劉 英,陳 紅,李沛麗,馬 青,王定明,唐光鵬,姚光海,周敬祝,陳崢宏，李世軍

貴州省鉤端螺旋體血清群特異性PCR鑒定結(jié)果與分析

劉 英1,2,陳 紅3,李沛麗4,馬 青1,王定明1,唐光鵬1,姚光海1,周敬祝1,陳崢宏2，李世軍1

目的 采用血清群特異性PCR技術(shù)了解貴州省近年鉤端螺旋體(鉤體)流行菌群，為貴州省鉤體病的防控提供技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。方法 采用致病性鉤體特異性PCR方法(G1/G2-PCR)對來自貴州省近年的鉤體分離菌株進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步應(yīng)用基于致病性鉤體O抗原基因的血清群特異性PCR(O-PCR)對貴州省近年的58株鉤體分離株進(jìn)行血清群鑒定，并采用顯微凝集試驗(yàn)(MAT)對O-PCR方法的檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 G1/G2-PCR檢測結(jié)果顯示58株菌株均為致病性鉤體，O-PCR將58株致病性鉤體菌株鑒定為黃疸出血群，與傳統(tǒng)的MAT法鑒定結(jié)果一致。結(jié)論 O-PCR技術(shù)可作為我省鉤體快速分群鑒定可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)手段，貴州省近年的鉤體流行菌群為黃疸出血群。

鉤端螺旋體；血清群；PCR；貴州

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81260250 and 81401679), the Guizhou Provincial Talent Training Base Project of Infectious Diseases (No. [2013]15) “Sub-project: Research Team of Natural foci and Insect-borne Infectious Diseases Control and Prevention” (No. RCJD1401), and the Program of Natural Science Foundation of Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention (No. 2013-E2-1) Corresponding authors: Li Shi-jun, Email:zjumedjun@163.com;Chen Zheng-hong:Email:chenzhenghong@gm.c.cdu.cn

由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的鉤體病是全球流行的人獸共患傳染病。由于鉤體通過疫水迅速傳播，因而是洪澇、地震等自然災(zāi)害發(fā)生時重點(diǎn)檢測的傳染病之一[1]。貴州省屬自然災(zāi)害高發(fā)省份，近年來鉤體病發(fā)病率雖然有所下降，但散發(fā)和局部暴發(fā)疫情時有發(fā)生，疫情主要集中在黔東南、遵義和銅仁等地區(qū)，近幾年均有死亡病例報告。了解鉤體地方菌株的流行菌群對當(dāng)?shù)劂^體病的預(yù)防和控制至關(guān)重要，本研究采用新近報道的基于鉤體O抗原基因的我國6個鉤體血清群特異性PCR技術(shù)[2]對貴州省近年分離的58株菌株進(jìn)行鑒定和分析，為貴州省鉤體病的防控提供技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鉤體菌株與培養(yǎng) 鉤體菌株為2010-2014年間自貴州省榕江縣、黎平縣、錦平縣的黑線姬鼠Aa(Apodemusagrariuspallas)鼠腎中分離的58株鉤體疑似菌株(表1)。致病性鉤體黃疸出血群(Icterohaemorrhagiae)、賽羅群(Sejroe)、犬群(Canicola)、秋季群(Autumnalis)、流感傷寒群(Grippotyphosa)和七熱群(Hebdomadis)參考菌株，由中國疾病預(yù)防控制中心鉤體實(shí)驗(yàn)室提供。鉤體參考菌株和分離菌株采用含8%兔血清的EMJH培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)5～7 d[3]。

表1 黑線姬鼠鉤端螺旋體分離菌株背景信息

Tab.1 Background information of 58 strains pathogenic Leptospira isolates isolated fromApodemusagrarius

CountyStrainNo.Year榕江Rongjiang黎平LipingG302010G322010LP62201012LP75201212LP64201212LP79201212LP99201212-80201213-9201313-13201313-69201313-76201314-1201414-4201414-5201414-7201414-10201414-112014

表1(續(xù)1)

1.2 診斷試劑 EMJH鉤體培養(yǎng)基為美國BD公司產(chǎn)品(批號：0010120)，硅膠膜型TM基因組DNA提純試劑盒為北京賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)中所用PCR引物和PreMix反應(yīng)體系由北京天一輝生物科技有限公司提供，DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品，鉤體分群診斷血清由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 核酸提取 采用DNA提取試劑盒，按照說明書操作提取經(jīng)培養(yǎng)5～7 d后的鉤體菌株DNA[4]。

1.4 致病性鉤體PCR鑒定 采用致病性鉤體特異的G1/G2-PCR方法對58株鉤體分離菌株進(jìn)行鑒定[5]。采用25 μL PCR反應(yīng)體系，其中含Pre Mix Taq 12.5 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，去離子水7.5 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s、35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.5 血清群特異性PCR鑒定 按照參考文獻(xiàn)[2]提供的我國常見的黃疸出血群、賽羅群、犬群、秋季群、流感傷寒群和七熱群特異性引物及參數(shù)對58株鉤體分離株進(jìn)行檢測，同時采用6個鉤體血清群參考菌株做陽性對照，采用去離子水做陰性對照，擴(kuò)增體系為25 μL，其中含Pre Mix Taq 12.5 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，去離子水7.5 μL，PCR擴(kuò)增參數(shù)為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃30 s、退火30 s(退火溫度見表2)、72 ℃1 min，30個循環(huán)，產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

表2 鉤端螺旋體血清群特異性PCR檢測目的基因及引物序列

1.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照參考文獻(xiàn)提供方法對58株鉤體分離菌株采用MAT方法進(jìn)行血清群鑒定[1]。

2 結(jié) 果

2.1 致病性鉤體PCR鑒定結(jié)果 基于G1/G2引物的致病性鉤體特異性PCR檢測結(jié)果顯示，58株鉤體疑似菌株和陽性對照菌株核酸均擴(kuò)增285 bp大小的的擴(kuò)增片段，而陰性對照未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖1為部分分離菌株G1/G2-PCR擴(kuò)增條帶)。

M: Mark; 1-18: Strain number G30, JP15, 11JP19, LP62, 12JP13, 12LP75, 12LP64, 12LP79, 12LP99, 12-80, 11JP13, 13-135, G32, 13-9, 13-13, 13-69, 13-76, 13-133; 19: Icterohaemorrhagiae; 20: Hebdomadis; 21: Autumnalis; 22: Grippotyphosa; 23: Canicola; 24: Sejroe; 25: Negative control.

圖1 致病性鉤體特異性PCR檢測結(jié)果

Fig.1 Identification ofLeptospirausing G1G2-PCR.

2.2 鉤體血清群特異性PCR鑒定結(jié)果 血清群特異性PCR鑒定結(jié)果顯示，58株鉤體菌株經(jīng)鉤體黃疸出血群特異性引物檢測均出現(xiàn)590 bp的預(yù)期擴(kuò)增片段(圖2為部分菌株黃疸出血群檢測結(jié)果)，而經(jīng)賽羅群、犬群、秋季群、流感傷寒群和七熱群特異性引物擴(kuò)增后均未獲得擴(kuò)增條帶。6個血清群參考菌株經(jīng)相應(yīng)的血清群特異性引物擴(kuò)增后均出現(xiàn)預(yù)期的目標(biāo)條帶，而其余引物及陰性對照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖3)。

M: Mark; 1-18: G30, JP15, 11JP19, LP62, 12JP13, 12LP75, 12LP64, 12LP79, 12LP99, 12-80, 11JP13, 13-135, G32, 13-9, 13-13, 13-69, 13-76, 13-133; 19: Icterohaemorrhagiae; 20: Hebdomadis; 21: Autumnalis; 22: Grippotyphosa; 23: Canicola; 24: Sejroe; 25: Negative control.

圖2 鉤體分離株黃疸出血群特異引物PCR檢測結(jié)果

Fig.2 Identification ofLeptospirausingLeptospiraserogroup icterohaemorrhagiae specific PCR

M: Mark; 1: Icterohaemorrhagiae; 2: Hebdomadis; 3: Autumnalis; 4: Grippotyphosa; 5: Canicola; 6: sejroe; 7: Negative control.

2.3 MAT檢測結(jié)果 MAT檢測結(jié)果顯示，58株鉤體分離菌株均與我國鉤體15群15型鉤體參考菌株抗血清中的黃疸出血群代表菌株抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)，而與其余的賽羅群、犬、秋季、流感傷寒、七熱、爪哇、拜倫、致熱、澳洲、波摩那、明尼、巴達(dá)維亞、塔拉索夫和曼耗群代表菌株抗血清不發(fā)生凝集反應(yīng)。

3 討 論

鉤體病是由致病性鉤體引起的一種全世界廣泛流行的人獸共患傳染病，鉤體血清群、型眾多，其自然宿主動物也多達(dá)200余種，其中以豬、牛等家畜和黑線姬鼠、黃毛鼠等嚙齒類帶菌動物對人類危害最大。帶菌動物從尿液或糞便排出致病性鉤體污染水源或土壤，人類接觸污染了致病性鉤體的疫水/疫土而感染[1,6]。

貴州省疾病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)顯示，貴州省近年來鉤體病發(fā)病率雖然有所下降，但病死率卻呈上升趨勢，散發(fā)和局部暴發(fā)疫情時有發(fā)生，疫情主要集中在黔東南、遵義市和銅仁等地區(qū)，近幾年每年均有死亡病例報告。鉤體病疫情發(fā)生后，一項(xiàng)非常重要的工作就是迅速確定傳染源種類和病原體的鑒定，從而為病人治療和疫情控制提供科學(xué)依據(jù)。鉤體菌群菌型復(fù)雜、分布廣泛，現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)致病性鉤體有18個血清群75個血清型[1, 7]。傳統(tǒng)的鉤體分群方法是顯微鏡凝集試驗(yàn)[1]，該方法存在工作繁瑣、耗費(fèi)時間、主觀性較強(qiáng)等缺點(diǎn)，且需要保存大量的參考菌株并制備各菌株的免疫血清，目前國內(nèi)一般的鉤體病實(shí)驗(yàn)室均不能開展血清學(xué)分型鑒定，這對鉤體病暴發(fā)疫情的調(diào)查和應(yīng)急處理十分不利。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相繼出現(xiàn)了一系列的分子分型技術(shù)如脈沖場凝膠電泳(PFGE)[8-9]、多位點(diǎn)重復(fù)序列分析(MLVA)[9-11]和多位點(diǎn)等位基因測序分型(MLST)[12-13]等技術(shù)，且分析結(jié)果與鉤體血清群具有較好的一致性，在鉤體的鑒定及傳染源的追蹤方面發(fā)揮了一定作用。然而， PFGE技術(shù)所需試劑種類與操作步驟繁多、技術(shù)要求較高、耗時較長、需要專業(yè)軟件分析和參考菌株P(guān)FGE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)果判斷，MLVA 技術(shù)分辨能力雖高，但同樣需要專業(yè)軟件分析和參考菌株MLVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)果判斷，而MLST需要對各等位基因進(jìn)行基因序列測定，采用專業(yè)軟件分析后與參考菌株MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，該方法耗時較長，成本較高。以上分子生物學(xué)技術(shù)存在不利于鉤體菌株血清群的快速鑒別。近年來采用血清型PCR技術(shù)對病原微生物進(jìn)行血清群/型鑒定的技術(shù)相繼出現(xiàn)，該項(xiàng)技術(shù)針對病原微生物脂多糖及其合成相關(guān)基因在微生物血清群或型水平上的特異性設(shè)計引物進(jìn)行PCR檢測而達(dá)到血清群/型鑒定的目的，國內(nèi)學(xué)者Cai Cheng-Song等[2]2010年報道，針對鉤體脂多糖O抗原特異基因設(shè)計的引物可以鑒別我國鉤體常見的6個血清群，包括黃疸出血群(Icterohaemorrhagiae)、Sejroe(賽羅群)、Canicola(犬群)、Autumnalis(秋季群)、Grippotyphosa、(流感傷寒群)和Hebdomadis(七熱群)，并采用75株參考菌株和40株臨床菌株對該方法進(jìn)行了驗(yàn)證，但未見該方法的廣泛應(yīng)用。

本研究中我們采用Cai Cheng-Song等設(shè)計的針對我國常見6個群的鉤體血清群鑒定引物對58株鉤體疑似菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示58株菌株均被擴(kuò)增出黃疸出血群預(yù)期的590 bp的特異性條帶，而其余5個血清群特異性引物均未擴(kuò)增出DNA條帶，表明58株菌均屬黃疸出血群。為了評估檢測結(jié)果的可靠性，我們采用MAT實(shí)驗(yàn)對O-PCR檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示O-PCR檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的MAT檢測方法結(jié)果完全一致，符合率為100%。本研究結(jié)果提示O-PCR技術(shù)可作為鉤體快速分群鑒定可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)手段，貴州省近年的鉤體流行菌群為黃疸出血群，該研究結(jié)果將為貴州省鉤體病的預(yù)防和控制提供可靠的技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)，對當(dāng)?shù)劂^體病的有效防控具有重要意義。

[1]Yan J, Dai BM, Yu ES. Leptospirosis[M]. 3rd Ed, Beijing: People’s Medical Publishing House, 2006：1-3. (in Chinese) 嚴(yán)杰,戴保民,于恩庶.鉤端螺旋體病學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006：1-3.

[2]Cai CS, Zhu YZ, Zhong Y, et al. Development of O-antigen gene cluster-specific PCRs for rapid typing six epidemic serogroups ofLeptospirain China[J]. BMC Microbiol, 2010, 10: 67. DOI: 10.1186/1471-2180-10-67

[3]Li SJ, Zhang CC, Li XW, et al. Molecular typing ofLeptospirainterrogansstrains isolated fromRattustanezumiin Guizhou Province, Southwest of China[J]. Biomed Environ Sci, 2012, 25(5): 542-548.

[4]Li SJ, Wang DM, Zhang CC, et al. Molecular typing ofLeptospiraspp. strains isolated from field mice confirms a link to human leptospirosis[J]. Epidemiol Infect, 2013, 141(11): 2278-2785.

[5]Li SJ, Zhang CC, Tang GP, et al. Carrier monitoring of rodents and bacterial typing ofLeptospirainsolated in the leptospirosis epidemic areas of Guizhou Province[J]. Chin J Prevent Med, 2013, 47(3): 280-281. (in Chinese) 李世軍,張翠彩,唐光鵬,等.貴州省2011年鉤端螺旋體病疫區(qū)鼠類動物帶菌監(jiān)測與菌株分型[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2013,47(3):280-281.

[6]Zhang C, Wang H, Yan J. Leptospirosis prevalence in Chinese populations in the last two decades[J]. Microbes Infect, 2011, 14: 1-7.

[7]Yersin C, Bovet P, Merien F, et al. Pulmonary haemorrhage as a predominant cause of death in leptospirosis in Seychelles[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2000, 94: 71-76.

[8]Jiang XG, Xiao YC, Nie YX, et al. Identification ofLeptospirainterrogansby pulsed field gel electrophoresis[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2001, 21(4): 378-381. (in Chinese) 蔣秀高,肖玉春,聶一新,等.致病性鉤端螺旋體脈沖場凝膠電泳圖譜分型研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2001,21(4):378-381.

[9]Guo ZQ, Huang ZY, Chen N, et al. Molecular typing ofLeptospirainterrogansfrom Sichuan province by pulsed field gel electrophoresis[J]. J Prev Med Infor, 2007, 23(6): 644-646. (in Chinese) 郭宗琪,黃自英,陳娜,等.四川省致病性鉤端螺旋體脈沖場電泳分型分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志，2007,23(6):644-646.

[10]Slack A, Symonds M, Dohnt M, et al. An improved multiple-locus variable number of tandem repeats analysis forLeptospirainterrogansserovar Australis: a comparison with fluorescent amplified fragment length polymorphism analysis and its use to redefine the molecular epidemiology of this serovar in Queensland, Australia[J]. J Med Microbiol, 2006, 55(11): 1549-1457.

[11]Zhang CC, Nie YX, Li XW, et al. Study on the MLVA typing ofLeptospiraserogroup icterohaemorrhagiae[J]. Chin J Microbiol Immun, 2009, 29(12): 1144-1147. (in Chinese) 張翠彩,聶一新,李秀文,等.黃疸出血群鉤端螺旋體MLVA分型研究 [J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2009,29(12): 1144-1147.

[12]Thaipadungpanit J, Wuthiekanun V, Chierakul W, et al. A dominant clone ofLeptospirainterrogansassociated with an outbreak of human leptospirosis in Thailand[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2007, 1(1): e56.

[13]Li S, Wang D, Zhang C, et al. Source tracking of human leptospirosis: serotyping and genotyping ofLeptospiraisolated from rodents in the epidemic area of Guizhou province, China[J]. BMC Microbiol, 2013, 13: 75. DOI: 10.1186/1471-2180-13-75

Serogroup identification and analysis ofLeptospiraisolates using serogroup specific PCR in Guizhou Province, China

LIU Ying1,2,CHEN Hong3,LI Pei-li4,MA Qing1,WANG Ding-ming1, TANG Guang-peng1,YAO Guang-hai1,ZHOU Jing-zhu1，CHEN Zheng-hong2,LI Shi-jun1

(1.GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang50004,China； 2.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China; 3.GuiyangCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Guiyang50004,China4.AnimalScienceCollegeofGuizhouUniversity,Guiyang50004,China)

In order to understand the epidemic serogroup of pathogenicLeptospiraand provide technical methods and scientific basis for the control and prevention of leptospirosis, the serogroup ofLeptospiraisolates collected in Guizhou Province were identified and analyzed by using O-antigen gene based serogroup-specific PCR. A total of 58 strains of leptospires collected from Guizhou Province in recent years were detected with pathogenic leptospire specific PCR (G1/G2-PCR) and further identified using O-antigen gene based PCR (O-PCR) which is specific for the serogroups of pathogenicLeptospira. Results were then confirmed with conventional microscope agglutination test (MAT). G1/G2-PCR detection results showed that all of the 58 isolates were pathogenic leptospires. O-PCR identified the 58 isolates asLeptospiraserogroup icterohaemorrhagiae, which was consistent with the results of conventional MAT. Results of this study indicate that O-PCR can be used as a reliable tool forLeptospiraserogroup identification in Guizhou Province, and the results of O-PCR indicated thatLeptospiraserogroup icterohaemorrhagiae was the epidemic serogroup ofLeptospirain Guizhou Province in recent years.

Leptospira; serogroup; PCR; Guizhou

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.012

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81260250, No.81401679)、貴州省傳染病人才培養(yǎng)基地項(xiàng)目(黔人領(lǐng)發(fā) [2013]15)“自然疫源性和蟲媒傳染病研究團(tuán)隊(No.RCJD1401)”和貴州省疾病預(yù)防控制中心科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(No.2013-E2-1)聯(lián)合資助

李世軍，Email：zjumedjun@163.com 陳崢宏，Email：chenzhenghong@gmc.edu.cn

1.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué), 貴陽 550025; 3.貴陽市動物疫病預(yù)防控制中心，貴陽 550004; 4.貴州大學(xué)動物科學(xué)院，貴陽 550025

R514.4

A

1002-2694(2015)12-1146-05

2015-06-01；

2015-08-07