馬茜 朱潔 王辛 王愛紅

牛肉水煮液對腦缺血大鼠外周血白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的影響

馬茜 朱潔 王辛 王愛紅

目的 觀察不同劑量牛肉水煮液對局灶性腦缺血大鼠血清白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響。方法 將60只雄性SD大鼠隨機分成假手術組、模型組及低劑量〔200 mg/(kg·d)〕、中劑量〔400 mg/(kg·d)〕和高劑量〔600 mg/(kg·d)〕牛肉水煮液組，每組12只。采用線栓法復制局灶性大腦中動脈缺血模型，造模后2 h用Longa法對大鼠進行神經功能評分，造模后7 d，再次進行神經功能評分；用2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色法測定腦梗死體積；用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定血清IL-6、TNF-α水平。結果 造模2 h和7 d后，各劑量牛肉水煮液組Longa評分和模型組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；和模型組相比，中、高劑量牛肉水煮液組大鼠腦梗死體積分數(shù)明顯減小(P<0.01)；與假手術組相比，模型組血清IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.01)，給予高劑量牛肉水煮液組可明顯降低其水平(P<0.01，P<0.05)。結論 高劑量牛肉水煮液可顯著改善腦缺血大鼠的腦梗死體積，降低血清IL-6、TNF-α水平，這可能是牛肉水煮液對腦缺血神經損傷的保護作用機制之一。

牛肉水煮液；局灶性腦缺血；白細胞介素-6；腫瘤壞死因子-α

腦卒中是世界第三大致死性疾病，其中缺血性腦卒中占85%[1]，是最常見的類型。隨著對缺血性腦損傷的機制研究越來越深入，腦缺血后的炎性反應及其損傷作用日益受到關注。在腦缺血損傷病理過程中有許多炎性介質參與，白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)均是重要的炎性細胞因子，二者相互作用[2]，在腦缺血后炎性反應中起重要作用。本課題組前期開發(fā)的牛肉水煮液中含有豐富的肌肽，而肌肽能調節(jié)腦缺血后的免疫功能，具有腦保護作用[3]。本研究通過觀察富含肌肽的牛肉水煮液對腦缺血后血清炎性因子IL-6、TNF-α水平的影響，旨在探討其對腦缺血大鼠炎性損傷的作用。

1 材料和方法

1.1 動物 成年健康雄性SD(SpragueDawley)大鼠60只，SPF級，體質量(300±20)g，合格證號：SCXK(京)2012-0001，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)溫度控制在(19～26)℃，12h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水，實驗前適應性飼養(yǎng)1周，造模前12h禁食。

1.2 主要試劑和儀器 包括栓線(北京沙東生物技術有限公司)、大鼠IL-6血清檢測ELISA試劑盒(南京建成生物公司)、大鼠TNF-α血清檢測ELISA試劑盒(南京建成生物公司)、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC，美國Sigma公司)、RE-52A旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器公司)、酶標儀(VICTORTMX3，美國PerkinElmer公司)、臺式高速離心機(Allegra64R，美國BeckMan公司)、恒溫隔水培養(yǎng)箱(GNP-9050，上海精宏儀器公司)。

1.3 方法

1.3.1 牛肉水煮液制備：精選牛腿肉，去血、去油脂，準確稱重1kg，切成2cm3的方塊，用絞肉機將肉塊絞成肉糜。將自來水和肉糜同放入鍋中，牛肉糜/水=1∶2，利用功率調節(jié)器，使牛肉湯2h沸騰，沸騰后繼續(xù)熬制10h，總計12h。撇去浮油，倒出牛肉湯后，用漏勺把湯中的牛肉大體濾除，再用紗布二次過濾，最終得到牛肉水煮液約1500mL。最后用旋轉蒸發(fā)儀濃縮25倍，得到約60mL濃縮液。經S-433D型全自動氨基酸分析儀分析，濃縮液中肌肽含量為36.34mg/mL，占氨基酸總量的63.05%。

1.3.2 腦缺血模型制作與分組：參照Longa等[4]線栓法制作大鼠右側大腦中動脈閉塞(MCAO)模型。假手術組操作步驟同MCAO模型，血管分離后不插線栓。 采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為假手術組、模型組及低、中、高劑量牛肉水煮液組，每組12只。排除造模失敗、死亡和血標本發(fā)生溶血的情況，最終各組用于統(tǒng)計數(shù)據分析的大鼠只數(shù)分別為假手術組8只，模型組9只，低劑量牛肉水煮液治療組6只，中劑量牛肉水煮液治療組6只，高劑量牛肉水煮液治療組9只。

1.3.3 給藥：根據《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》[5]及動物與人劑量換算方法[6]，牛肉水煮液劑量的確定以湯中肌肽含量為標準，低、中、高劑量組分別按體質量200、400、600mg/(kg·d)牛肉水煮液灌胃，分別相當于人體推薦攝入量的10、20、30倍。于術后2h第1次給藥，之后每天早晚各給藥1次，持續(xù)7d。假手術組和模型組給予相同體積的生理鹽水。

1.3.4 神經功能評分：采用Longa等[4]評分方法，于大鼠MCAO術后清醒約2h和7d兩個時間點進行神經功能缺損評分。評分標準為：0分，無神經功能缺失，活動正常；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，爬行時出現(xiàn)向癱瘓側轉圈；3分，爬行時向癱瘓側傾倒；4分，不能自行行走，有意識障礙。得分越高表明神經功能缺損程度越重，相反損害較輕。術后評分1～3分者為MCAO模型制作成功；0分、4分者均視為MCAO模型制作失敗，剔除。

1.3.5 腦組織切片TTC染色：術后7d，將每組6只大鼠用10%(體積分數(shù))水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，迅速在冰皿上斷頭取腦，放入-20 ℃冰箱冰凍20min，將其置于大鼠腦切片模具中，去嗅球和低位腦干，間隔2mm連續(xù)冠狀切片5片，將腦片置入2%(質量濃度)TTC溶液中，在37 ℃條件下避光孵育30min。正常腦組織為深紅色，腦梗死區(qū)呈灰白色。再將腦片置于4%(質量濃度)多聚甲醛中固定24h，用數(shù)碼相機拍照，ImagePro-Plus6.0分析圖像。腦梗死體積分數(shù)(%)=患側梗死面積/對側半腦面積×100%。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)：術后7d，各組大鼠用10%(體積分數(shù))水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，左心室取血，全血在37 ℃環(huán)境下孵育30min，以587 g離心10min(低溫)，吸取上清，立即放入-80℃冰箱冷凍保存。采用ELISA方法檢測血清中IL-6、TNF-α的水平，實驗方法嚴格按照試劑盒說明書逐步操作，最后在酶標儀450nm處測吸光度〔D(λ)〕值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件包分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示(腦梗死體積、血清IL-6、TNF-α水平)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，兩兩比較采用LSD法；不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)(第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù))表示，采用多個獨立樣本的非參Kruskal-Wallis檢驗(神經功能評分)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 假手術組未見神經功能缺損表現(xiàn)，模型組和牛肉水煮液組造模后均出現(xiàn)肢體癱瘓，且各劑量牛肉水煮液組神經功能評分與模型組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。造模后7d，模型組和治療組仍存在神經功能缺陷，和模型組相比，各劑量的牛肉水煮液治療組神經功能評分均呈下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表 1 各組大鼠神經功能評分的比較

注：表中數(shù)據為中位數(shù)(第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù))

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 假手術組腦組織無梗死灶，模型組和各治療組右側大腦中動脈供血區(qū)的大腦皮質、紋狀體等處可見明顯梗死灶(圖1)。模型組以及低、中、高劑量牛肉水煮液組腦梗死體積分數(shù)分別為(40.82±4.86)%、(33.95±3.62)%、(21.76±3.54)%、(21.19±5.50)%，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=4.463，P<0.05)，且中、高劑量牛肉水煮液組腦梗死體積分數(shù)較模型組減小(P<0.01)。

圖1 各組大鼠腦缺血7 d后腦梗死體積比較(TTC染色)

2.3 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較 模型組大鼠腦缺血后7 d，IL-6和TNF-α水平與假手術組比較明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，高劑量牛肉水煮液組IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.01和P<0.05)；另外，高劑量牛肉水煮液組IL-6水平較低劑量組顯著降低(P<0.05)。具體結果見表2。

表 2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較

注：IL-6：白細胞介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

3 討論

缺血性腦血管病是常見病、多發(fā)病，病死率和致殘率均高。腦缺血后損傷是一個復雜的病理級聯(lián)反應，其發(fā)病機制包括細胞內炎性反應、氧化應激、Ca2+穩(wěn)態(tài)失調等，其中過度炎性免疫反應存在于腦梗死壞死及缺血區(qū)域，導致炎性損傷。IL-6和TNF-α作為重要的炎性細胞因子，是炎癥損傷信號鏈中的上游信號分子，介導了炎性損傷和損傷修復信號網絡的啟動。腦缺血損傷早期，局部受損的神經元、大腦血管內皮細胞及活化小膠質細胞和星形膠質細胞可釋放炎性細胞因子IL-6和TNF-α，介導局部炎性反應。隨著血液再通或血-腦屏障結構的破壞，中樞腦區(qū)炎性損傷相關的炎性反應信號可通過血液傳遞至外周，活化外周免疫系統(tǒng)中的炎性細胞，釋放炎性因子[7]。該研究結果顯示，模型組大鼠外周血清中可見大量IL-6和TNF-α表達，并且在腦缺血后7 d，表達仍高于正常狀態(tài)。這與既往研究結果一致[8-9]。

中醫(yī)古籍《醫(yī)林纂要》指出，“牛肉味甘，專補脾土”?！侗静菔斑z》也指出，牛肉“消水腫，除濕氣，補虛，令人強筋骨、壯健”。牛肉湯入藥始見于朱丹溪《格致余論·倒倉論》中“倒倉法”，所用之藥，只黃牛肉一味，丹溪云可“治癱、癆、蠱、癩諸證”，且具有寓攻于補，攻邪而不傷正，扶正而不助邪的特點?，F(xiàn)代營養(yǎng)學研究也表明，牛肉富含蛋白質、B族維生素及礦物質(鉀、鋅、鎂、鐵等)[10]，具有抗氧化、增強免疫力、促進蛋白質的新陳代謝和合成、增強肌力的作用。牛肉中蛋白質含量尤其豐富，由人體必需的8種氨基酸組成，且比例均衡，熬制成湯后，很多水溶性的氨基酸溶解到湯中，湯刺激胃酸分泌，更利于營養(yǎng)吸收。腦卒中患者由于能量大量消耗，容易出現(xiàn)負氮平衡，低蛋白血癥，造成營養(yǎng)不良[11]，而營養(yǎng)不良是感染等并發(fā)癥的重要基礎，也是影響腦卒中預后的重要原因之一，牛肉及牛肉湯中富含各種優(yōu)質蛋白，對腦卒中后患者營養(yǎng)的補充有益。2012年賓州大學的一項研究[12]發(fā)現(xiàn)，每天食用4.0～5.4盎司瘦牛肉，與開始實驗時比較，其低密度脂蛋白(LDL)降低了10%，而LDL升高是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的主要脂質危險因素，是腦卒中發(fā)生的關鍵所在。

此外，本課題組前期采用簡單工藝制作牛肉水煮液，經S-433D型全自動氨基酸分析儀檢測，其中肌肽含量豐富。肌肽是一種含組氨酸的二肽，一般存在于脊椎動物骨骼肌中，以往研究表明[13]，肌肽具有抗氧化、抗凋亡、抗炎性反應、清除自由基、抗糖基化、調節(jié)免疫等作用，從而發(fā)揮腦保護作用，減輕腦缺血損傷。本課題組前期研究顯示肌肽可調節(jié)外周血T淋巴細胞亞群表達，改善外周免疫抑制狀態(tài)[3]，進一步證實了肌肽對缺血性腦卒中的免疫調節(jié)作用。本研究通過建立永久性大腦中動脈缺血模型，觀察富含肌肽的牛肉水煮液對腦缺血大鼠外周血炎性因子IL-6、TNF-α水平的影響，旨在探討牛肉水煮液是否具有抗炎作用。

本研究結果顯示：假手術組血清炎性細胞因子IL-6、TNF-α基礎水平較低，造模后7 d，模型組IL-6、TNF-α水平顯著增高，提示炎性因子IL-6、TNF-α參與腦缺血損傷過程；予不同劑量牛肉水煮液處理后，升高的IL-6、TNF-α水平呈現(xiàn)不同程度下降趨勢，提示牛肉水煮液可降低腦缺血后IL-6、TNF-α水平，抑制炎性反應，從而減輕腦缺血時炎性浸潤對腦組織的損害。而既往研究顯示[14]肌肽能抑制缺血再灌注損傷的炎性因子，如IL-6、TNF-α、核因子κB1等的表達。因此推測牛肉水煮液中的豐富的肌肽成分在腦缺血后抗炎作用中發(fā)揮了重要作用，但牛肉水煮液中其他成分，如脂肪、維生素、礦物質等是否也起到一定作用，還有待進一步探討。本研究結果還顯示，與模型組相比，低、中劑量牛肉水煮液組IL-6、TNF-α水平雖有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義，而高劑量牛肉水煮液組IL-6、TNF-α水平下降顯著，并且高劑量組IL-6水平明顯低于低劑量組，提示高劑量牛肉水煮液對IL-6、TNF-α的調節(jié)作用最理想。

另外，本實驗在造模后7 d觀察各組大鼠腦梗死體積發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，中、高劑量組可明顯減小腦梗死體積，表明中、高劑量牛肉水煮液可減輕局灶性腦缺血大鼠的腦損傷。此結果與不同濃度牛肉水煮液對血清IL-6、TNF-α水平影響的變化趨勢相一致，推測其腦保護作用可能是通過減少腦缺血后炎性因子水平實現(xiàn)。這與既往的研究結果相一致[15]。但其腦梗死范圍和血清IL-6、TNF-α水平是否有相關性，尚需要進一步探討。

造模后2 h，各組大鼠神經功能評分無統(tǒng)計學差異；造模后7 d，低、中、高劑量牛肉水煮液組神經功能缺損評分與模型組相比，雖有隨劑量下降的趨勢，但無統(tǒng)計學差異。導致這一結果的原因可能有3方面：(1)本實驗樣本量較??；(2)本實驗的神經功能評分方法采用Longa等的五級四分法，且排除了腦損傷過輕(0分)和過重(4分)的大鼠，導致腦缺血大鼠的神經功能評分的差異性較小；(3)牛肉水煮液屬于食物，其功能上還不足以在短時間內對神經癥狀起到明顯的改善作用。

綜上所述，牛肉水煮液可以減小局灶性腦缺血后的腦梗死體積，降低腦缺血大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α的水平，減輕腦缺血后的炎性病理過程，具有神經保護作用，這可能與其富含肌肽有關。牛肉水煮液取材方便，制作工藝簡單，作為一種簡單食療方可以納入臨床腦卒中患者的飲食方案，輔助腦卒中患者的治療。但是牛肉水煮液發(fā)揮抗炎作用所需時間以及持續(xù)時間還需進一步探討。

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(本文編輯：時秋寬)

Effect of beef decoction on levels of serum interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in rats of cerebral infarction

MAQian,ZHUJie,WANGXin,WANGAihong*.

*Institute of Nursing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing Jiangsu 210023, China

WANGAihong,Email:wah710630@163.com

ObjectiveToinvestigatetheneuroprotectiveeffectofbeefdecoction(BD)ontheserumlevelsofinterleukin-6 (IL-6)andtumornecrosisfactor-α(TNF-α)inmiddlecerebralarteryocclusionmodel(MCAO)rats.MethodsSixtySDratswererandomlydividedintofivegroups：sham-operatedgroup,modelgroup,lowdosageBD-treatedgroup[200mg/(kg·d)],middledosageBD-treatedgroup[400mg/(kg·d)]andhighdosageBD-treatedgroup[600mg/(kg·d)],therewere12ratsineachgroup.IntraluminalthreadmethodswereappliedtoestablishtheMCAOinthemodelgroupandthethreeBDtreatedgroups.TheneurologicalfunctionwasscoredwithLonga5-pointscaleat2hand7daysaftermodeling,thecerebralinfractvolumewasrevealedby2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride(TTC)stain,andtheserumlevelsofIL-6andTNF-αweredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)methods.ResultsBoth2hand7daysafterMCAO,comparedwiththemodelgroup,theneurologicalfunctionscoresoftheBD-treatedgroupswerenotsignificantlydifferent(P>0.05).TheinfarctionvolumesoftheBD-treatedgroupsweresmallerthanthoseofthemodelgroup,andstatisticallysignificantlyreducedinthehighandmiddledosagegroups(P<0.01).ThelevelsofIL-6andTNF-αinthemodelgroupweremuchhigherthanthoseinthesham-operatedgroup(P<0.01),whilethelevelsofIL-6andTNF-αinthehighdosageBDgroupwerelowerthanthoseinthemodelgroup(P<0.01，P<0.05).ConclusionsHighdosageBDiseffectivetoreduceinfractvolumeandrestrainIL-6andTNF-αexpression,thismaybeitsprotectivemechanismofBDoncerebralischemia.

beefdecoction；localcerebralischemia；interleukin-6；tumornecrosisfactor-α

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.015

江蘇省青藍工程項目資助、江蘇省優(yōu)勢學科項目資助項目(編號：YSHL0201-26)

210023 南京中醫(yī)藥大學護理學院

王愛紅，Email：wah710630@163.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)01-0062-05

2014-08-20)