姜陶然 曹德君

原發(fā)性顱縫早閉是較常見的先天性顱面畸形，系因一條或多條顱縫過早閉合所引起，即骨縫過早骨化，提前失去增殖擴大的能力，從而導致各種顱面部畸形及智力障礙。成纖維生長因子受體突變（FGFRs）可導致多種顱縫早閉綜合征，如Apert綜合征及Crouzon綜合征等。骨形成蛋白下游的轉錄因子MSX2發(fā)生突變時也可導致Boston型顱縫早閉。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFs/FGFRs信號通道與BMPs信號通道在調控骨髓間充質干細胞成骨分化時，可發(fā)生相互作用。但在顱縫細胞成骨分化過程中，F(xiàn)GFs/FGFRs與BMPs的相互作用及其機制仍不明確。為探討這一問題，我們設計了本實驗。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

低糖 DMEM（Hyclone，美國），胎牛血清（Biowest，法國），Ⅳ型膠原蛋白酶（SERVA，德國），茜素紅、青鏈霉素原液、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶-EDTA、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松（Gibco，美國），Recombinant Rat FGF-2、Recombinant Human BMP-2、Recombinant Human Noggin（PEPROTECH，美國），Trizol液（Invitrogen，美國），堿性磷酸酶染色試劑盒（上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑技術有限公司），M-MLV反轉錄酶及相關試劑（Promega，美國），SYBR Premix Ex TagⅡ試劑盒（Takara，日本）。紫外分光光度計（MAPADA，UV-3200）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠顱縫細胞培養(yǎng)

取1~3天的新生SD大鼠，乙醇浸泡消毒，無菌條件下切取顱蓋骨，剝離硬腦膜和骨膜，取顱骨矢狀縫及冠狀縫處1.5 mm組織，盡量剪碎，放入4 mLⅣ型膠原蛋白酶內，37℃，3 h；離心棄上清液。10 mL完全培養(yǎng)液 （低糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素原液+292 mg/L L-谷氨酰胺）重懸細胞，無菌轉移至培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。每3天換液一次，1周后0.25%胰蛋白酶消化，1×104cells/cm2細胞密度接種于6孔板及24孔板。實驗用第一代細胞。

1.2.2 FGF-2對顱縫細胞BMP-2表達的影響

第一代細胞80%融合后，將培養(yǎng)液換為成骨誘導培養(yǎng)液（完全培養(yǎng)液+10-8mol/L地塞米松+50 μg/mL抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉），并添加不同濃度 FGF-2 （1 ng/mL，10 ng/mL，16 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL，150 ng/mL 和 200 ng/mL）；對照組僅添加成骨誘導培養(yǎng)液。誘導24 h后，收集細胞，提取RNA，逆轉錄熒光定量PCR檢測BMP-2的表達量。

在成骨誘導培養(yǎng)液中添加10 ng/mL FGF-2，分別于誘導后的不同時段（12 h，24 h，36 h，48 h，3 d，5 d，7 d）收集細胞，提取RNA，定量PCR檢測BMP-2的表達量。

1.2.3 成骨誘導分化

第一代細胞80%融合后，將培養(yǎng)液換為成骨誘導培養(yǎng)液。細胞分4組，分別添加①10 ng/mL FGF-2；②10 ng/mL FGF-2與100 ng/mL BMP-2；③10 ng/mL FGF-2 與 1 ug/ml Noggin；④10 ng/mL FGF-2、100 ng/mL BMP-2與1 μg/mL Noggin。 每3天換液，培養(yǎng)24 h或48 h，收集細胞，提取RNA，定量PCR檢測成骨標志物COL-1、OC、BSP。培養(yǎng)7 d后，固定細胞，行ALP染色及茜素紅礦化染色。

1.2.4 ALP染色

用無磷酸鈣的PBS沖洗細胞3次后，多聚甲醛室溫固定30 sec，流水沖洗，晾干；根據(jù)試劑盒使用說明書配置工作液；在培養(yǎng)板中添加工作液，37℃恒溫箱中孵育45 min；流水沖洗5 min，晾干，鏡下觀察。

1.2.5 茜素紅礦化染色

用無磷酸鈣的PBS沖洗細胞3次后，4%多聚甲醛室溫固定10 min，流水沖洗。在培養(yǎng)板中添加10%茜素紅溶液，37℃恒溫箱中孵育30 min，流水沖洗，晾干，鏡下觀察。

1.2.6 RNA提取及熒光定量PCR

Trizol進行mRNA的提取，實驗操作參照Invitrogen Trizol使用說明，用紫外分光光度計檢測核酸濃度及純度。RNA逆轉錄形成cDNA模板，使用MMLV反轉錄酶及相關試劑合成。qPCR定量分析，在冰上按說明書配制10 μL反應體系，每種引物擴增反應都設定陰性對照（表1）。在Stepone plus儀器上進行Real Time PCR反應，每個反應重復3次，實驗結束后用 2-ΔΔCT法分析統(tǒng)計結果。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結果

2.1 FGF-2對顱縫細胞BMP-2表達的影響

結果顯示，BMP-2的表達隨FGF-2濃度增加而增高，F(xiàn)GF-2濃度達到50 ng/mL后，BMP-2表達進入平臺期 （圖1A）；隨著FGF-2作用時間延長，BMP-2表達量也隨之有明顯增加（圖1B）。

2.2 FGF-2與BMP-2對顱縫細胞成骨分化的影響

結果顯示，F(xiàn)GF-2與BMP-2共同作用抑制COL-1的表達，促進OC和BSP的表達。誘導培養(yǎng)7 d后，ALP染色及茜素紅礦化染色均高于對照組（單純成骨誘導培養(yǎng)液）（圖2）。

2.3 BMP-2被阻斷后對顱縫細胞成骨分化的影響

結果顯示，內源性BMP-2被阻斷后，晚期成骨標志物OC和BSP表達量均明顯下降，ALP染色、茜素紅礦化染色均減弱；外源性BMP-2被阻斷后，晚期成骨標志物OC和BSP表達量均顯著降低，ALP染色、茜素紅礦化染色也明顯減弱（圖3）。

圖1 FGF-2對顱縫細胞BMP-2表達的影響Fig.1 BMP-2 expression in cranial suture cells after FGF-2 induction

圖2 FGF-2與BMP-2共同作用對顱縫細胞成骨分化的影響Fig.2 The effect of co-treatment of FGF-2 and BMP-2 on the osteoblastic differentiation of cranial suture cells

3 討論

原發(fā)性顱縫早閉，即顱骨骨縫過早融合，是顱頜面較為常見的畸形，發(fā)病率為1/2 500[1]。由于顱縫過早閉合，顱腔提前失去增殖擴大的能力，常可導致嚴重的并發(fā)癥，如顱內高壓、繼發(fā)性的視力和聽力損害、氣道堵塞及智力低下等，并因外貌異常導致心理疾病[2]。顱縫早閉患者需接受多次復雜的開顱手術，但因氣管發(fā)育異常，易出現(xiàn)術后并發(fā)癥[3]。因此在了解疾病發(fā)病機制的基礎上，研究出新型的非手術治療方法具有重要的意義。

圖3 Noggin阻斷BMPs信號通道對顱縫細胞晚期成骨分化的影響Fig.3 The effect of Noggin on the later-stage osteoblastic differentiation of cranial suture cells

骨骼發(fā)育分為膜內成骨及軟骨內成骨兩種形式。顱骨作為扁狀骨，是由膜內成骨發(fā)育而來，即間充質細胞不經軟骨形成過程，而直接分化為成骨細胞。在這一過程中，有多種細胞信號參與調控。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在FGFRs的基因突變，可導致FGFs信號通道不依賴配體的組成性激活，從而加速間充質細胞/成骨細胞的分化，最終導致顱縫過早閉合；發(fā)生在BMPs下游的轉錄因子MSX2發(fā)生突變時可導致Boston型顱縫早閉[4-5]。這些研究表明，F(xiàn)GFs/FGFRs與BMPs信號通道均參與調控顱縫閉合，發(fā)生異常時均可導致顱縫早閉。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFs/FGFRs與BMPs信號通道在骨形成過程中相互作用[6-7]。但兩者是否在調控顱縫閉合的過程中相互作用并不明確。本實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2可促進BMP-2在顱縫細胞中的表達，但BMP-2不能促進FGF-2在顱縫細胞中的表達 （前期實驗結果）。同時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2對BMP-2的促進作用具有濃度依賴性及時間依賴性。該結果和Choi等[8]的研究結果一致，但Biver等[9]的認為，F(xiàn)GF-2 可完全阻斷 BMP-2、BMP-4、BMPR-1A及BMPR-1B在人間充質干細胞成骨分化過程中的表達上調。這一矛盾結果可能是由于不同的細胞類型及不同的培養(yǎng)條件所造成的。BMP-2在顱骨形成不同階段中都具有重要作用，包括啟動前體成骨細胞向成熟成骨細胞的分化以及促進成骨細胞的礦化[10-13]。研究表明，BMP-2異常調節(jié)與顱縫閉合及原發(fā)性顱縫早閉有關。人為給予高濃度BMP-2的動物模型及BMPR-1組成性激活突變的動物模型均出現(xiàn)了顱縫過早閉合[14-15]。因此，我們認為，高表達的BMP-2可增強BMPs信號通道，從而加速顱縫細胞成骨分化，最終導致顱縫過早閉合。FGF-2可促進BMP-2在顱縫細胞中的表達，可能是FGFRs組成性激活突變導致顱縫早閉的機制之一。

為了進一步探討FGF-2與BMP-2在顱縫細胞成骨分化中的相互作用，我們在顱縫細胞培養(yǎng)體系中同時添加了10 ng/mL FGF-2與100 ng/mL BMP-2，并觀察顱縫細胞成骨分化的情況。我們通過消化未閉合的冠狀縫及矢狀縫旁3 mm骨塊以獲得顱縫原代細胞，對組織塊的消化使得我們獲得的原代細胞并不會是單一的細胞，原代細胞中摻雜著靠近顱縫、相對不成熟的顱縫細胞及離顱縫較遠、相對成熟的顱縫細胞[9]。在消化前，我們將覆蓋在骨塊上的骨膜及硬腦膜去除，消除硬腦膜分泌的各種生長因子對實驗結果的干擾[16]。結果顯示，F(xiàn)GF-2與BMP-2共同作用，抑制了早期成骨標志物COL-1在顱縫細胞中的表達，卻促進了晚期成骨標志物OC和BSP的表達。同時，顱縫細胞的ALP染色及茜素紅礦化染色均較對照組增強。該結果說明，雙因子共同作用可促進顱縫細胞晚期成骨分化。研究表明，F(xiàn)GFs/FGFRs通常通過蛋白激酶C（PKC）途徑及細胞外調節(jié)蛋白激酶-促分裂素原活化蛋白激酶鏈 （ERKMAPK）途徑促進成骨分化[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，BMP-2是FGF-2信號通道的下游因子，F(xiàn)GF-2與BMP-2共同作用可促進顱縫細胞晚期成骨分化。所以，我們推測，F(xiàn)GF-2信號通道還可通過BMP-2途徑促進成骨分化。我們通過添加BMPRs競爭性抑制劑Noggin阻斷內源性及外源性BMP-2信號通道。結果顯示，添加Noggin后，單因子FGF-2及FGF-2+BMP-2促進顱縫細胞晚期成骨分化的作用均減弱，說明FGF-2促進顱縫細胞成骨分化也可通過BMP-2途徑。綜上所述，本實驗說明，F(xiàn)GF-2與BMP-2在調控顱縫細胞成骨分化中具有軸向作用，即FGF-2上調BMP-2在顱縫細胞中的表達，增強的BMP-2信號通道加強了FGF-2促進顱縫細胞晚期成骨分化的作用。

顱縫早閉作為常見的先天性顱頜面畸形，可導致多種并發(fā)癥，故對其發(fā)病機制的研究具有重要意義。本實驗初步闡明了FGFs/FGFRs信號通道與BMPs信號通道在顱縫早閉發(fā)病過程中的相互作用，對顱縫早閉的具體發(fā)病機制有了進一步的了解。

[1]Wilkie AO.Epidemiology and genetics of craniosynostosis[J].Am J Med Genet,2000,90(1):82-84.

[2]Dwivedi PP,Grose RH,Filmus J,et al.Regulation of bone morphogenetic protein signalling and cranial osteogenesis by Gpc1 and Gpc3[J].Bone,2013,55(2):367-376.

[3]Sinkueakunkit A,Chowchuen B,Kantanabat C,et al.Outcome of anesthetic management for children with craniofacial deformities[J].Pediatr Int,2013,55(3):360-365.

[4]Muenke M,Gripp KW,McDonald-McGinn DM,et al.A unique point mutation in the fibroblast growth factor receptor 3 gene(FGFR3)defines a new craniosynostosis syndrome[J].Am J Hum Genet,1997,60(3):555-564.

[5]Wilkie AO.Craniosynostosis:genes and mechanisms[J].Hum Mol Genet,1997,6(10):1647-1656.

[6]Fakhry A,Ratisoontorn C,Vedhachalam C,et al.Effects of FGF-2/-9 in calvarial bone cell cultures:differentiation stagedependent mitogenic effect,inverse regulation of BMP-2 and noggin,and enhancement of osteogenic potential[J].Bone,2005,36(2):254-266.

[7]Nakamura Y,Tensho K,Nakaya H,et al.Low dose fibroblast growth factor-2(FGF-2)enhances bone morphogenetic protein-2(BMP-2)-induced ectopic bone formation in mice[J].Bone,2005,36(3):399-407.

[8]Choi KY,Kim HJ,Lee MH,et al.Runx2 regulates FGF2-induced Bmp2 expression during cranial bone development[J].Dev Dyn,2005,233(1):115-121.

[9]Biver E,Soubrier AS,Thouverey C,et al.Fibroblast growth factor 2 inhibits up-regulation of bone morphogenic proteins and their receptors during osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,427(4):737-742.

[10]Chen D,Harris MA,Rossini G,et al.Bone morphogenetic protein 2(BMP-2)enhances BMP-3,BMP-4,and bone cell differentiation marker gene expression during the induction of mineralized bone matrix formation in cultures of fetal rat calvarial osteoblasts[J].Calcif Tissue Int,1997,60(3):283-290.

[11]Hay E,Hott M,Graulet AM,et al.Effects of bone morphogenetic protein-2 on human neonatal calvaria cell differentiation[J].J Cell Biochem,1999,72(1):81-93.

[12]Marie PJ,Debiais F,Hay E.Regulation of human cranial osteoblast phenotype by FGF-2,FGFR-2 and BMP-2 signaling[J].Histol Histopathol,2002,17(3):877-885.

[13]Ornitz DM,Marie PJ.FGF signaling pathways in endochondral and intramembranous bone development and human genetic disease[J].Genes Dev,2002,16(12):1446-1465.

[14]Kinsella CR Jr,Cray JJ,Durham EL,et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2-induced craniosynostosis and growth restriction in the immature skeleton[J].Plast Reconstr Surg,2011,127(3):1173-1181.

[15]Komatsu Y,Yu PB,Kamiya N,et al.Augmentation of Smaddependent BMP signaling in neural crest cells causes craniosynostosis in mice[J].J Bone Miner Res,2013,28(6):1422-1433.

[16]Opperman LA,Passarelli RW,Morgan EP,et al.Cranial sutures require tissue interactions with dura mater to resist osseous obliteration in vitro[J].J Bone Miner Res,1995,10(12):1978-1987.

[17]Park J,Park OJ,Yoon WJ,et al.Functional characterization of a novel FGFR2 mutation,E731K,in craniosynostosis[J].J Cell Biochem,2012,113(2):457-464.