李易明 劉宇琨 劉競 劉釗 高璇 王宏 李文建

·論著·

多藥耐藥相關(guān)蛋白在乳腺癌患者外周血單個核細胞中的表達研究

李易明 劉宇琨 劉競 劉釗 高璇 王宏 李文建

目的檢測健康人和乳腺癌患者外周血單個核細胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)基因的表達水平，探討MRP在乳腺癌患者中的可能作用。方法抽取20例健康人和50例乳腺癌患者外周血，運用ELISA法檢測2組實驗對象血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、白介素6(IL-6)細胞因子的含量;提取外周血中單個核細胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMCs)，后用熒光實時定量PCR和Western blot技術(shù)檢測BCRP和MRP2/3/4/5 mRNA和相應(yīng)蛋白表達情況。結(jié)果ELISA法檢測乳腺癌患者外周血血清中TNF-α、IL-8、IL-6細胞因子的含量明顯高于健康人對照組(P＜0.05);熒光實時定量PCR檢測BCRP和MRP5的mRNA表達水平高于健康人對照組(P＜0.05)，其余MRP沒有顯著性差別(P＞0.05);Western blot檢測蛋白表達與mRNA結(jié)果一致。結(jié)論乳腺癌患者外周血中的促炎因子含量的升高與BCRP和MRP5的表達調(diào)控有一定關(guān)系，具體相關(guān)機制有待進一步研究。

乳腺腫瘤;外周血;單個核細胞;多藥耐藥相關(guān)蛋白

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一，當(dāng)前其發(fā)病率有明顯增長的趨勢，現(xiàn)已躍居全球女性發(fā)病率排行之榜首，占全身惡性腫瘤7%～10%。目前仍以手術(shù)切除加化療為主要的治療手段，從而降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)或者遠處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。但由于腫瘤多藥耐藥性(multidurg resistance，MDR)的產(chǎn)生，導(dǎo)致乳腺癌患者復(fù)發(fā)率高，化療的療效欠佳。腫瘤多藥耐藥的機制涉及多個因素［1］，其中能降低胞漿或胞核中毒性藥物濃度的ABC(ATP binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運蛋白家族備受研究者關(guān)注。ABC轉(zhuǎn)運蛋白全稱為ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運蛋白，是膜轉(zhuǎn)運蛋白家族中的一類特殊蛋白［2.3］，其能與ATP結(jié)合并水解釋放能量。這些跨膜轉(zhuǎn)運蛋白能夠介導(dǎo)多種底物分子(糖類、氨基酸、金屬離子、小分子肽、蛋白以及疏水性化合物)在細胞內(nèi)外的運輸［4］。ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中有10種與耐藥密切相關(guān)的基因［5，6］。這10種基因有可能是腫瘤細胞免受化療藥物攻擊的重要防御機制。因此，逆轉(zhuǎn)MDR成為腫瘤研究中的重要課題。研究表明，在正常組織和腫瘤組織中均有MRP的存在［7，8］，但是對MRP在骨髓和外周血中分布情況，鮮有報道。本課題以健康人和乳腺癌患者外周血單個核細胞為研究對象，運用熒光實時定量PCR技術(shù)和蛋白免疫印跡法檢測PBMCs中的MRP，從mRNA和蛋白水平檢測多藥耐藥相關(guān)蛋白在PBMCs中的表達，比較它們之間的差異，從而找出可能在乳腺癌耐藥中起關(guān)鍵作用的耐藥基因，為臨床治療乳腺癌提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料觀察對象為2011年4月至2012年4月石家莊市第一醫(yī)院普外科門診確診的乳腺癌患者共50例，年齡54～81歲，平均年齡(68±8)歲;對照組20例，為本院體檢中心經(jīng)健康體檢合格的健康人，無心、肝、肺、腎等重要臟器疾患，肝腎功能試驗正常，亦無自身免疫性疾病和感染，年齡52～82歲，平均年齡(67± 7)歲。2組一般資料具有均衡性。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備NycoprepTM1.077A人淋巴細胞分離液(挪威Axisshield公司);Trizol試劑(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I Master(日本TOYOBO公司);測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、白介素-6(IL-6)的ELISA試劑盒、鼠抗人BCRP和MRP2/3/4/5單抗(美國eBioscience公司);蛋白酶抑制劑、去磷酸化酶抑制劑和βactin抗體(美國Sigma公司);Western blot試劑和標(biāo)準(zhǔn)Marker(美國Bio-Rad公司);實時定量PCR儀(美國ABI公司);蛋白電泳(美國Bio-Rad公司)

1.3 標(biāo)本采集采集健康正常人和乳腺癌患者靜脈血30 ml，采集后1 h內(nèi)，吸出血清，分裝Eppendorf管，置-20℃冰箱保存。另抗凝留取靜脈血，以密度梯度離心法分離外周血PBMCs。

1.4 外周血提取單個核細胞將收集的約30 ml肝素抗凝的外周血用Hark’s液稀釋1倍，緩慢加到NycoprepTM1.077A人淋巴細胞分離液上，2 000 r/min離心20 min，吸取中間白膜層，提取單個核細胞。

1.5 血清中促炎因子的ELISA檢測收集外周血上清，TNF-α、IL-8、IL-6濃度的檢測采用雙抗體夾心ELISA法，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.6 MRP mRNA表達水平的定量分析用Trizol裂解單個核細胞提取總RNA，取1 μg總RNA在反應(yīng)體積為10 μl的逆轉(zhuǎn)錄管中進行逆轉(zhuǎn)錄，5×ExScriopt buffer 2 μl，dNTP Mixture 0.5 μl，Oligo dT 0.5 μl，Ex-Scriopt RTase 0.5 μl，RNase Inhibitor 0.25 μl，RNase free water up to 10 μl。反轉(zhuǎn)錄條件為65℃10 min，42℃溫育60 min，72℃10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，終止反應(yīng)，-20℃保存。用Real-time PCR Master Mix kit進行定量PCR檢測，包括cDNA，上下游引物，SYBR Green Real-time PCR Master Mix。按下反應(yīng)體系進行:5 μl cDNA，0.3 μl上下游引物，7.5 μl SYBR Green，水補齊至15 μl。反應(yīng)條件如下:95℃60 s，95℃15 s，40循環(huán)，60℃60 s。數(shù)據(jù)分析以人GAPDH表達量為參照采用△△Ct法進行相對定量分析。引物見表1。

表1 Real-time PCR檢測基因引物序列

1.7 Western blot蛋白印跡用RIPA細胞裂解液裂解細胞，離心取上清液后進行蛋白定量。制備的蛋白樣品進行10%SDS-PAGE電泳分離，再以400 mA恒流電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入一抗4℃孵育過夜，次日TBS-T洗滌3次，10 min/次，加入辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再TBS-T洗滌3次，10 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光檢測信號。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人血清中細胞因子的檢測采用ELISA法檢測健康正常人和乳腺癌患者的外周血血清中的TNF-α、IL-8、IL-6的含量。乳腺癌患者血清中炎性因子含量明顯高于健康正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.2 MRP mRNA在健康正常人和乳腺癌患者外周血

PBMCs中的表達水平采用實時定量PCR技術(shù)檢測各組外周血PBMCs中的BCRP和MRP 2/3/4/5的mRNA的表達。各MRP及GAPDH的PCR產(chǎn)物熔解曲線呈單一峰，峰形狀銳利，說明PCR產(chǎn)物特異性高，無雜帶。健康人PBMCs中BCRP和MRP2-5mRNA表達很低，乳腺癌患者PBMCs中，BCRP和MRP2-5mRNA表達均高于健康人組，但BCRP和MRP5的mRNA表達要明顯高于健康人組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);MRP2、MRP3和MRP4的mRNA表達和健康組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表2 人血清中細胞因子的含量ng/L，±s

表2 人血清中細胞因子的含量ng/L，±s

注:與健康人組比較，*P＜0.05

組別TNF-αIL-8IL-6健康人組(n=20)15.0±2.819±418±3乳腺癌組(n=50)24.8±5.6*45±6*31±6*

表3 Real-time PCR檢測PBMCs中MRP mRNA的表達±s

表3 Real-time PCR檢測PBMCs中MRP mRNA的表達±s

注:與健康人組比較，*P＜0.05

組別BCRPMRP2MRP3MRP4MRP5健康人組(n=20)0.98±0.231.87±0.130.91±0.211.93±0.181.97±0.29乳腺癌組(n=50)8.21±2.35*1.97±0.110.92±0.191.99±0.094.82±1.79*

2.3 MRP蛋白產(chǎn)物在健康正常人和乳腺癌患者外周血PBMCs中的表達水平采用Western blot技術(shù)檢測各組外周血PBMCs中的BCRP和MRP2-5的蛋白表達水平的差異。檢測結(jié)果與基因表達水平一致，乳腺癌患者PBMCs中BCRP和MRP5的灰度值分別為(1.98±0.47)和(1.86±0.51)，而健康人分別為(0.11±0.03)和(0.19±0.07)，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示乳腺癌患者比正常人更易對藥物產(chǎn)生耐藥性。見圖1。

圖1 Western blot檢測PBMCs MRP蛋白的表達

3 討論

臨床腫瘤學(xué)研究已表明，炎癥與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，15%～20%的腫瘤是由炎癥引起的［9-12］。同時，在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，炎癥可以誘導(dǎo)體內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運蛋白表達和活性改變。炎癥引發(fā)腫瘤的同時又可以使藥物轉(zhuǎn)運蛋白的表達和活性改變，這使得腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，也是腫瘤內(nèi)科治療失敗的主要原因。本研究中，運用ELISA法檢測實驗對象血清中的促炎因子，闡明炎癥影響轉(zhuǎn)運體表達及活性的是有一定的相關(guān)性。

MDR的產(chǎn)生涉及多個方面，多個環(huán)節(jié)及多條途徑，其中主要有兩方面的原因:一是ABC轉(zhuǎn)運蛋白，其將胞漿或胞核中毒性藥物轉(zhuǎn)運到胞膜外，從而降低胞內(nèi)的毒性藥物濃度，二是腫瘤細胞中的化療藥物對腫瘤細胞所誘導(dǎo)的凋亡信號和凋亡通路的激活被抑制。過去炎癥對藥物轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)的研究重點一直是癌變的組織、細胞中MDR的分布及調(diào)節(jié)。Patrick等［7］用IL-1β、IL-6刺激HepG2后，檢測到MRP1蛋白表達量和功能活性增加。Kohno等［11］研究表明LPS刺激大鼠后，Mrp1 mRNA表達水平增加，而在人單細胞源的巨噬細胞中，gp120誘導(dǎo)及分泌的TNF-α和IL-6與MRP1的mRNA表達無關(guān)。但關(guān)于人外周血中炎性因子對BCRP及MRP2/3/4/5調(diào)控的研究報道很少。

本研究實驗數(shù)據(jù)顯示乳腺癌患者PBMCs中BCRP、MRP5 mRNA和蛋白表達水平明顯高于健康正常人組，也高于其他MRP。最近分子靶向治療研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子通過不同的信號通路調(diào)控各種ABC轉(zhuǎn)運體的表達［13，14］。Kim等［14］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以抑制NF-κB和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，從而下調(diào)MDR1的表達。本實驗結(jié)果表明BCRP、MRP5的表達上調(diào)可能是乳腺癌患者外周血中的促炎因子與PBMCs表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活NF-κB，其使細胞進一步釋放炎性細胞因子，從而使BCRP、MRP5的表達上調(diào)，降低抗腫瘤藥物的療效。

文獻報道，化療藥物可以使腫瘤細胞中RAS癌基因表達增加，其激活PI3K/AKT通路，活化的PI3K/ AKT通路激活NF-κB，產(chǎn)生炎性反應(yīng)，釋放出的細胞因子調(diào)節(jié)MRP的表達和功能活性，從而出現(xiàn)腫瘤細胞耐藥性［15，16］。其機制可能是化療藥物在殺傷癌細胞的同時，對正常細胞也有造成一定的損傷，是其細胞結(jié)構(gòu)被破壞，從而釋放住一些細胞因子，這些細胞因子通過相應(yīng)受體進行介導(dǎo)炎性反應(yīng)，激活NF-κB，進一步釋放細胞因子來改變MRP的表達和活性功能，其將輸入的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物從細胞中泵出，從而產(chǎn)生耐藥效應(yīng)。

綜上所述，本研究分析了乳腺癌患者外周血中MRP的mRNA和蛋白表達水平的差異。實驗結(jié)果顯示乳腺癌患者外周血中MRP的異常表達很可能與促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6有密切關(guān)系，但促炎因子如何影響MRP，以及通過何種信號通路調(diào)節(jié)MRP有待進一步研究。

1桂賢，劉會敏.腫瘤多藥耐藥發(fā)生機制的研究進展.上海醫(yī)學(xué)，2005，28:161-164.

2Allikniets R，Gerrard B，Hutehinson A，et al.Characterization of the human ABC superfamily:isolation and mapping of 21 new genes using the expressed sequence tgas database.Hum Mol Genet，1996，5:164-165.

3Higgins CF.ABC transpoertrs:from microorganisms to man.Annu Rev Cell Biol，1992，8:97-113.

4Dean M，Hamon Y，Chimini G.The human ATP-binding cassette(ABC) transporter superfamily.J.Lipid Res，2001，42:1007-1017.

5Michael D，Andrey R，Rando A.The human ATP-biding cassette(ABC) transporter superfamily.Genome Res，2001，11:1156-1166.

6Michael D，Tito F，Susan B.Tumor stem cells and drug resistance.Nat Rev Cancer，2005，5:275-284.

7Patrick T，Tamima A，Reina B.Regulation of multidrug resistance protein 1 by tumor necrosis factorαin cultured glial cells:involvement of nuclear factor-κB and c-Jun N-Terminal Kinase Signaling Pathways.Mol Pharmacol，2010，77:644-659.

8Ombretta T，Nicola G，F(xiàn)rancesca F.Expression levels of MDR1，MRP1，MRP4，and MRP5 in peripheral blood mononuclear cells from HIV infected patients failing antiretroviral therapy.Journal of Medical Virology，2008，80，766-771.

9Biedler JL，Riehm H.Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro:cross-resistance，radio auto graphic，and cytogenetic studies.Cancer Res，1970，30:1174-1184.

10Miao ZH，Ding J.Transcription fact or c-Jun activation represses mdr-1 gene expression.Cancer Res，2003，63:4527-4532.

11Kohno M，Pouyssegur J.Targeting the ERK signaling pathway in cancer therapy.Ann Med，2006，38:200-211.

12Gottesman MM，Pastan I.Biochemistry of multidrug-resistance mediated by the multiding transorter.Annu Rev Biochen，1993，62:385.

13楊婷婷，薛天陽，許偉.NF-κB抑制劑PDTC逆轉(zhuǎn)K562/AO2細胞耐藥性及其機制的研究.中國實驗血液學(xué)雜志，2010，18:903-908.

14Kim HG，Hien TT，Han EH，et al.Metformin Inhibits P—glycoproteinexpression via the NF—kappa B pathway and CRE transcriptionalactivity through AMPK activation.Br J Pharmacol 2011，162:1096-1108.

15Nam SY，Lee HS，Jung GA，et al.Akt/PKB activation in gastric carcinomas correlates with clinicopathologic variables and prognosis.APMIS，2003，111:1105-1113.

16Cantley LC.the phosphoinositide 3-kinase pathway.Science，2002，296: 1655-1657.

Expressions of multidrug resistanc-associated protein in peripheral blood mononuclear cells in patients with breast

cancer

LI Yiming*，LIU Yukun，LIU Jing，et al．Hebei Mechical University，Shijiazhuang 050031，China

ObjectiveTo investigate the expression of multidrug resistance-associated protein(MRP)in peripheral blood monouclear cells(PBMCs)of healthy people and patients with breast cancer，and to explore their possible roles in the pathogenesis of breast cancer.MethodsThe levels of TNF-α，IL-8 and IL-6 in serum were detected by ELISA in 50 patients with breast cancer(patients group)and 20 healthy subjects(control group).After the PBMCs in both groups were extracted，the expression levels of breast cancer resistance protein(BCRP)and MRP2/3/4/5 mRNA were detected by Real-time quantitative RT-PCR and Western blotting.ResultsThe levels of TNF-α，IL-8 and IL-6 in patients group were significantly higher than those in control group(P＜0.05).The expression levels of BCRP and MRP5 mRNA were significantly increased，as compared with those in control group(P＜0.05)，however，there were no significant differences in the other kinds of MRP between two groups(P＞0.05).ConclusionThe increase of proinflammatory factors in peripheral blood of patients with breast cancer may be correlated to the expressions of BCRP and MRP5，however，the related mechanism needs to be studied further.

breast neoplasms;peripheral blood;PBMCs;MRP

R 737.9

A

1002-7386(2015)02-0176-04

2014-05-30)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．004

050031石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院(李易明、劉釗);石家莊經(jīng)濟學(xué)院華信學(xué)院(劉宇琨);河北省石家莊第一醫(yī)院普外一科(劉競);河北醫(yī)科大學(xué)(高璇、李文建);河北省保定市第一中心醫(yī)院分院(王宏)

李文建，050017河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室; E-mail:liwenjian969@sohu.com