麥 靜， 楊志玲， 楊 旭， 汪麗娜

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點實驗室， 浙江 富陽 311400)

基于SSR標(biāo)記的厚樸親本及其子代群體的遺傳多樣性分析

麥 靜， 楊志玲①， 楊 旭， 汪麗娜

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點實驗室， 浙江 富陽 311400)

以來自浙江遂昌的5株厚樸(MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.)單株為母本，來自浙江磐安和富陽、江西分宜以及湖南沅陵的厚樸群體為父本，獲得7個雜交授粉子代群體；并對5株母本單株進行自由授粉，獲得5個自由授粉后代群體；在此基礎(chǔ)上，采用SSR標(biāo)記技術(shù)對厚樸親本群體以及雜交和自由授粉子代群體的遺傳多樣性進行分析。結(jié)果表明：13對SSR引物擴增的片段長度為105～297 bp，共檢測到54個等位基因，每個位點的觀測等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)分別為4.2和2.6?？傮w上，雜交授粉子代群體的遺傳多樣性最高，其Shannon多樣性指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(h)和期望雜合度(He)平均值分別為1.049 3、0.577 3和0.638 2；親本群體的遺傳多樣性略低于其雜交授粉子代群體，其I、h和He平均值分別為1.022 1、0.559 7和0.601 3；自由授粉子代群體的遺傳多樣性最低，其I、h和He平均值分別為0.813 8、0.480 8和0.530 0。7個雜交授粉子代群體親本間的Nei’s遺傳距離為0.576 2～1.181 1，且與雜交授粉子代群體的遺傳多樣性呈正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著(R=0.392 4)。7個雜交授粉子代群體間的Nei’s遺傳距離和遺傳一致度分別為0.274 9～0.804 6和0.446 4～0.759 6，其中來源于同一父本的雜交授粉子代群體間的遺傳一致度最高，且Nei’s遺傳距離越大其遺傳一致度越小。聚類分析結(jié)果表明：在Nei’s遺傳距離為0.93處，供試的5個母本單株以及3個父本群體、7個雜交授粉子代群體和5個自由授粉子代群體可分成3類，其中來源于同一父本的雜交授粉子代群體及其父本群體具有較近的親緣關(guān)系。研究結(jié)果顯示：厚樸雜交授粉子代群體的遺傳多樣性水平明顯高于其自由授粉子代群體，并且總體上高于其親本，說明雜交授粉可加速厚樸群體間的基因交流，豐富其群體的遺傳多樣性。

厚樸； SSR標(biāo)記； 雜交授粉； 遺傳多樣性； Nei’s遺傳距離； 聚類分析

厚樸(MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.)為木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(MagnoliaLinn.)落葉喬木，既是珍貴的用材樹種，也是重要的中藥材。厚樸的應(yīng)用歷史悠久，藥用價值始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》；其根皮、莖皮和花蕾均可入藥，目前在國內(nèi)的年使用量高達(dá)3 000 t[1]。厚樸為廣布高山樹種，并且是較為原始的種類，對研究植物區(qū)系及木蘭科分類具有重要的科學(xué)意義。然而，20世紀(jì)60年代以來，野生厚樸遭到過度采伐，致使其野生資源急劇減少、分布面積越來越小，生境呈現(xiàn)典型的破碎化狀態(tài)，目前野生厚樸僅零星分布于一些古村落或自然保護區(qū)內(nèi)。因其特殊的分類學(xué)地位和重要的藥用價值，厚樸已經(jīng)被列為國家二級重點保護野生植物和二級保護中藥材[2]。

國內(nèi)外研究者一直非常重視對厚樸的相關(guān)研究，研究內(nèi)容主要集中在栽培技術(shù)[3-4]、藥用成分[5-7]、藥理作用[8-10]及花香氣成分分析[11]等幾個方面；近年來，陸續(xù)有學(xué)者對厚樸的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性開展了相關(guān)研究，并取得了一定的研究成果。鄭志雷[12]通過SRAP和RAPD技術(shù)構(gòu)建了89份厚樸種質(zhì)資源的指紋圖譜，并認(rèn)為厚樸物種水平的遺傳多樣性高于居群水平；蔣燕峰等[6]和He等[13]則分別應(yīng)用AFLP技術(shù)探討了厚樸種源間及個體間等多個層次的遺傳多樣性及其野生居群和栽培群體的遺傳多樣性；于華會等[14]應(yīng)用ISSR技術(shù)對28個厚樸居群進行了遺傳多樣性研究，結(jié)果顯示厚樸居群間的基因流較弱，并且居群間的遺傳分化較嚴(yán)重。綜上所述，在物種和居群水平上，厚樸的遺傳多樣性均存在差異。另外，厚樸為異交繁殖并需要傳粉者協(xié)助才能完成傳粉過程，在自然狀態(tài)下的傳粉效率較低，并且同株自花授粉和敗育現(xiàn)象均十分嚴(yán)重，造成其自然更新緩慢，致使其面臨瀕危的危險[15]。

SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記又稱微衛(wèi)星(microsatellite)標(biāo)記，是由1～6個堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，廣泛隨機分布于真核生物基因組中[16]。SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，克服了RAPD和ISSR標(biāo)記擴增產(chǎn)物不穩(wěn)定、多態(tài)性低等問題，是比較基因組學(xué)、遺傳多樣性和系統(tǒng)學(xué)研究的理想標(biāo)記。目前，運用SSR標(biāo)記已對華木蓮(ManglietiadeciduaQ．Y．Zheng)[17]、觀光木〔Micheliaodora(Chun) Noot. et B. L. Chen〕[18]、長柄雙花木(DisanthuscercidifoliusMaxim. var.longipesH. T. Chang)[19]、鵝掌楸〔Liriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.〕[20]、日本天女花(Magnoliasieboldiisubsp.japonicaK. Ueda)[21]和日本厚樸(MagnoliaobovataThunb.)[22]等木蘭科植物進行了遺傳多樣性分析。

為了提高厚樸的遺傳多樣性水平，作者以產(chǎn)自浙江遂昌神龍谷國家森林公園的厚樸植株為母本，以產(chǎn)自浙江磐安和富陽以及江西分宜和湖南沅陵的厚樸植株為父本進行居群間雜交實驗，共獲得7個雜交授粉群體和5個自由授粉群體，并利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對上述子代群體和親本群體的遺傳多樣性進行分析，以期明確子代群體和親本群體間的遺傳關(guān)系，從分子水平上闡述控制授粉之后子代群體遺傳多樣性的變化，為瀕危物種群體遺傳多樣性的恢復(fù)及小種群重建提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

以來自浙江遂昌神龍谷國家森林公園中的厚樸為母本，以來自浙江磐安園塘林場(PA)和富陽黃公望森林公園(FY)以及江西分宜樹木園林場(JX)和湖南沅陵杜家坪鄉(xiāng)(RL)的厚樸植株為父本，于2013年5月進行居群間雜交授粉。在厚樸的盛花期采集父本植株的花粉，每個居群至少采集15個單株80朵花的花粉，將各居群的花粉混合均勻；隨機選擇5株發(fā)育良好且開花數(shù)量較多的母本植株(分別記為SM1、SM2、SM3、SM4和SM5)進行人工套袋授粉并掛牌，每個母本植株同時與4個父本的花粉分別進行授粉，每個父本共授粉50～60朵花，其余花朵進行自由授粉(對照)，連續(xù)授粉7 d。2013年10月，采集各雜交及自由授粉植株的種子，共獲得7個雜交授粉群體(分別為SM1×RL、SM1×FY、SM2×RL、SM3×FY、SM4×RL、SM4×JX和SM5×JX)和5個自由授粉群體(包括FSM1、FSM2、FSM3、FSM4和FSM5)的種子。2014年1月，對各雜交和自由授粉植株的種子進行播種育苗，分別獲得16、13、10、24、5、7、12、18、13、10、16和7株F1代幼苗。2014年5月，采集所有雜交和自由授粉植株的F1代幼苗嫩葉，同時采集父本(FY、JX和RL分別為15、22和27株；由于PA各雜交組合均未結(jié)籽，因此未采集PA父本)和母本(SM，5株)供試樣株的嫩葉，將每個單株的嫩葉樣品分別置于-70 ℃低溫冰箱中保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和檢測 采用改良的SDS-CTAB結(jié)合法提取各樣品的基因組DNA[14]，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific 公司)檢測DNA的純度和濃度，采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。將獲得的DNA樣品稀釋至50 ng·μL-1，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR-PCR擴增反應(yīng) 供試的13對SSR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中7對引物序列來自近緣種日本厚樸[22]和Magnoliastellata(Sieb. et Zucc.) Maxim.[23]，其余6對引物序列采用生物信息技術(shù)自主設(shè)計獲得，各引物序列見表1。

采用2720 Thermal Cycler PCR儀(美國ABI公司)進行SSR-PCR擴增反應(yīng)，Taqplus DNA聚合酶、dNTPs及buffer(含Mg2+)均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。反應(yīng)體系總體積為25 μL，包含2 ng·μL-1DNA模板、正向引物和反向引物各0.3 μmol·L-1、2.0 mmol·L-1buffer(含Mg2+)、0.5 mmol·L-1dNTPs和0.03 U·μL-1Taqplus DNA聚合酶。擴增程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，根據(jù)引物的退火溫度(48 ℃～59 ℃)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)8%聚丙烯酰胺凝膠在150 V恒壓下電泳3 h，然后參照梁宏偉等[24]的方法進行銀染并拍照。

表1 用于厚樸SSR-PCR擴增的引物序列及退火溫度

Table 1 Sequence and annealing temperature of primers used for SSR-PCR amplification ofMagnoliaofficinalisRehd. et Wils.

引物編號 No．ofprimer引物序列(5′→3′) Primersequence(5′→3′) 正向引物Forwardprimer 反向引物Reverseprimer退火溫度/℃Annealingtemperature HP02 GAGCCGAATAAAGAATGA ATCTATGGTCCGAAACTA53．8 HP08 GCATACGATTCATGGGGAGA AAACGCCTACGAAAAGAT48．0 HP13 AGAAATAGATCGAACGGAA GCAAACGCCTACGAAAAG48．0 HP15 CTCCGACCATAACATAAT TCCGAGGTATTTCCGTGA51．0 HP16 TCCAAGGAACAGGAAGAA GCAAACGCCTACGAAAAG52．0 HP19 ATAGATCGAACGGAACAC GCAAACGCCTACGAAAAG52．0 Stm0246 AGTAATTCCCGCTCGTTC AGGAGAAGGAGGAATGGA59．0 M17D5 AAGCAAAGCCTCCTAGGTC TCTACGCCTAACAGGTCTGTC54．0 M15D5 TGCTGCTCGAAGTTCTGAAT CGTGCAGTAAATCAGGATGT52．7 M10D8 GATCGTTGCTGGCTCGC GCCGCCTGGATTATGAA52．5 M10D3 AGCCCTCTATACACGCACACAT CGGAGCTACAAGGAGCAGAATA51．5 M6D10 GTCTAGTGAGCCGCAAATGG GTGAACAGCTTTCTTGTGAA51．8 M6D1 ACTGGAGCAGTGCCTGGATA TCGCAACTGCGTGTTCTCAT54．0

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

二倍體生物的SSR-PCR反應(yīng)一般會擴增出1條(純合體)或2條(雜合體)條帶，若同一引物不同樣品的條帶遷移率一致則認(rèn)為具有同源性。將電泳圖譜中的清晰條帶按照由大到小的順序依次命名為A、B、C、D、……，其中，純合體用2個相同的字母表示，如AA、BB、……；雜合體用2個不同的字母表示，如AB、BC、……；無條帶用“-”表示。

采用POPGEN 32軟件計算并統(tǒng)計各樣品的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(h)及Shannon多樣性指數(shù)(I)等指標(biāo)，同時采用該軟件計算遺傳一致度(GI)及Nei’s遺傳距離(D)；采用NTSYS-pc 2.1軟件對親本及雜交和自由授粉F1代群體進行聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 厚樸雜交親本及雜交和自由授粉子代群體的遺傳多樣性比較

采用13對SSR引物對厚樸親本及雜交和自由授粉子代群體進行PCR擴增，擴增片段長度為105～297 bp，根據(jù)擴增結(jié)果分析出的厚樸雜交親本群體、雜交授粉子代群體和自由授粉子代群體的遺傳多樣性見表2。在供試的7個雜交授粉子代、5個自由授粉子代、3個父本和1個母本群體總計220株樣品中共檢測到54個等位基因，每個位點的觀測等位基因數(shù)(Na)為4.2，有效等位基因數(shù)(Ne)為2.6。

表2 基于SSR標(biāo)記的厚樸雜交和自由授粉子代群體及其雜交親本群體的遺傳多樣性分析

Table 2 Analysis on genetic diversity of progeny populations of hybrid and free pollinations and their hybrid parent populations ofMagnoliaofficinalisRehd. et Wils. based on SSR marker

群體1)Population1)樣本量Samplenumber觀測等位基因數(shù)Numberofobservedallele有效等位基因數(shù)Numberofeffectiveallele觀測雜合度Observedheterozygosity期望雜合度ExpectedheterozygosityShannon多樣性指數(shù)ShannondiversityindexNei’s基因多樣性指數(shù)Nei’sgenediversityindex雜交授粉子代群體Progenypopulationofhybridpollination SM1×RL164．23．10．56920．70091．19280．6308 SM1×FY134．23．10．50000．56650．85570．5038 SM2×RL104．03．10．46150．67181．13490．6046 SM3×FY242．92．30．42690．54930．87700．4929 SM4×JX73．82．90．47690．69401．13200．6246 SM4×RL53．22．40．35000．62810．98820．5628 SM5×JX123．22．70．40340．65661．16480．6216 均值Mean3．62．80．45540．63821．04930．5773自由授粉子代群體Progenypopulationoffreepollination FSM1182．41．90．40000．57780．86250．5200 FSM2132．52．10．23080．35730．57690．3215 FSM3103．32．40．32370．53750．90340．5053 FSM4162．82．30．40000．65130．97380．5862 FSM573．02．50．13850．52630．75220．4712 均值Mean2．82．30．29860．53000．81380．4808雜交親本群體Hybridparentpopulation JX224．03．20．40760．59441．08990．5706 RL274．23．10．35150．60341．10920．5825 FY153．22．50．27690．57830．91590．5196 SM53．22．70．29230．62910．97350．5662 均值Mean3．62．90．33210．60131．02210．5597

1)SM1-SM5: 5株母本單株，采自浙江遂昌神龍谷國家森林公園 Five individuals of female parent collected from Shenlonggu National Forest Park in Suichang of Zhejiang; RL: 父本，采自湖南沅陵杜家坪鄉(xiāng) Male parent collected from Dujiaping Township in Yuanling of Hu’nan; FY: 父本，采自浙江富陽黃公望森林公園 Male parent collected from Huanggongwang Forest Park in Fuyang of Zhejiang; JX: 父本，采自江西分宜樹木園林場 Male parent collected from Shumuyuan Tree Farm in Fenyi of Jiangxi； FSM1-FSM5: 5株母本單株自由授粉的子代群體 Progeny populations of free pollination of five female parent individuals.

由表2可見：在7個雜交授粉子代群體中，SM1×RL和SM1×FY雜交授粉子代群體的Na值相同且最高(4.2)，而SM3×FY雜交授粉子代群體的Na值則最低(2.9)，平均值為3.6；SM1×RL雜交授粉子代群體的Ne值最高、SM3×FY雜交授粉子代群體的Ne值最低，分別為3.1和2.3，平均值為3.6。7個雜交授粉子代群體的觀測雜合度(Ho)為0.350 0～0.569 2，平均值為0.455 4；期望雜合度(He)介于0.549 3～0.700 9，平均值為0.638 2。He和Shannon多樣性指數(shù)(I)以及Nei’s基因多樣性指數(shù)(h)在各雜交授粉子代群體間的大小順序并不完全相同，總體上看， SM1×RL雜交授粉子代群體的He、I和h指數(shù)最高，SM1×FY和SM3×FY雜交授粉子代群體的He、I和h指數(shù)較低；7個雜交授粉組合I和h的平均值分別為1.049 3和0.577 3。說明各雜交授粉子代群體間的多態(tài)性水平差異較大。

由表2還可見：自由授粉子代群體的He、I和h的平均值分別為0.530 0、0.813 8和0.480 8，各雜交親本群體的He、I和h的平均值分別為0.601 3、1.022 1和0.559 7。與雜交授粉子代群體及雜交親本群體相比，自由授粉子代群體的Na、Ne、He、I和h5項遺傳多樣性指標(biāo)的平均值均最低。比較結(jié)果表明，雜交授粉子代群體的遺傳多樣性水平最高，且與雜交親本群體的遺傳多樣性差異較小，而自由授粉子代群體的遺傳多樣性水平最低。

2.2 厚樸雜交親本群體間的Nei’s遺傳距離及其與雜交授粉子代群體遺傳多樣性的相關(guān)性分析

根據(jù)厚樸親本群體13個等位基因頻率計算7個雜交授粉子代群體親本間的Nei’s遺傳距離，計算結(jié)果表明：SM5×JX雜交組合親本間的Nei’s遺傳距離最大(為1.181 1)，SM1×RL雜交組合親本間的Nei’s遺傳距離最小(為0.576 2)，而SM3×FY、SM1×FY、SM4×JX、SM2×RL和SM4×RL雜交組合親本間的Nei’s遺傳距離分別為0.600 2、0.862 1、0.733 0、0.651 6和0.769 3。

對雜交親本群體間的Nei’s遺傳距離與雜交授粉子代群體的遺傳多樣性進行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖1。相關(guān)性分析結(jié)果顯示：厚樸雜交授粉子代群體的遺傳多樣性與其親本群體間的Nei’s遺傳距離呈正相關(guān)，表現(xiàn)為隨親本群體間Nei’s遺傳距離的增大、雜交授粉子代群體的遺傳多樣性緩慢增加；但相關(guān)性不顯著(P>0.05)，相關(guān)系數(shù)(R)僅為0.392 4。

圖1 厚樸雜交授粉子代群體的遺傳多樣性與其親本群體間Nei’s遺傳距離的相關(guān)性分析

Fig.1 Analysis on correlation between genetic diversity of progeny populations of hybrid pollination and Nei’s genetic distance of parent populations ofMagnoliaofficinalisRehd. et Wils.

2.3 厚樸雜交授粉子代群體間的Nei’s遺傳距離和遺傳一致度分析

根據(jù)SSR標(biāo)記分析結(jié)果計算7個厚樸雜交授粉子代群體間的Nei’s遺傳距離和遺傳一致度，結(jié)果見表3。7個雜交授粉子代群體間的Nei’s遺傳距離介于0.274 9～0.804 6之間，其中SM1×RL和SM2×RL這2個雜交授粉子代群體間的Nei’s遺傳距離最小，而SM3×FY和SM5×JX這2個雜交授粉子代群體間的Nei’s遺傳距離最大。7個厚樸雜交授粉子代群體間的遺傳一致度的變化幅度小于Nei’s遺傳距離，介于0.446 4～0.759 6之間，其中SM1×RL和SM2×RL這2個雜交授粉子代群體間的遺傳一致度最大，而SM3×FY和SM5×JX這2個雜交授粉子代群體間的遺傳一致度最小。綜合分析結(jié)果顯示：具有同一父本的雜交授粉子代群體間的遺傳距離最小、遺傳一致度最大，而父本及母本均不同的雜交授粉子代群體間的遺傳距離最大、遺傳一致度最小。

2.4 厚樸雜交親本與雜交和自由授粉子代群體的聚類分析

依據(jù)SSR標(biāo)記分析結(jié)果計算的Nei’s遺傳距離對厚樸5株母本、3個父本群體及7個雜交授粉子代群體和5個自由授粉子代群體進行聚類分析，結(jié)果見圖2。

由圖2可見：在Nei’s遺傳距離為0.93處，供試親本及子代群體可以分為3類，第Ⅰ類包括自由授粉子代群體FSM1、 FSM2、 FSM3、 FSM4和FSM5，雜交授粉子代群體SM5×JX，父本群體JX和FY以及母本單株SM1；第Ⅱ類包括雜交授粉子代群體SM1×RL、SM2×RL、SM4×RL、SM1×FY、SM3×FY和SM4×JX，父本群體RL和母本單株SM2；第Ⅲ類僅包含母本單株SM3、SM4和SM5。其中，第Ⅱ類主要為雜交授粉子代群體，可進一步分為3個亞類，SM1×RL、SM2×RL、SM4×RL和RL為第1亞類，均擁有同一父本群體RL；SM1×FY、SM3×FY和SM4×JX為第2亞類；母本SM2單獨為一組，即第3亞類。

表3 厚樸雜交授粉子代群體間的Nei’s遺傳距離和遺傳一致度

Table 3 Nei’s genetic distance and genetic identity among progeny populations of hybrid pollination ofMagnoliaofficinalisRehd. et Wils.

群體1)Population1)各群體間的Nei’s遺傳距離和遺傳一致度2) Nei’sgeneticdistanceandgeneticidentityamongdifferentpopulations2)SM5×JXSM1×RLSM2×RLSM1×FYSM4×JXSM3×FYSM4×RLSM5×JX-0．70760．67340．47190．55820．44640．5307SM1×RL0．3459-0．75960．52480．67360．56890．5495SM2×RL0．39550．2749-0．75730．72080．66610．6119SM1×FY0．77510．64480．3048-0．68310．61260．6433SM4×JX0．58310．39520．37240．3811-0．71140．6470SM3×FY0．80460．56410．40630．49010．3405-0．7570SM4×RL0．63360．59980．49110．44120．43540．2784-

1)SM1-SM5: 5株母本單株，采自浙江遂昌神龍谷國家森林公園 Five individuals of female parent collected from Shenlonggu National Forest Park in Suichang of Zhejiang; RL: 父本，采自湖南沅陵杜家坪鄉(xiāng) Male parent collected from Dujiaping Township in Yuanling of Hu’nan; FY: 父本，采自浙江富陽黃公望森林公園 Male parent collected from Huanggongwang Forest Park in Fuyang of Zhejiang; JX: 父本，采自江西分宜樹木園林場 Male parent collected from Shumuyuan Tree Farm in Fenyi of Jiangxi.

2)遺傳一致度和Nei’s遺傳距離分別位于橫線上、下方 Genetic identity and Nei’s genetic distance are located above and under the line， respectively.

SM1-SM5: 5株母本單株，采自浙江遂昌神龍谷國家森林公園 Five individuals of female parent collected from Shenlonggu National Forest Park in Suichang of Zhejiang; RL: 父本，采自湖南沅陵杜家坪鄉(xiāng) Male parent collected from Dujiaping Township in Yuanling of Hu’nan; FY: 父本，采自浙江富陽黃公望森林公園 Male parent collected from Huanggongwang Forest Park in Fuyang of Zhejiang; JX: 父本，采自江西分宜樹木園林場 Maleparentcollectedfrom Shumuyuan Tree Farm in Fenyi of Jiangxi; SM5×JX, SM1×RL, SM2×RL, SM1×FY, SM4×JX, SM3×FY, SM4×RL: 分別為雜交授粉子代群體Progeny populations of hybrid pollination, respectively; FSM1-FSM5: 5株母本單株自由授粉的子代群體 Progeny populations of free pollination of five female parent individuals.

圖2 基于SSR標(biāo)記的厚樸雜交和自由授粉子代群體及其親本群體的聚類分析

Fig. 2 Cluster analysis on progeny populations of hybrid and free pollinations and their parent populations ofMagnoliaofficinalisRehd. et Wils. based on SSR marker

3 討論和結(jié)論

厚樸為第三紀(jì)孑遺物種[25]，其祖先擁有豐富的遺傳變異，但受第四紀(jì)冰川的影響，其分布范圍逐漸減少，只有少數(shù)群體仍分布于中國的長江流域以及陜西和甘肅南部等地區(qū)[26]。由于厚樸自身的結(jié)實率和萌發(fā)率均較低，加之過度采挖等人為因素的影響，目前厚樸居群水平的遺傳多樣性遠(yuǎn)低于其物種水平的遺傳多樣性[12,14]。趙宏波等[27]認(rèn)為，遠(yuǎn)交及混合花粉均能夠增加厚樸的結(jié)實率，即提高其繁殖成功率，增強其對環(huán)境的適應(yīng)性，有利于厚樸居群遺傳多樣性的恢復(fù)，促進其居群規(guī)模的恢復(fù)和擴大。本研究中，采用SSR標(biāo)記分析厚樸雜交親本以及雜交和自由授粉子代群體的遺傳多樣性(包括觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、Shannon多樣性指數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù))，其中，雜交授粉子代群體的遺傳多樣性指標(biāo)大多高于其親本，而自由授粉子代群體的遺傳多樣性指標(biāo)則低于其親本，且雜交授粉子代群體的遺傳多樣性指標(biāo)均明顯高于其自由授粉子代群體。說明在野生狀態(tài)下厚樸居群內(nèi)的遺傳多樣性水平較低，而居群間的雜交授粉能夠提高子代的遺傳多樣性水平，說明通過人為控制雜交授粉可加速厚樸居群間的基因交流，并有效提高厚樸居群的遺傳多樣性。

一般來說，雜交親本間的Nei’s遺傳距離越大、遺傳相似度越小，其雜交授粉子代的遺傳多樣性越高，本研究結(jié)果也基本上驗證了這一觀點。但是，雖然本研究中供試厚樸雜交親本群體的Nei’s遺傳距離與雜交授粉子代群體的遺傳多樣性呈正相關(guān)，但其相關(guān)性并未達(dá)到顯著水平(R=0.392 4，P>0.05)，造成這一結(jié)果的原因可能是雜交授粉子代群體的遺傳多樣性不僅取決于親本的Nei’s遺傳距離，還與父本和母本各自的遺傳組成有關(guān)，同時還可能受到DNA重組的影響，即二倍體或多倍體植物減數(shù)分裂時發(fā)生同源染色體之間的交換或轉(zhuǎn)換，通過打破遺傳連鎖而影響群體的DNA多態(tài)性[28]。由于根據(jù)形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記等估算出的親本間的Nei’s遺傳距離只能反映親本間的平均遺傳差異狀況，而不能確切指出某個基因位點的同質(zhì)性或異質(zhì)性[29]，因此，親本間的遺傳距離并非是影響雜交授粉子代遺傳多樣性的主要因素。有研究結(jié)果[30-31]表明：雜交親本間的遺傳距離與雜交授粉子代遺傳多樣性的相關(guān)性不僅表現(xiàn)在分子水平上，更表現(xiàn)在表型性狀上，雜交親本間的遺傳距離與雜交授粉子代的表型性狀呈顯著正相關(guān)；也有學(xué)者[32-34]認(rèn)為雜交親本間的遺傳距離與雜交授粉子代的表型性狀雖然存在相關(guān)性，但相關(guān)程度較低。由于本研究過程中獲得的厚樸雜交和自由授粉的種子數(shù)量較少且播種后出苗率較低，加之后期生長過程中不良天氣對幼苗生長的影響等原因，造成最終獲得的厚樸子代幼苗數(shù)量極少，無法滿足其表型性狀統(tǒng)計分析的需求，因此，后續(xù)實驗將進一步開展表型性狀的相關(guān)研究。

聚類分析結(jié)果表明：雖然大部分母本單株間的親緣關(guān)系較近，但在獲得的7個厚樸雜交授粉子代群體中，有6個雜交授粉子代群體與其父本有較近的親緣關(guān)系，這可能與本實驗采用同一居群內(nèi)多個父本單株混合花粉授粉有關(guān)。由于父本的遺傳變異較豐富，因此，在親本遺傳信息融合和基因重組過程中，父本的遺傳信息能夠更多地傳遞給后代；而母本親緣關(guān)系較近可能與其地理位置有關(guān)，供試5株母本單株均位于浙江遂昌神龍谷國家森林公園的山坳地帶，周圍有山體阻隔，加上其主要依賴動物進行種子傳播，導(dǎo)致這5株母本單株很可能來源于同一祖先個體。韓國輝等[35]對沙田柚(Citrusmaxima‘Shatianyou’)群體間和群體內(nèi)雜交后代的遺傳分析結(jié)果也表明：群體內(nèi)雜交較群體間雜交的基因交流更加充分，從而使其多數(shù)雜種偏向父本遺傳。因此，在對厚樸進行控制授粉時，可考慮增加父本的個體數(shù)量，使父本的遺傳信息更加豐富。值得一提的是，本研究中，有個別雜交后代群體(如SM5×JX)的聚類結(jié)果與上述理論不一致，推測這可能是由于在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生了較大的染色體重組所致。

目前，用于度量植物遺傳多樣性的參數(shù)(包括Na、Ne、Ho、He、I和h等)主要基于物種或居群水平，尚未見用于度量栽培植物組合(家系)遺傳多樣性參數(shù)的研究報道，因而沒有適合度量雜交組合遺傳多樣性的參數(shù)可供借鑒。本研究中，作者借鑒部分植物居群遺傳參數(shù)評價厚樸雜交授粉子代群體及其親本間的遺傳多樣性，由于人工授粉屬于非自然狀態(tài)下的基因流，因此用于評價植物居群遺傳多樣性的指標(biāo)是否完全適用于雜交授粉子代群體的遺傳多樣性分析，還需進一步探討。

經(jīng)過人工授粉的厚樸雜交授粉子代群體的遺傳多樣性水平高于其自由授粉子代群體和親本，表明人工授粉能夠促進厚樸居群間的基因交流，利于保護和恢復(fù)厚樸居群的遺傳多樣性。在實際工作中，還可適當(dāng)進行引種栽培，將來自不同群體的厚樸種子、幼苗或植株進行交叉種植，增加其自然異交的幾率，以產(chǎn)生遠(yuǎn)交后代，提高厚樸群體的遺傳多樣性。

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(責(zé)任編輯： 佟金鳳)

Analysis on genetic diversity of populations of parents and their progenies ofMagnoliaofficinalisbased on SSR marker

MAI Jing, YANG Zhiling①, YANG Xu, WANG Li’na

(Key Laboratory of Tree Breeding of Zhejiang Province, Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, China ),J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(3): 10-17

Seven progeny populations of hybrid pollination were obtained by taking five individuals ofMagnoliaofficinalisRehd. et Wils. collected from Suichang of Zhejiang as female parents, and populations ofM.officinaliscollected from Pan’an and Fuyang of Zhejiang, Fenyi of Jiangxi and Yuanling of Hu’nan as male parents. And five female parent individuals were free pollinated and five progeny populations of free pollination were obtained. On this basis, genetic diversity of parent populations and progeny populations of hybrid and free pollinations ofM.officinaliswere analyzed by SSR marker technology. The results show that length of bands amplified by 13 pairs of SSR primer are 105-297 bp, 54 alleles are detected totally, and observed and effective allele numbers at each locus are 4.2 and 2.6, respectively. Overall, genetic diversity of progeny population of hybrid pollination is the highest, averages of its Shannon diversity index (I), Nei’s gene diversity index (h) and expected heterozygosity (He) are 1.049 3, 0.577 3 and 0.638 2, respectively; genetic diversity of parent population is slightly lowerthanthat of progenypopulationof hybrid pollination, averages of itsI,handHeare 1.022 1, 0.559 7 and 0.601 3, respectively; and genetic diversity of progeny population of free pollination is the lowest, averages of itsI,handHeare 0.813 8, 0.480 8 and 0.530 0, respectively. Nei’s genetic distance between parents of seven progeny populations of hybrid pollination is 0.576 2-1.181 1, and there is positive correlation between Nei’s genetic distance and genetic diversity of progeny populations of hybrid pollination, but the correlation is not significant (R=0.392 4). Nei’s genetic distance and genetic identity among seven progeny populations of hybrid pollination are 0.274 9-0.804 6 and 0.446 4-0.759 6, respectively. In which, genetic identity among progeny populations of hybrid pollination from the same male parent is the highest, and the greater the Nei’s genetic distance, the smaller the genetic identity. The cluster analysis result shows that at Nei’s genetic distance 0.93, five female parent individuals, three male parent populations, seven progeny populations of hybrid pollination and five progeny populations of free pollination tested can be divided into three categories, in which, there is a close relationship between progeny populations of hybrid pollination from the same male parent and their male parent populations. It is suggested that level of genetic diversity of progeny populations of hybrid pollination ofM.officinalisis obviously higher than that of progeny populations of free pollination, and is higher generally than that of parents, meaning that hybrid pollination can accelerate gene exchange among populations and rich population genetic diversity ofM.officinalis.

MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.; SSR marker; hybrid pollination; genetic diversity; Nei’s genetic distance; cluster analysis

2015-01-23

國家自然科學(xué)基金資助項目(31270585)

麥 靜(1990—)，女，廣西南寧人，碩士研究生，主要從事藥用植物保護方面的研究。

①通信作者 E-mail： zlyang0002@126.com

Q946-33; S567.1+1

A

1674-7895(2015)03-0010-08

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.03.02