胡如西 陶 薇 傅 婷 何卓晶 賈 嵐 洪 艷 陳 勇

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CD40L對(duì)單純皰疹病毒2型DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究

胡如西 陶 薇 傅 婷 何卓晶 賈 嵐 洪 艷 陳 勇

目的 研究重組質(zhì)粒pcDNA3-Kan/CD40L輔佐HSV-2 DNA疫苗增強(qiáng)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫的作用效果，探討其作為HSV-2 DNA疫苗佐劑的潛力。方法 (1)構(gòu)建鼠CD40L基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-Kan/CD40L。(2)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)重組質(zhì)粒pCD40L刺激小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖情況和脾細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。(3)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：48只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4個(gè)免疫組pK組、pgD組、pcCD40L+pgD組和pK+pgD組。小鼠后腿肌內(nèi)注射，共免疫2次，間隔3周。末次免疫3周后，每組隨機(jī)取4只小鼠進(jìn)行致死劑量攻毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證疫苗的保護(hù)作用。 ELISA檢測(cè)小鼠血清抗HSV-2 IgG抗體水平和趨化因子RANTES；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)全血中CD4+和CD8+T細(xì)胞百分率以及分泌IFN-γ和IL-4的T細(xì)胞的百分率；MTS法檢測(cè)小鼠脾臟T細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果 (1)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果：重組質(zhì)粒pcDNA3-Kan/CD40L對(duì)小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖能力和刺激脾細(xì)胞分泌IFN-γ的能力均顯著大于空質(zhì)粒pcDNA3-Kan(P<0.05)。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：小鼠血清抗HSV-2 IgG水平、趨化因子RANTES、脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)和分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞數(shù)均高于其他免疫組(P<0.05)。pcDNA3-Kan/CD40L+pgD組預(yù)防小鼠感染HSV-2效果好于其他免疫組。結(jié)論 (1)重組質(zhì)粒pcDNA3-Kan/CD40L能夠誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞增殖并刺激脾細(xì)胞分泌IFN-γ具有作為疫苗佐劑的潛力。(2)pcDNA3-Kan/CD40L可以輔助HSV-2 DNA疫苗誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性抗HSV-2的體液免疫和細(xì)胞免疫，具備作為HSV -2 DNA疫苗免疫佐劑的能力。

CD40配體(CD40L) 單純皰疹病毒2型(HSV-2) 疫苗佐劑

單純皰疹病毒(HSV)的感染是人類比較常見(jiàn)的感染性疾病之一，包括HSV-1和HSV-2型[1]。目前，市面上還沒(méi)有能夠有效控制HSV的特效藥，研制有效的疫苗是控制HSV感染的關(guān)鍵。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多肽疫苗和DNA疫苗的研制成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，其中DNA疫苗因具有誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的高效性而備受青睞，本研究涉及的HSV-2核酸疫苗是由筆者所在課題組研究開(kāi)發(fā)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該疫苗對(duì)于小鼠具有很好的免疫原性和保護(hù)效力[2]。為了尋求更高的體液免疫和細(xì)胞免疫效果，DNA疫苗可以利用各種免疫佐劑與之相配合[3]。

CD40L屬于腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)，是一種39kDa的Ⅱ型膜糖蛋白，主要活化T細(xì)胞表面的協(xié)同刺激分子，特別是CD4+T細(xì)胞，其分布廣泛，主要表達(dá)于活化T細(xì)胞表面，特別是活化CD4+T細(xì)胞[4～6]。CD40L在機(jī)體免疫應(yīng)答方面扮演著重要角色，其可直接刺激B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)以增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)和抗體產(chǎn)生；能夠增強(qiáng)活化B細(xì)胞分化，促進(jìn)免疫生發(fā)中心形成；也能夠激活DCs啟動(dòng)細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)[7]；還能夠與受體CD40相互作用。這些免疫刺激功能使得CD40L具有作為疫苗佐劑的潛力。

本研究構(gòu)建了含有鼠CD40L基因的重組真核質(zhì)粒pCD40L，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究CD40L是否具有核酸疫苗免疫佐劑的潛能，再經(jīng)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究CD40L輔佐HSV-2 DNA疫苗增強(qiáng)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫的能力，考察其作為核酸疫苗免疫佐劑的可能性。

材料與方法

1.質(zhì)粒、菌種和病毒：質(zhì)粒載體pK(pcDNA3-kan質(zhì)粒)由本實(shí)驗(yàn)室改建了pcDNA3質(zhì)粒， 將Kan抗性基因代替了Amp基因，得到了真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3-kan(pK質(zhì)粒)、重組質(zhì)粒pgD(含單純皰疹病毒Ⅱ型糖蛋白gD基因的卡那霉素抗性真核表達(dá)質(zhì)粒pgD，為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的HSV-2 DNA疫苗)、HSV-2病毒(LD50=10-1.88/0.1ml)由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)BALB/c 小鼠，體重18～22g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

3.實(shí)驗(yàn)試劑：限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ和T4DNA連接酶購(gòu)自Thermo公司；Tap PCR Master Mix Kit、UltraSYBR Mixture和Rneasy Mini Kit購(gòu)自Qiagen公司，第1鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(MTS)購(gòu)自Promega公司；100bp DNA 標(biāo)志物、DM10000 DNA 標(biāo)志物、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司。離子霉素(iono mycin)，佛波酯(phorbol 12-myristatc 13-acetate，PMA)，刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)皆購(gòu)自Sigma公司；紅細(xì)胞裂解液、流式抗體FITC -CD4、PE -CD8a、FITC-IFN-γ、PE-IL-4和流式固定破膜試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；Mouse RANTES (受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子，Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor)試劑盒為eBioscience公司產(chǎn)品;小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锕?；胎牛血清FBS、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO BRL公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 酶標(biāo)羊抗鼠抗體購(gòu)自鼎國(guó)生物生物技術(shù)公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

4.方法：(1) pCD40L質(zhì)粒的構(gòu)建：利用RT-PCR方法從BALB/c 小鼠脾細(xì)胞中獲得CD40L基因并將其克隆至pK質(zhì)粒中, 經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證得到pCD40L質(zhì)粒[8]。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)-SYBR green QPCR：無(wú)菌條件下制備小鼠脾細(xì)胞懸液，按濃度梯度分別加入空質(zhì)粒pK和重組質(zhì)粒pCD40L。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)3天。用Rneasy Mini Kit提取總RNA, 以O(shè)ligod(T)n為引物，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。本實(shí)驗(yàn)選用β-actin作為內(nèi)參。IFN-γ的上游引物：5′-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGA-3′，下游引物：5′-CTGGCTCTGCAGGATTTTCAT-3′(GeneBank: NC-000076.6)；內(nèi)參β-actin的上游引物：5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3′(GeneBank: NM-007393.3)。取1μl上述反應(yīng)合成的cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR的擴(kuò)增。其擴(kuò)增條件為95℃10min；預(yù)變性95℃ 15s，退火60℃ 1min，循環(huán)40個(gè)周期。所得數(shù)據(jù)采用Roto-Gene QPCR自帶軟件進(jìn)行分析，mRNA相對(duì)含量分析采用2-ΔΔCt法[ΔΔCT=(CT,Target- CT,Actin)處理- (CT,Target- CT,Actin)對(duì)照]。(3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)-MTS比色法：無(wú)菌條件下采集小鼠眼球靜脈血，用小鼠淋巴細(xì)胞分離液試劑盒分離淋巴細(xì)胞(按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。然后加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按每孔5×105細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，按濃度梯度分別加入空質(zhì)粒pK和重組質(zhì)粒pCD40L。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)3天，加入40μl MTS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm下的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率用刺激指數(shù)(stimulation index ，SI)表示，SI=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白組A值)。(4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)-動(dòng)物免疫和攻毒實(shí)驗(yàn)：48只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為以下4組：①空載體pK組(100微克/只)；②空載體pK+重組質(zhì)粒pgD組[(50微克+100微克)/只]；③重組質(zhì)粒 pgD組+重組質(zhì)粒p CD40L組[(100微克+50微克)]/只；④重組質(zhì)粒 pgD組(100微克/只)，小鼠后腿肌內(nèi)注射100微升/只，隔21天加強(qiáng)免疫1次，劑量相同。免疫第42天，每組隨機(jī)選取4只小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。腹腔注射200微升/只20×LD50HSV-2病毒懸液，每天觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，觀察14天。(5)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)-免疫小鼠樣本的收集：每次免疫后14天收集小鼠尾靜脈血200μl分離血清，所有樣本于-20℃保存。末次免疫后21天剖殺小鼠，無(wú)菌取小鼠脾臟，經(jīng)200目尼龍紗布網(wǎng)濾過(guò)制備單個(gè)細(xì)胞懸液備用。(6)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)-間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IgG抗體：采用滅活HSV-2病毒包被酶聯(lián)反應(yīng)板，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，按常規(guī)ELISA法檢測(cè)血清中IgG抗體A值。被檢血清A450 /陰性對(duì)照A450≥2.1 為陽(yáng)性，否則為陰性。(7)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)-流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞百分率：經(jīng)2次加強(qiáng)免疫的4組BALB/c小鼠最后1次免疫的14天后眼眶取血，肝素鈉抗凝處理收集的血液，分別與FITC標(biāo)記的單抗CD4+和PE標(biāo)記的單抗CD8+避光孵育30min，PBS 洗滌3次后，流式細(xì)胞儀分析CD4+和CD8+百分率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Cellquest軟件進(jìn)行分析。(8)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)-MTS比色法檢測(cè)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力：小鼠加強(qiáng)免疫21天后各組小鼠按常規(guī)方法制備脾臟細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/毫升，細(xì)胞100微升/孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板分為3部分：分別為特異性抗原刺激孔-50μg/ml滅活單純皰疹病毒；非特異性抗原刺激孔-10μg/ml Con A；對(duì)照孔-RPMI 1640完全培養(yǎng)液。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h，加細(xì)胞活力檢測(cè)試劑40微升/孔繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀測(cè)A值。計(jì)算刺激指數(shù)SI=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白組A值)。(9)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)-小鼠血清中趨化因子RANTES的檢測(cè)：經(jīng)2次加強(qiáng)免疫的4組BALB/c 小鼠最后1次免疫的14天后眼眶取血，分離血清，樣本保存于-20℃。按ELISA 試劑盒說(shuō)明檢測(cè)RANTES的含量。(10)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)-流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血分泌IFN-γ和IL-4的T的表達(dá)水平：加強(qiáng)免疫35天后的小鼠肝素抗凝全血加入RPMI1640完全培養(yǎng)液(含20ng/ml佛波酯、1μmol/L離子霉素和0.7μl/ml莫能霉素)刺激培養(yǎng)4h；100μl培養(yǎng)液加2ml紅細(xì)胞裂解液室溫裂解10min后離心；染色緩沖液洗滌后離心；加固定透化液室溫避光孵育20min，BD緩沖液洗滌后離心；加鼠流式抗體IFN-γ和IL-4室溫避光染色30min，BD緩沖液洗滌后離心；加PBS500微升/管重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析IFN-γ、IL-4的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Cellquest軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1.pCD40L重組質(zhì)粒的構(gòu)建：CD40L片段大小約為723bp，與預(yù)期的783bp相符。重組質(zhì)粒pCD40L經(jīng)EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切后，顯示為5.4 kb和783bp左右的片段(圖1)。該質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序后，插入片段與GeneBank BC119225.1的鼠CD40L序列中l(wèi)～783堿基序列完全相符。結(jié)果表明CD40L已成功地克隆到真核表達(dá)載體pK質(zhì)粒中。

圖1 pcDNA3-Kan/CD40L質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果1.DM10 000 DNA標(biāo)志物；2.pcDNA-Kan經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ 雙酶切；3.pcDNA3-Kan/CD40L經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切；4.CD40L(約783bp)；5.100bp DNA Ladder

2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)小鼠脾臟IFN-γ mRNA水平:不同濃度pCD40L(1、5、10、25、50、75和100μg/ml)在誘導(dǎo)脾細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的能力與空質(zhì)粒相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。(2)淋巴細(xì)胞增殖能力：當(dāng)重組質(zhì)粒pCD40L濃度在1、5、10、25μg/ml時(shí)，體外誘導(dǎo)大鼠外周,血淋巴細(xì)胞增殖能力(SI)與空質(zhì)粒pK無(wú)明顯差異。當(dāng)濃度達(dá)到50、75μg/ml時(shí)，重組質(zhì)粒組的SI值顯著增加(P<0.05)，表明外周血淋巴細(xì)胞明顯增殖，而空質(zhì)粒的SI值并無(wú)明顯變化。當(dāng)濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，重組質(zhì)粒組的SI值顯著下降(圖3)。此外不同濃度的空質(zhì)粒體外誘導(dǎo)大鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 小鼠脾臟IFN-γ mRNA水平

圖3 淋巴細(xì)胞增殖能力

3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：(1)小鼠血清中抗HSV-2抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果：初次免疫14天后，pCD40L+pgD組、pK+pgD組和pgD組產(chǎn)生的IgG的水平顯著大于pK組(P<0.05),pCD40L+pgD組刺激產(chǎn)生的IgG的水平明顯大于其他各組刺激產(chǎn)生的IgG的水平(P<0.05)。35天后除pK組外，其他3組的IgG均有明顯的上升，并且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，特別是pCD40L+pgD組的IgG上升的最為明顯(P<0.01)，高于初次免疫14天后的特異性IgG A值的2倍之多。初免42天后，各組的IgG與第35天無(wú)明顯變化，跟第2次接種14天差別不大(表1)。(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)-小鼠外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞百分率：初次免疫42天后的全血刺激培養(yǎng)液的流式檢測(cè)結(jié)果顯示，pCD40L+pgD組的CD4+細(xì)胞的百分率略高于不加佐劑組，與pK組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其他兩組間兩兩t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；加pCD40L+pgD組的CD8+細(xì)胞百分率略高于pK組 (P<0.05)；其他3組間兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。(3)小鼠T細(xì)胞增殖能力：加pCD40L佐劑組的ConA刺激指數(shù)和滅活單純皰疹病毒刺激指數(shù)均高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他3組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。(4)小鼠血清中RANTES含量：ELISA 法分析經(jīng)2次免疫后小鼠血清中RANTES 的產(chǎn)生。pK組、pK+pgD組、pCD40L+pgD組、pgD組RANTES含量分別為10.034、201.633、676.633和170.204pg/ml。結(jié)果顯示經(jīng)2次免疫后，pCD40L+pgD組的RANTES含量最高，含量達(dá)到了676.633pg/ml，明顯高于其他3組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(5)小鼠外周血分泌IFN-γ和IL-4 T的表達(dá)水平：pCD40L+pgD組的IFN-γ的表達(dá)水平顯著高于其他各組(P<0.05); 其他3組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加pCD40L+pgD組的IL-4 的表達(dá)水平均低于其他各組(P<0.05)；其他3組兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。(6)疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)性：HSV-2病毒攻毒14天后，空質(zhì)粒組小鼠全部死亡；pCD40L+pgD組存活3只，保護(hù)率為75%；pK+pgD組和pgD組的保護(hù)率僅為50%(圖7)。

表1 小鼠血清抗HSV-2IgG吸光度值

圖4 小鼠外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞百分率

圖5 小鼠T細(xì)胞增殖能力

圖6 外周血分泌IFN-γ和IL-4 T的表達(dá)水平

圖7 疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)性

討 論

CD40L是一種有著良好應(yīng)用前景的新型免疫刺激劑。最近研究發(fā)現(xiàn)， CD40L的重組質(zhì)粒作為病毒DNA疫苗的免疫佐劑在人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)等感染的相關(guān)臨床疾病中均能夠增強(qiáng)DNA疫苗細(xì)胞免疫或體液免疫應(yīng)答[9～11]。Sin等[12]做了類似研究，證明CD40L有作為疫苗佐劑的能力。但是，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3為Amp抗性質(zhì)粒，現(xiàn)在有研究發(fā)現(xiàn)如果終產(chǎn)品中有殘留Amp，可能會(huì)對(duì)青霉素過(guò)敏的接種者不安全。本研究中，筆者采用了本實(shí)驗(yàn)室pK質(zhì)粒。筆者的研究也獲得了與其他研究者相似的研究結(jié)果。在體外實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)CD40L重組質(zhì)粒具有誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力。本研究利用CD40L重組質(zhì)粒直接作用小鼠外周血淋巴細(xì)胞和脾臟淋巴細(xì)胞。SYBRgreen QPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pCD40L組小鼠脾臟IFN-γ mRNA水平顯著增高，這說(shuō)明CD40L能促進(jìn)小鼠脾臟T細(xì)胞向Th1型細(xì)胞分化。在淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，重組質(zhì)粒pCD40L能促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，說(shuō)明它對(duì)于淋巴細(xì)胞的免疫功能具有一定的積極影響。當(dāng)重組質(zhì)粒pCD40L濃度為50μg/ml和75μg/ml時(shí)，它對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的促分裂作用比低濃度的作用顯著增高；當(dāng)其濃度為100μg/ml時(shí)，外周血淋巴細(xì)胞增殖能力反而下降，這說(shuō)明重組質(zhì)粒pCD40L促外周血淋巴細(xì)胞分裂活性在一定的濃度范圍內(nèi)才發(fā)揮作用。在本研究中，重組質(zhì)粒pCD40L刺激外周血淋巴細(xì)胞增殖的最佳濃度為75μg/ml。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，重組質(zhì)粒pCD40L能夠輔佐HSV-2 DNA疫苗刺激小鼠產(chǎn)生抗HSV-2的細(xì)胞免疫和體液免疫。在第2次免疫后第14天，pCD40L和HSV-2 DNA疫苗組可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高A值的IgG抗體，其A值是其他各組的2倍之多(P<0.05)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，pCD40L和HSV-2 DNA疫苗組CD4+T細(xì)胞和分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞百分率高于其他組(P<0.05)；在小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，pCD40L的特異性抗原和非特異性抗原的刺激指數(shù)都顯著高于其他3組(P<0.05)，以上結(jié)果均說(shuō)明重組質(zhì)粒pCD40L能夠輔佐HSV-2 DNA疫苗刺激小鼠產(chǎn)生抗HSV-2的細(xì)胞免疫。此外，pCD40L和HSV-2 DNA疫苗組能刺激產(chǎn)生更高量的趨化因子RANTES。趨化因子RANTES是CD40L調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生。趨化因子RANTES的高表達(dá)，可募集未激活的CD4+記憶T細(xì)胞、刺激CD4+T和CD8+T的活化，參與不成熟DCs細(xì)胞的募集、促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生，趨化炎癥細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，發(fā)揮多種作用參與機(jī)體對(duì)病毒的免疫[13]。在動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中，由于與本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)所用的病毒效價(jià)(LD50)不一樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不盡相同，但是都說(shuō)明了HSV-2 DNA疫苗pgD質(zhì)粒及其佐劑pCD40L質(zhì)粒對(duì)感染單純皰疹病毒后的小鼠的存活率有一定的提高。

總之，本研究構(gòu)建的質(zhì)粒pCD40L能夠輔佐HSV-2 DNA疫苗刺激小鼠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫，特別是其在提高細(xì)胞免疫方面的能力，具有作為疫苗佐劑的潛力。在后續(xù)研究中，我們將圍繞CD40L做進(jìn)一步的探索，為研發(fā)HSV-2 的治療性疫苗提供可靠的依據(jù)。

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(修回日期：2015-07-21)

Plasmid CD40L Enhances Immune Response of HSV-2 DNA Vaccine.

HuRuxi,TaoWei,FuTing,etal.

WenzhouMedicalUniversitySchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,Zhejiang325035,China

Objective To detect HSV-2-specific humoral immunological response and cellular immunological response in BALB/c mice which were induced by plasmid CD40L-adjuvanted HSV-2 DNA vaccine. Methods ①The murine CD40L gene transcript was inserted into the pcDNA3 vector to obtain the recombinant plasmid pcDNA3-Kan/CD40L. ②In vitro study: MTS colorimetric method was employed in the detection of the rat peripheral blood lymphocytes proliferation and SYBRgreen qPCR assay was used to test the IFN-γ secretion ability of spleen cells. ③In vivo study: Forty eight female BALB/c mice were randomly divided into four groups: pKan, pgD, pCD40L+pgD and pKan+pgD, and inoculated through intramuscular immunization at the weeks 0 and 3. After 6 weeks the protection given to the mice was assayed by a fatal dose of HSV-2. The humoral immunological response and the cellular immunological response were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), MTS colorimetric assay and flow cytometry (FCM). Results ①The ability of stimulation lymphocytes proliferation of rat PBMC and IFN-γ level in spleen cells of cDNA3-Kan/CD40L group were significantly better than that of pK group (P<0.05).②The level of anti-HSV-2 IgG, RANTES, stimulation index (SI), CD4+and IFN-γ in pCD40L+pgD group were significantly higher than anther groups. Furthermore，mice of pCD40L+pgD group were prophylactically protected from challenge with a high dose of HSV-2. Conclusion ①The potential of pcDNA3-Kan/CD40L could be used as an adjuvant in vaccines.②The potential of pCD40L-adjuvantd HSV-2 DNA vaccine could induce systemic humoral immune responses and cellular immune responses intramuscular vaccinated mice.

CD40 ligand (CD40L); Herpes simplex virus type 2 (HSV-2); Vaccine adjuvant

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY12H19009)

325035 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院(胡如西、陳勇)；310013 杭州，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(陶薇、傅婷、何卓晶、賈嵐、洪艷)

洪艷，陳勇，電子信箱: hongy1008@163.com

R3

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.009

2015-07-07)