的量也成倍增加。蜂蜜中另一免疫調(diào)控蛋白是Ⅱ型阿拉伯半乳糖蛋白，分子質(zhì)量為110kDa，可刺激單核細(xì)胞系THP-1和U937產(chǎn)生TNF-α[9]。

經(jīng)過γ射線照射消毒后，蜂蜜中的動(dòng)植物成分如細(xì)菌孢子等均失去活性，但內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu)保持不變，此時(shí)蜂蜜仍然具有免疫調(diào)控作用。因此，雖然蜂蜜中有很多天然的動(dòng)植物成分，有研究者推測(cè)，真正起免疫調(diào)控作用的還是其中的內(nèi)毒素。內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，叫做脂多糖(LPSs)。其分子結(jié)構(gòu)包括親水的多聚糖部分和疏水的類脂質(zhì)A。內(nèi)毒素刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子，而這些細(xì)胞因子在生理狀況下受到嚴(yán)密地調(diào)控，因?yàn)檫^量的細(xì)胞因子會(huì)通過級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)誘發(fā)機(jī)體炎性反應(yīng)，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的敗血癥性休克。

二、蜂蜜與ROSs的關(guān)系

近10余年來，許多研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜能夠快速地抑制感染，減輕炎性反應(yīng)、水腫、疼痛和異味，而且基本沒有不良反應(yīng)。一般認(rèn)為，蜂蜜的上述作用實(shí)質(zhì)上是其抗炎、抗氧化應(yīng)激的特性[19]。眾所周知，慢性創(chuàng)面組織因浸潤(rùn)有大量的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并釋放大量ROS，被認(rèn)為是高氧化還原電位的環(huán)境。ROS是一種強(qiáng)氧化劑，其意義在于廣泛殺滅微生物，包括細(xì)菌、芽胞、病毒、真菌等，其殺滅速度較氯快600～3000倍。但長(zhǎng)期暴露于過量的ROS中，組織細(xì)胞將嚴(yán)重?fù)p傷，極不利于創(chuàng)面愈合[20]。阻斷慢性炎癥循環(huán)的關(guān)鍵在于清除ROS，蜂蜜的抗氧化性質(zhì)使其成為促進(jìn)創(chuàng)面愈合的天然藥物。蜂蜜中的抗氧化物質(zhì)包括黃酮類、酚醛酸、過氧化物酶、過氧化物異構(gòu)酶、抗壞血酸、類胡蘿卜素及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。不同花粉和地域來源的蜂蜜，其抗氧化物質(zhì)的含量與成分有所不同[21]。Habtermariam[22]研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物(如咖啡酸等)可有效地抑制L929細(xì)胞中TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)。Kassim等[23]在一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，受到內(nèi)毒素或IFN-γ刺激的細(xì)胞系RAW246.7和巨噬細(xì)胞在蜂蜜甲醛提取物或乙酸乙酯提取物的作用下可減少NO的產(chǎn)生；而乙酸乙酯提取物的抑NO作用較甲醛更強(qiáng)。但相比于乙酸乙酯提取物，甲醛提取物中含有更多的酚類化合物，包括鞣花酸、五倍子酸、楊梅酮酸、綠原酸和咖啡酸等。Woo等[24]發(fā)現(xiàn)在許多植物提取物、蜂蜜及蜂膠中含有白楊素。白楊素是一種天然的黃酮類物質(zhì)，具有抑制巨噬細(xì)胞環(huán)氧酶-2(COX-2)基因表達(dá)的作用，該作用是通過阻斷LPS與核因子IL-6的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。在細(xì)胞炎性反應(yīng)中，IL-6是起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。

蜂蜜抑制氧化應(yīng)激的具體機(jī)制尚不十分清楚。目前認(rèn)為有兩種可能，一是蜂蜜中的還原性物質(zhì)抑制中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)；二是直接清除ROS。Leong等[25]研究發(fā)現(xiàn)，蜂蜜對(duì)中性粒細(xì)胞ROS產(chǎn)生的抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)，但卻與蜂蜜中酚醛酸等的含量無直接關(guān)系，這提示蜂蜜的抗氧化應(yīng)激作用主要是通過抑制中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)介導(dǎo)的。

Fukuda等[8]在1項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，叢林蜂蜜對(duì)中性粒細(xì)胞有趨化作用。這項(xiàng)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，將叢林蜂蜜注入小鼠的腫瘤組織后，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤壞死區(qū)域，產(chǎn)生大量的ROS，而腫瘤的體積則相應(yīng)減小。綜合這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出，蜂蜜既能減少ROS的產(chǎn)生，又能趨化中性粒細(xì)胞并促進(jìn)ROS產(chǎn)生，這取決于特定的微環(huán)境。

三、蜂蜜的抗炎作用

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。在炎癥過程中，一方面通過炎癥充血和滲出反應(yīng)，以稀釋、殺傷和包圍損傷因子，另一方面損傷因子直接或間接造成組織和細(xì)胞的破壞。炎癥的發(fā)生需要炎性介質(zhì)的參與，如內(nèi)毒素、細(xì)胞因子和NO等，因此，抑制炎性反應(yīng)的關(guān)鍵是控制炎性介質(zhì)。蜂蜜通過抗炎作用，可以減輕水腫和滲出，縮小瘢痕，促進(jìn)炎性創(chuàng)傷的愈合[26]。蜂蜜的抗炎作用表現(xiàn)在多個(gè)方面：①阻斷經(jīng)典補(bǔ)體途徑；②抑制ROS的產(chǎn)生；③抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)[27]；④抑制COX-2和NO的合成與釋放[28]；⑤抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的作用(在慢性創(chuàng)傷組織中促進(jìn)組織基質(zhì)和促細(xì)胞生長(zhǎng)因子的降解)[13]。

然而，Majtan等[12]發(fā)現(xiàn)，對(duì)于原代培養(yǎng)的人角化細(xì)胞，1% (w/v)的金合歡蜂蜜可顯著增加MMP-9 mRNA的表達(dá)。此外，在人體皮下注射適量蜂蜜24h后，皮下基膜和血管附近MMP-9、Ⅳ型膠原的含量顯著增高[13]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與先前的結(jié)論矛盾，因此，筆者推測(cè)，蜂蜜作為一種免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，既有抗炎作用，又有促炎作用，其決定因素為細(xì)胞微環(huán)境。當(dāng)微環(huán)境中炎性介質(zhì)在低水平時(shí)，蜂蜜刺激炎性細(xì)胞因子和MMP-9的表達(dá)；而微環(huán)境發(fā)生炎性浸潤(rùn)時(shí)，蜂蜜則抑制炎性反應(yīng)和MMP-9的表達(dá)。這個(gè)假說在理論上為蜂蜜治療皮膚炎性病變打開了新的大門。

總之，富含黃酮類和酚類化合物的蜂蜜在抗炎方面的作用已被部分認(rèn)識(shí)。但是，這些物質(zhì)在體內(nèi)抗炎的詳細(xì)機(jī)制及相互作用仍需進(jìn)一步研究。當(dāng)傳統(tǒng)創(chuàng)傷治療方法不奏效或者療效不明顯時(shí)，蜂蜜的應(yīng)用前景更顯廣闊。蜂蜜的抗菌作用目前已被較為完備地闡述，但其調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、對(duì)抗氧化應(yīng)激及炎癥調(diào)節(jié)方面的作用仍需進(jìn)一步深入探索，這對(duì)于更好地將蜂蜜應(yīng)用于創(chuàng)傷的臨床治療至關(guān)重要。

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(修回日期：2015-03-10)

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楊義,電子信箱: yangyipumch@sina.com

R593

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.006

2015-03-05)