崔佰吉，李 瑤，張宏梅，姜曉明，馮憲敏

以減毒沙門氏菌為載體的抗賈第蟲(chóng)腸溶疫苗制備及免疫效果檢測(cè)

崔佰吉，李 瑤，張宏梅，姜曉明，馮憲敏

目的 以攜帶α1-giardin DNA的減毒沙門菌為對(duì)象，探討腸溶制劑的制備、免疫劑量和免疫效果。方法 攜帶有賈第蟲(chóng)α1-giardin基因的重組減毒沙門菌經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增凍干后，對(duì)各種輔料，包括微分硅膠、分散劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、包衣液等成分與減毒沙門菌的相容性，及包衣條件進(jìn)行檢測(cè)。采用最佳配方制備腸溶片劑，用于動(dòng)物免疫試驗(yàn)。初始免疫后第25 d后，分別檢測(cè)血清和小腸灌洗液中抗rα1-giardin特異性IgG和SIgA的水平；并用106個(gè)賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體灌胃，每天檢測(cè)各組小鼠糞便中的滋養(yǎng)體和(或)包囊的排出率。結(jié)果 腸溶片劑的處方中微分硅膠和分散劑的用量分別為菌粉用量的10%和2倍；潤(rùn)滑劑和崩解劑的用量分別占處方量的0.8%和2%；包衣液的濃度為20%，包衣增重為處方量的6%。每個(gè)包衣片活菌含量在4×106以上。動(dòng)物試驗(yàn)表明，以SL7207/pVAX1-rα1-giardin腸溶片劑免疫鼠小腸灌洗液中特異性抗rα1-giardin SIgA的水平明顯高于對(duì)照組，并在攻蟲(chóng)試驗(yàn)具有46.7%的減蟲(chóng)率，明顯高于rα1-giardin肌注免疫組(23%)(P<0.01)。結(jié)論 本研究為多種以減毒沙門菌為載體的DNA疫苗的腸溶制劑的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，如規(guī)?；a(chǎn)，該處方尚需進(jìn)一步完善。

減毒沙門菌；藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)；α1-賈第素；腸溶疫苗

利用侵襲性胞內(nèi)細(xì)菌作為載體傳遞外源抗原基因疫苗是目前基因免疫研究的熱點(diǎn)。沙門菌是一種胞內(nèi)侵襲性細(xì)菌，通過(guò)化學(xué)誘變、抗生素誘變和基因工程等方法使其失去了對(duì)動(dòng)物的致病性，但不影響其在體內(nèi)的繁殖和侵襲能力，此為減毒沙門菌[1]。研究表明，減毒沙門菌能夠有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜、細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，是攜帶外源基因的良好載體和天然黏膜免疫佐劑，已廣泛應(yīng)用于多種病原菌(如鏈球菌、結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌和艱難梭菌等)[2-5]、病毒(如新城疫病毒等)[6]、寄生蟲(chóng)(旋毛蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)等)[7-8]和抗腫瘤[9-10]疫苗的研發(fā)。目前，減毒沙門菌作為載體，其最為有效的免疫途徑為黏膜免疫，免疫的最終效果取決于活菌疫苗的有效劑量。對(duì)于賈第蟲(chóng)等腸道寄生病原體，主要刺激腸黏膜產(chǎn)生分泌型IgA抗體，通過(guò)黏膜免疫途徑可大大提高免疫接種的效果。而腸溶制劑則可有效控制活菌疫苗的使用劑量，提高疫苗的有效性和安全性。

賈第蟲(chóng)α1-賈第素(α1-giardin)是定位于賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體漿膜表面的一組膠連蛋白(Annexin)，在賈第蟲(chóng)包囊向滋養(yǎng)體轉(zhuǎn)化(出囊)，及滋養(yǎng)體感染粘附過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究表明以減毒沙門菌作為載體的α1-giardin基因活菌疫苗，通過(guò)灌胃的方法，可有效減少小鼠模型小腸中滋養(yǎng)體的寄生數(shù)量，表現(xiàn)了有意義的保護(hù)性作用[11]。本研究以攜帶α1-giardin DNA的減毒沙門菌為對(duì)象，探討腸溶制劑的制備、免疫劑量和免疫效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 單沖壓片機(jī)(TDP-5 中南制藥機(jī)械廠)；小型包衣機(jī)(BY300A 上海黃海藥檢儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(Scientz-12SN 寧波生物科技股份有限公司)。微晶纖維素(德國(guó)VIVAPUR Type101,批號(hào)：6610124526)；淀粉(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司,批號(hào)：2010年01月22日)；微分硅膠(安徽山河藥用輔料有限公司,批號(hào)：091201)；羧甲基淀粉鈉(安徽山河藥用輔料有限公司,批號(hào)：091220)；硬脂酸鎂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)：F20061128)；歐巴代薄膜包衣預(yù)混劑93018509白色(上?？?lè)康包衣技術(shù)有限公司,批號(hào)：SH563179)；磷酸二氫鉀(天津市福晨化學(xué)試劑廠,批號(hào)：20110512)；氫氧化鈉(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司,批號(hào)：2010年01月19日)。

1.2 重組減毒沙門菌制備 攜帶有賈第蟲(chóng)α1-giardin基因的重組減毒沙門菌由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，-80 ℃凍存。用時(shí)，取少量接種于含有1 mg/mL卡那霉素的50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日離心(8 000 r/min 10 min)，收集菌體，重懸于5 mL菌體保護(hù)劑中(2.5%蔗糖，5%脫脂奶粉)，凍干。稱取0.001 g菌粉溶于5 mL無(wú)菌生理鹽水中，用生理鹽水稀釋104倍后，分別取5 μL、10 μL、20 μL和50 μL，在含有1 mg/mL的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算凍干粉的細(xì)菌活性。

1.3 處方的選擇

1.3.1 微分硅膠用量 稱取4份1g菌粉，分別按比例加入0.06 g(6%)、0.08 g(8%)、0.10 g(10%)和0.12 g(12%)的微分硅膠，在研缽中研勻，以混合物分散均勻、無(wú)粘連為考察指標(biāo)，進(jìn)行微分硅膠用量的選擇。

1.3.2 稀釋劑的用量 微晶纖維素和淀粉為片劑常用的稀釋劑，微晶纖維素成型效果好，但粘合度欠缺，添加淀粉進(jìn)行補(bǔ)充，使制劑制備過(guò)程中的顆粒成型效果良好。以稀釋劑用量選擇為菌粉用量的2倍，分別考察微晶纖維素∶淀粉(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2)的用量比例，用量選擇設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。以顆粒的制備難易程度和顆粒成型效果為考察指標(biāo)。

1.3.3 潤(rùn)滑劑用量 硬脂酸鎂為潤(rùn)滑劑，主要考察顆粒的流動(dòng)性，以休止角為考察指標(biāo)確定硬脂酸鎂的用量，硬脂酸鎂用量分別為處方量0.6%、0.8%、1.0%，設(shè)計(jì)處方見(jiàn)表2。

休止角測(cè)定方法：底盤為直徑3.5 cm的平皿，將兩只玻璃漏斗上下交錯(cuò)重疊，固定在鐵架臺(tái)上，下漏斗出口與底盤距離為3.5～6.0 cm之間。分別取樣品若干，從上部漏斗慢慢加入，使樣品經(jīng)過(guò)兩只漏斗的緩沖逐漸堆積在底盤上，形成錐體，直至得到最高的錐體為止。測(cè)定錐體的高H，每種樣品各測(cè)定3次，取平均值，按公式計(jì)算休止角：α=arctg(H/R)，α為休止角，R為底盤半徑。

表1 稀釋劑用量考察處方設(shè)計(jì)

表2 硬脂酸鎂用量考察處方設(shè)計(jì)

1.3.4 崩解劑用量 為保證片劑能夠在體內(nèi)快速釋放，本制劑采用羧甲基淀粉鈉(2%、4%、6%)作為崩解劑，進(jìn)行片劑的制備，并按照2010版《中國(guó)藥典》附錄ⅩA方法[13]，以片劑在pH6.8的人工腸液中的崩解速度作為考察指標(biāo)，選擇羧甲基淀粉鈉的用量。處方設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

1.3.5 包衣液濃度 包衣采用卡樂(lè)康公司的歐巴代(雅克宜93018509)作為腸溶制劑的包衣材料。對(duì)包衣的厚度、時(shí)間、溫度等加以控制。選擇包衣液濃度為10%、20%、30%進(jìn)行試驗(yàn)，以片劑增重3%為基準(zhǔn)，記錄包衣所需時(shí)間和包衣后片劑的外觀。

1.3.6 片劑包衣增重 選擇同一批產(chǎn)品3份，采用20%包衣液進(jìn)行包衣，使包衣后片劑增重分別為4%、6%、8%。分別考察3個(gè)處方片劑在pH1.0人工胃液和pH6.8人工腸液中的崩解時(shí)限，以崩解時(shí)限作為考察指標(biāo)，選擇包衣增重量。

1.3.7 包衣工藝對(duì)菌群活力的影響 菌群的活力對(duì)溫度變化比較敏感，高溫可使大量的菌群失活，所以溫度控制不佳會(huì)對(duì)菌群活力產(chǎn)生極大的影響，故選擇一個(gè)處方的片劑，使用室溫干燥，進(jìn)行包衣，對(duì)比包衣前后細(xì)菌活力。

1.4 片劑制備 根據(jù)上述，得到最佳處方(表4)。稱取適量菌粉(每片細(xì)菌含量為4×108)，加入處方量微分硅膠，研磨分散均勻后加入處方量的微晶纖維素和淀粉，混勻，加入處方量的羧甲基淀粉鈉，混勻。5%淀粉漿適量制軟材，20目篩制顆粒，避光、室溫下干燥4 h得干燥顆粒，加入處方量的硬脂酸鎂，混勻、壓片，制備好的片劑采用預(yù)先制備好的濃度為20%包衣液進(jìn)行包衣，包衣至片劑增重6%，即得。共進(jìn)行3個(gè)批次產(chǎn)品的制備，并進(jìn)行崩解時(shí)限和菌群活力的檢查。

表3 崩解劑考察處方設(shè)計(jì)

表4 最佳處方標(biāo)

1.5 免疫效果檢測(cè)

1.5.1 免疫與抗體檢測(cè) 清潔級(jí)雌性BABL/c小鼠30只，適應(yīng)性培養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，每組10只，5只用于抗體檢測(cè)，5只用于攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)。組1為正常對(duì)照組。組2為肌注rα1-giardin免疫對(duì)照組，以含有rα1-giardin 20 μg/100 μL的抗原加等量完全弗氏佐劑背部多點(diǎn)皮下注射。隔周用不完全佐劑與重組蛋白混合，以同樣劑量加強(qiáng)，共加強(qiáng)2次。末次免疫后10 d(初始免疫后第25 d)，隨機(jī)挑取5只小鼠，眼球取血處死，采集血液置37 ℃，孵育30 min，3 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集血清，1∶3 000稀釋，以rα1-giardin蛋白包被96孔板，進(jìn)行血清IgG抗體檢測(cè)。收集小鼠十二指腸灌洗液，檢測(cè)總SIgA抗體濃度。抗體檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行,所用抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司。組3為喂飼腸溶片劑組。分組后禁食4 h，每只小鼠經(jīng)食管喂飼腸溶片劑1片，2 h后正常飲食。隔周以同樣的方法加強(qiáng)喂飼1片。初始免疫后第25 d隨機(jī)挑取5只小鼠，眼球取血處死，收集血清和小腸灌洗液，以rα1-giardin蛋白包被96孔板進(jìn)行血清特異性IgG抗體和小腸特異性SIgA抗體檢測(cè)。

1.5.2 攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)與減蟲(chóng)率 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體由本室液氮保存。實(shí)驗(yàn)前復(fù)蘇，用改良TYI-S-33培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代。收集對(duì)數(shù)期蟲(chóng)體，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至106/mL用于攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)。各組剩余5只小鼠在初始免疫后25 d開(kāi)始禁食10 h，期間僅喂飼2%碳酸氫鈉水中和胃酸。用灌胃器吸取1 mL蟲(chóng)液，進(jìn)行灌胃，灌胃2 h后開(kāi)始正常飲食。攻蟲(chóng)后，分別收集3組小鼠每天的糞便，連續(xù)2周，進(jìn)行賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體和包囊檢查，計(jì)算感染率和減蟲(chóng)率。

2 結(jié) 果

2.1 微分硅膠與稀釋劑用量 微分硅膠用量考察結(jié)果顯示，當(dāng)微分硅膠用量為菌粉用量10%時(shí)，混合物無(wú)粘連，分散均勻，故不再增加微分硅膠的用量，選擇菌粉用量10%計(jì)入處方用量。

稀釋劑考察結(jié)果顯示，淀粉用量越多，顆粒制備過(guò)程中越容易，主要是淀粉的粘合作用使得制軟材的過(guò)程較容易，但淀粉用量過(guò)多，成型效果受到一定的影響。綜合考慮，選取成型好，且制備較容易的處方2的用量，即稀釋劑用量為菌粉用量的2倍，微晶纖維素∶淀粉為2∶1計(jì)入處方用量。

2.2 潤(rùn)滑劑與崩解劑用量 潤(rùn)滑劑用量考察結(jié)果顯示，3個(gè)處方的硬脂酸鎂的用量均能滿足大生產(chǎn)的需求，休止角計(jì)算值分別為39°、31°和27°。為保證制劑的順利生產(chǎn)，避免各批次的差異，選擇表2列舉的處方2中硬脂酸鎂的用量計(jì)入處方量，占處方量的0.8%。

崩解劑用量考察試驗(yàn)結(jié)果顯示，崩解劑用量為2%、4%、6%的處方量時(shí)，崩解時(shí)間分別為541 s、492 s和507 s，對(duì)該片劑的崩解影響差別不顯著，所以預(yù)選崩解劑量為2%計(jì)入處方。

2.3 包衣液濃度 包衣液濃度考察結(jié)果見(jiàn)表5，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各濃度下包衣效果區(qū)別不明顯，但是在操作過(guò)程中，10%和30%的包衣液，等待干燥的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，故本研究暫定包衣液濃度為20%。

表5 包衣液濃度

2.6 片劑包衣增重 當(dāng)包衣增重4%、6%、8%時(shí)， 在pH1.0的人工胃液中120 min內(nèi)均沒(méi)有崩解的片劑，但是增重4%的片劑外觀有軟化現(xiàn)象，故首先排除此方案。進(jìn)一步考查6%、8%的處方片劑在pH6.8的人工腸液中的崩解時(shí)限，分別為18 min和25 min。均滿足本制劑在胃內(nèi)不崩解、不釋放，在人工腸液中能夠快速釋放的制劑要求。本研究選擇包衣增重較小的6%計(jì)入處方。

2.7 包衣工藝對(duì)菌群活力的影響 選用包衣液濃度為20%，包衣增重為6%的處方，在室溫干燥的條件下進(jìn)行包衣。隨機(jī)挑取3個(gè)片劑，研磨后，溶于無(wú)菌生理鹽水中，檢測(cè)包衣前后細(xì)菌活力的變化。與包衣前平均每片4×108個(gè)細(xì)菌相比，隨機(jī)挑取的3個(gè)包衣片中活菌的含量分別為4.94×106、4.25×106和4.10×106，平均接近4.3×106個(gè)活菌/片，表明包衣工序?qū)τ诰旱幕盍τ幸欢ǖ臏缁钭饔?，但是單位制劑量的活菌?shù)均能達(dá)到4×106/片以上。

2.8 片劑制備 根據(jù)試驗(yàn)得到的最佳處方進(jìn)行3批次片劑制備，并檢測(cè)片劑的崩解時(shí)效和細(xì)菌活力。3批次(140401、140402和140403)的平均活菌數(shù)分別為5.1×106、4.50×106和4.99×106/片。崩解時(shí)間分別為21.34、20.45和21.07 min，能夠滿足進(jìn)一步免疫效果檢測(cè)的需要。

2.9 免疫效果檢測(cè) 初始免疫后25 d，隨機(jī)處死3組各5只小鼠，收集血清和小腸灌洗液，進(jìn)行血清特異性IgG和小腸灌洗液特異性SIgA檢測(cè)。正常對(duì)照組(組1)血清特異性IgG的OD450值為0.06，小腸灌洗液總特異性SIgA的濃度為150 ng/mL。組2和組3的血清特異性IgG和小腸灌洗液總SIgA抗體均出現(xiàn)不同程度的增高(圖 1)。其中，組2血清特異性IgG(OD450=0.70)的增高，明顯高于組3(OD450=0.450)(P<0.01)。組3小腸灌洗液中總特異性SIgA濃度(801 ng/mL)的增高明顯高于組2(442 ng/mL)(P<0.01)。

于免疫后25 d，通過(guò)106對(duì)數(shù)期賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體灌胃的方法對(duì)各組小鼠進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)。攻蟲(chóng)后，連續(xù)2周，計(jì)數(shù)每天糞便中的滋養(yǎng)體或包囊，檢測(cè)感染率和減蟲(chóng)率。3組的感染率分別為100%、100%和40%(表6)。其中，組1在攻蟲(chóng)后次日，2只小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，并在腹瀉糞便中查到滋養(yǎng)體，另外3只在第5日開(kāi)始有形糞便中可查到包囊，第5和第6日平均包囊排出數(shù)為15個(gè)/只。組2在攻蟲(chóng)后次日，1只出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀，可查見(jiàn)滋養(yǎng)體，其余4只分別于第5和第6日開(kāi)始在糞便中查到包囊，第5日和第6日平均包囊排出數(shù)為11.5個(gè)/只，同組1相比減蟲(chóng)率為23%(3.5/15)。組3的在第5和第6日的包囊平均排出數(shù)為8，同組1相比減蟲(chóng)率為46.7%(7/15)。

圖1 3組實(shí)驗(yàn)小鼠免疫后血清IgG和小腸灌洗液SIgA檢測(cè)

表6 免疫后賈第蟲(chóng)感染率和減蟲(chóng)率標(biāo)亮處加英文對(duì)照

Tab.6 Infection and reduction rates ofGiardialambliain mouse after immunization

組別Group滋養(yǎng)體Trophozoites包囊Cysts感染率*(%)Infectionrates減蟲(chóng)率*(%)ProtozoanreductionrateGroup12/53/5100-Group21/54/510023Group30/52/54046.7

Note: *P<0.01

3 討 論

減毒沙門菌活載體因其特殊的優(yōu)勢(shì)日漸成為目前基因免疫研究的熱點(diǎn)?；跍p毒沙門菌構(gòu)建的疫苗株可持續(xù)表達(dá)相應(yīng)抗原，不僅刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的體液和細(xì)胞免疫，更可激發(fā)機(jī)體的黏膜免疫。對(duì)于提高機(jī)體的黏膜免疫屏障作用，預(yù)防黏膜病原體的入侵和定植具有重要的意義[14]。目前以減毒沙門菌為載體構(gòu)建的多種口服疫苗均以菌液灌胃方式為主，雖然對(duì)相應(yīng)病原體的感染可以產(chǎn)生很好的免疫效果，但很難對(duì)減毒沙門菌疫苗的使用劑量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

賈第蟲(chóng)是引起人和多種哺乳動(dòng)物腹瀉的主要病原體之一。感染賈第蟲(chóng)后，急性期主要以腹瀉為主，并排出滋養(yǎng)體，而慢性期一般無(wú)明顯癥狀，但糞便中可以檢出包囊[15]。本研究以攜帶α1-giardin DNA的減毒沙門菌為對(duì)象，進(jìn)行腸溶制劑的制備，對(duì)免疫劑量進(jìn)行規(guī)范。通過(guò)免疫后，受染動(dòng)物滋養(yǎng)體和包囊的檢出，對(duì)所制備腸溶疫苗的免疫效果進(jìn)行分析。

在凍干過(guò)程中，由于凍干保護(hù)劑的存在，菌粉普遍存在粘性，具有一定的吸濕性，因此處方中選擇加入少量微分硅膠，以達(dá)到抗粘的作用。稀釋劑選擇成型性較好的微晶纖維素為主，配以適量的淀粉進(jìn)行調(diào)節(jié)，以達(dá)到良好的成型效果。本制劑為腸溶制劑，為保證其良好崩解、迅速釋藥的特性，故選擇崩解效果良好的羧甲基淀粉鈉作為崩解劑進(jìn)行處方研究。此外，為保證制劑制備過(guò)程中顆粒流動(dòng)性良好，選擇硬脂酸鎂作為潤(rùn)滑劑，5%淀粉漿為粘合劑。

本腸溶疫苗制備的重點(diǎn)和難點(diǎn)在于原料菌的活力保持。片劑制備過(guò)程中，進(jìn)行了各種輔料與減毒沙門菌相容性研究。結(jié)果表明，在上述試驗(yàn)條件下，各種輔料不影響減毒沙門菌的活力，能夠很好的應(yīng)用于減毒沙門菌腸溶制劑的制備。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了顆粒干燥溫度和壓片壓力對(duì)于菌活力的影響，結(jié)果顆粒干燥溫度30 ℃，45 min時(shí)菌群失活明顯，所以本研究采用室溫風(fēng)干的方法進(jìn)行顆粒干燥，在大生產(chǎn)過(guò)程中有待進(jìn)一步改進(jìn)。本研究分別選擇壓力40、60和80 KN的片劑進(jìn)行活力檢查，結(jié)果表明，各種壓力下菌群活力沒(méi)有明顯差異，因此壓片過(guò)程中的壓力可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。

此外，根據(jù)本研究包衣過(guò)程存在一定的菌群失活的現(xiàn)象，主要是由包衣過(guò)程中熱風(fēng)干燥引起，且在整個(gè)包衣過(guò)程的初始階段最為明顯。為最大限度的保證菌群活力的保持，干燥過(guò)程中熱風(fēng)的使用應(yīng)該嚴(yán)格控制，在大生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的量化標(biāo)準(zhǔn)。

采用標(biāo)準(zhǔn)免疫流程，初始免疫為1片，隔周1片加強(qiáng)免疫1次。初始免疫后25 d進(jìn)行攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，以減毒沙門菌為載體的腸溶免疫的方式可以產(chǎn)生更有效的減蟲(chóng)率(46.7%)。胃酸對(duì)口服活菌疫苗具有殺傷作用。因此以往直接采用菌液灌胃的免疫，很難對(duì)所用菌量進(jìn)行規(guī)范。而腸溶片劑可避免胃酸的影響，使攜帶有目的抗原DNA的減毒沙門菌直接到達(dá)小腸，呈遞目的抗原，并刺激腸粘膜淋巴細(xì)胞分泌SIgA，有效防止經(jīng)黏膜感染的病原體在腸粘膜表面的定居和致病。

綜上，本研究為多種以減毒沙門菌為載體的DNA疫苗的研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)提供了依據(jù)。然而由于本研究所制備的片劑處方對(duì)細(xì)菌的活力具有一定的影響，因此尚需進(jìn)一步的完善。

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Preparation and immune effect of an anti-Giardiaenteric vaccine using attenuatedSalmonellatyphimuriumas a carrier

CUI Bai-ji,LI Yao,ZHANG Hong-mei,JIANG Xiao-ming,FENG Xian-min

(JilinMedicalUniversity，Changchun132013,China)

This study further investigated the preparation of enteric coated capsule of attenuatedSalmonellacarrying α1-giardin DNA, its immunization regime and vaccine efficacy againstGiardiachallenge. AttenuatedSalmonellacarrying α1-giardin DNA was cultured and freeze lyophilized, then formulated with different ingredients including colloidal silicon dioxide, dispersant (microcrystalline cellulose and starch), lubricants (magnesium stearate), disintegrating agents (sodium starch glycolate), and the coating liquid was at optimized ratio. The enteric formulation was optimized and used for mouse vaccine trial. Total 30 female BABL/c mice were randomly divided into three groups: the first group of 10 mice was just given PBS orally as normal control (Group 1), second group of 10 mice were immunized with recombinant α1-giardin protein intramuscularly as control (Group 2), another 10 mice was orally immunized with enteric capsule of DNA vaccine (Group 3). On day 25 post immunization, five mice from each group were sacrificed and anti-α1-giardin IgG level was measured in sera, IgA antibody measured in intestinal lavage. The remaining five mice from each group were challenged with 105ofGiardiatrophozoites by gavage after being fasted for 10 hours. TheGiardiatrophozoites and cysts were examined in the feces for two consecutive weeks. Based on the compatibility test results, the best formulation was obtained as following composition: colloidal silicon dioxide was as 10% and dispersant (the ratio of microcrystalline cellulose and starch is 2∶1) as 8% of bacterial pellet volume; the amount of lubricant and disintegrant were as 0.8% and 2% of the dose, respectively; concentration of coating liquid was 20%, the coating weight gained 6% of the formulated amount. Each coated capsule contained viable bacteria of 4 × 106or more. Results of immunological tests and challenge showed that the specific anti-α1-giardin IgA level in intestinal lavage in the group given with enteric capsule of DNA vaccine was significantly higher than that in groups of intramuscular immunization and normal control, which reflected on the parasite reduction rate of 46.7% in enteric vaccine compared to normal control that was significant higher than 23% in intramuscular immunization group (P<0.01). This study provides an experimental basis for making DNA vaccine delivered by attenuatedSalmonellaand enteric coated vaccine formulation, however, the formulation still needs to be further optimized for large scale production.

attenuatedSalmonellatyphimurium;Giardialamblia; α1-giardin; enteric vaccine

Feng Xian-min, Email: fengxianmin28@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.009

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81301450，31572262)，吉林省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目(No.20130413035GH)，吉林省教育廳科研項(xiàng)目(No.2014367)和吉林市杰出青年項(xiàng)目(No.201464037)聯(lián)合資助

馮憲敏，Email:fengxianmin28@163.com

吉林醫(yī)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 132013

R378.2

A

1002-2694(2015)12-1129-07

2015-03-20；

2015-07-06

Supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (No. 81301450,31572262), a grant from the Jilin Provincial Science, the Technology Department of China (No. 20130413035GH),a grant from the Education Department of Jilin Province (No. 2014367) and grant for Preeminent Youth Fund of Jilin City(No.201464037)