鄧亨寧, 高信芬,①, 李先源, 周洪英

(1. 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所: a. 中國(guó)科學(xué)院山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, b. 生態(tài)恢復(fù)與生物多樣性保育四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610041; 2. 西南大學(xué)園藝園林學(xué)院 重慶市花卉工程技術(shù)研究中心, 重慶 400716; 3. 貴州省植物園, 貴州 貴陽(yáng) 550004)

無(wú)籽刺梨雜交起源:來(lái)自分子數(shù)據(jù)的證據(jù)

鄧亨寧1a,1b, 高信芬1a,1b,①, 李先源2, 周洪英3

(1. 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所: a. 中國(guó)科學(xué)院山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, b. 生態(tài)恢復(fù)與生物多樣性保育四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610041; 2. 西南大學(xué)園藝園林學(xué)院 重慶市花卉工程技術(shù)研究中心, 重慶 400716; 3. 貴州省植物園, 貴州 貴陽(yáng) 550004)

為追溯無(wú)籽刺梨(Rosa×sterilisS. D. Shi)的物種起源，以該種及同域分布的薔薇屬(RosaLinn.)14種、2變種和2變型為實(shí)驗(yàn)材料，并以小葉金露梅(PotentillaparvifoliaFisch.)為外類群，選取5個(gè)葉綠體基因片段(psbA-trnH、trnL-trnF、trnK-matK、psbI-psbK和rpoC1)及2個(gè)核基因片段(ITS和GAPDH)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，并據(jù)此利用貝葉斯分析(BI)和最大似然法(ML)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建。結(jié)果顯示：5個(gè)葉綠體基因片段聯(lián)合組成1個(gè)全長(zhǎng)3 365 bp的數(shù)據(jù)集，在據(jù)此構(gòu)建的BI系統(tǒng)樹(shù)中，無(wú)籽刺梨與長(zhǎng)尖葉薔薇(R.longicuspisBertol.)聚在一起，后檢驗(yàn)率(PP)為0.96、靴帶支持率(LB)為81%。43條ITS序列組成1個(gè)全長(zhǎng)617 bp的數(shù)據(jù)集，在據(jù)此構(gòu)建的BI系統(tǒng)樹(shù)中，無(wú)籽刺梨的4個(gè)單倍型與繅絲花(R.roxburghiiTratt.)、白花刺梨(R.roxburghiif.candidaS. D. Shi)和無(wú)刺刺梨(R.roxburghiif.inermisS. D. Shi)構(gòu)成分支a，PP值為1.00、LB值為98%；無(wú)籽刺梨的另外3個(gè)單倍型與軟條七薔薇(R.henryiBouleng.)及長(zhǎng)尖葉薔薇的2個(gè)單倍型共同構(gòu)成分支b，PP值為0.93、LB值為85%。63條GAPDH基因序列組成1個(gè)全長(zhǎng)883 bp的數(shù)據(jù)集，在據(jù)此構(gòu)建的BI系統(tǒng)樹(shù)中,無(wú)籽刺梨單倍型H2與長(zhǎng)尖葉薔薇的2個(gè)單倍型聚為分支A，PP值為1.00、LB值為99%；無(wú)籽刺梨單倍型H1和H3與繅絲花、白花刺梨和無(wú)刺刺梨聚為分支B，PP值為1.00、LB值為100%；無(wú)籽刺梨單倍型H4單獨(dú)聚為一支。綜合分析結(jié)果表明：無(wú)籽刺梨起源于長(zhǎng)尖葉薔薇與繅絲花的天然雜交，長(zhǎng)尖葉薔薇和繅絲花分別為其母本和父本。

無(wú)籽刺梨; 物種形成; 核基因; 葉綠體基因; 雜交親本; 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

無(wú)籽刺梨(Rosa×sterilisS. D. Shi)又名無(wú)子刺梨、搭鉤刺梨或金刺梨，為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(RosaLinn.)攀緣灌木，是貴州省特有種，僅集中分布于黔西南的興仁和安順地區(qū)，1985年時(shí)圣德將其作為新分類群予以發(fā)表[1]。無(wú)籽刺梨果實(shí)富含VC及多種有益成分[2]，在醫(yī)藥及保健方面具有一定的開(kāi)發(fā)潛力，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，受到學(xué)術(shù)界及相關(guān)企業(yè)的高度關(guān)注，貴州省已率先進(jìn)行了相關(guān)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，目前已初具規(guī)模。無(wú)籽刺梨因其瘦果疏被刺，故名為“刺梨”；個(gè)別瘦果偶見(jiàn)少量種子，且種子可育，但平均發(fā)芽率僅為10.8%[3]。

無(wú)籽刺梨與常見(jiàn)的同屬種類繅絲花(RosaroxburghiiTratt.)近緣，其與后者的主要形態(tài)差異為花瓣白色、復(fù)傘房花序和無(wú)籽等。對(duì)于無(wú)籽刺梨的物種起源方式，學(xué)術(shù)界一直存在爭(zhēng)議。從形態(tài)解剖學(xué)特征看，無(wú)籽刺梨可能是自然雜交種[4]。然而，形態(tài)學(xué)性狀以及AFLP和RAPD標(biāo)記分析結(jié)果顯示，無(wú)籽刺梨與貴州繅絲花(RosakweichowensisT. T. Yu et T. C. Ku)的遺傳距離較近，推測(cè)無(wú)籽刺梨很可能是貴州繅絲花的高度雄性不育變異[5-6]。通過(guò)對(duì)物種形態(tài)特征的研究以及物種分布地點(diǎn)的考察，推測(cè)無(wú)籽刺梨很可能是薔薇屬內(nèi)形成的天然雜交種，并且繅絲花為無(wú)籽刺梨的親本之一。

相比于其他基因分型分析方法(genotyping method)，如同工酶、AFLPs、SSR等，系統(tǒng)發(fā)育分析法具有自身特有的優(yōu)勢(shì)[7]，并且已成功用于其他類群的物種起源研究[7-11]。為了探究無(wú)籽刺梨的物種起源方式，作者選擇與無(wú)籽刺梨同域分布的薔薇屬植物14種、2個(gè)變種和2個(gè)變型以及外類群小葉金露梅(PotentillaparvifoliaFisch.)，利用5個(gè)葉綠體基因片段(psbA-trnH、trnL-trnF、trnK-matK、psbI-psbK和rpoC1)和2個(gè)核基因片段(ITS和GAPDH)，采用系統(tǒng)發(fā)育分析方法追溯無(wú)籽刺梨的物種起源。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料包括16種、2個(gè)變種和2個(gè)變型，其中薔薇屬植物15種、2個(gè)變種和2個(gè)變型，外類群1種(為小葉金露梅)，憑證標(biāo)本均保存于中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所植物標(biāo)本館(CDBI)，各種類的憑證標(biāo)本及采集地信息見(jiàn)表1。在野外取各種類的新鮮嫩葉，置于硅膠中干燥，然后于-20 ℃保存，用于植物總DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 稱取經(jīng)硅膠干燥后的葉片20～30 mg，用TIAGEN植物基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司) 提取總DNA，提取方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 基因片段篩選、PCR及測(cè)序 根據(jù)前期的篩選結(jié)果，對(duì)5個(gè)葉綠體基因片段(psbA-trnH、trnL-trnF、trnK-matK、psbI-psbK和rpoC1)和2個(gè)核基因片段(ITS和GAPDH)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段及其引物信息見(jiàn)表2。擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積均為25.0 μL，包括雙蒸水15.7 μL、25 mmol·L-1MgCl2溶液1.5 μL、Taq酶緩沖液2.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs溶液2.0 μL、5 U·μL-1TaqDNA聚合酶〔天根生化科技(北京)有限公司〕 0.3 μL、10 pmol·mL-1正向引物和反向引物各1.0 μL以及植物全基因組DNA 1.0 μL(約50～100 ng)。

表1 供試無(wú)籽刺梨、薔薇屬其他種類及外類群的憑證標(biāo)本和采集地信息

Table 1 Information of voucher specimen and location ofRosa×sterilisS. D. Shi, other species inRosaLinn. and outgroup tested

種類Species采集人和標(biāo)本號(hào)CollectorandNo.ofspecimen采集地Location小葉組Sect.Microphyllae 繅絲花Rosaroxburghii鄧亨寧D116 DENGHengningD116貴州貴陽(yáng)GuiyangofGuizhou 白花刺梨Rosaroxburghiif.candida高信芬,等12903 GAOXinfen,etal12903重慶南川NanchuanofChongqing 無(wú)刺刺梨Rosaroxburghiif.inermis鄧亨寧D120 DENGHengningD120四川汶川WenchuanofSichuan 無(wú)籽刺梨Rosa×sterilis周洪英,等D111 ZHOUHongying,etalD111貴州興仁XingrenofGuizhou芹葉組Sect.Pimpinellifoliae 毛葉薔薇Rosamairei朱章明8 ZHUZhangming8云南騰沖TengchongofYunnan 絹毛薔薇Rosasericea高信芬,等12818 GAOXinfen,etal12818云南威信WeixinofYunnan木香組Sect.Banksianae 木香花Rosabanksiae高信芬,等12816 GAOXinfen,etal12816云南威信WeixinofYunnan 小果薔薇Rosacymosa高信芬,等12746 GAOXinfen,etal12746四川江安Jiang’anofSichuan合柱組Sect.Synstylae 繡球薔薇Rosaglomerata朱章明213 ZHUZhangming213四川峨邊EbianofSichuan 卵果薔薇Rosahelenae高信芬,等11131 GAOXinfen,etal11131云南永勝YongshengofYunnan 軟條七薔薇Rosahenryi朱章明647 ZHUZhangming647湖南芷江ZhijiangofHu’nan 長(zhǎng)尖葉薔薇Rosalongicuspis高信芬,等11031 GAOXinfen,etal11031云南鶴慶HeqingofYunnan 野薔薇Rosamultiflora朱章明229 ZHUZhangming229貴州貴陽(yáng)GuiyangofGuizhou 粉團(tuán)薔薇Rosamultifloravar.cathayensis高信芬,等10547 GAOXinfen,etal10547四川北川BeichuanofSichuan 懸鉤子薔薇Rosarubus朱章明227 ZHUZhangming227貴州貴陽(yáng)GuiyangofGuizhou月季組Sect.Chinenses 單瓣月季花Rosachinensisvar.spontanea高信芬,等12963 GAOXinfen,etal12963重慶南川NanchuanofChongqing 亮葉月季Rosalucidissima高信芬16331 GAOXinfen16331貴州貴陽(yáng)GuiyangofGuizhou金櫻子組Sect.Laevigatae 金櫻子Rosalaevigata朱章明,等460 ZHUZhangming,etal460廣西環(huán)江HuanjiangofGuangxi薔薇組Sect.Rosa 赫章薔薇Rosahezhangensis鄧亨寧D115 DENGHengningD115貴州赫章HezhangofGuizhou小葉金露梅1)Potentillaparvifolia1)高信芬,等12085 GAOXinfen,etal12085四川雅江YajiangofSichuan

1)外類群Outgroup.

表2 用于無(wú)籽刺梨、薔薇屬其他種類及外類群基因片段擴(kuò)增的引物信息

Table 2 Information of primers used for gene fragment amplification ofRosa×sterilisS. D. Shi， other species inRosaLinn. and outgroup

引物類型Primertype引物Primer引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')設(shè)計(jì)者DesignerpsbA-trnHforwardpsbAFGTTATGCATGAACGTAATGCTCSANG,etalpsbA-trnHreversetrnHRCGCGCATGGTGGATTCACAAATCSANG,etalpsbI-psbKforwardpsbKITTAGCCTTTGTTTGGCAAGKIMKim-JoongpsbI-psbKreversepsbIAGAGTTTGAGAGTAAGCATKIMKim-JoongtrnK-matKforwardtrnKF2GCAACATGACTTCCTATACCCZHANGYutrnK-matKreversetrnK2RAACTAGTCGCATGGAGTAGPOTTER,etaltrnL-trnFforwardcCGAAATCGGTAGACGCTAGGTABERLET,etaltrnL-trnFreversefATTTGAACTGGTGACACGAGTABERLET,etalrpoC1forwardrpoC1FTATGAAACCAGAATGGATGGRoyalBotanicGardensrpoC1reverserpoC5RCAAGAAGCATATCTTGASTYGGRoyalBotanicGardensITSforwardITS-4TCCTCCGCTTATTGATATGCWHITE,etalITSreverseITS-AGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGWHITE,etalGAPDHforwardGAP×7FGATAGATTTGGAATTGTTGAGGSTRAND,etalGAPDHreverseGAP×11RGACATTGAATGAGATAAACCJOLY,etal

基本擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s、51 ℃～55 ℃退火30～45 s、72 ℃延伸30～90 s，34個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。其中，ITS片段為55 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s；GAPDH基因片段為51 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s；psbA-trnH基因片段為52 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s；psbI-psbK基因片段為53 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s；rpoC1基因片段為53 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s；trnL-trnF基因片段為54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s；trnK-matK基因片段為53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s。用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.2.3 目的基因片段測(cè)序及克隆 對(duì)2個(gè)核基因片段ITS和GAPDH直接測(cè)序，無(wú)法直接測(cè)序的片段則進(jìn)行克隆測(cè)序；用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit試劑盒(美國(guó)OMEGA Bio-Tek公司)進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化；用pEASY?-T1 Cloning Kit試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕進(jìn)行目的基因片段克隆，具體操作步驟參照操作指南(略有改動(dòng))。每個(gè)樣品挑選10～30個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定；將符合要求的菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列拼接及比對(duì) 采用Sequencher 4.1軟件拼接正向序列和反向序列，采用BioEdit version 5.0.6軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并加以人工調(diào)整，去除模糊及比對(duì)不整齊的區(qū)域，最終得到用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)集。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 分別采用MrBayes V3.0中的貝葉斯分析(Bayesian inference，BI)和The CIPRES Science Gateway V. 3.3 (RAxML-HPC Blackbox)中的最大似然法(Maximum likelihood method,ML)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果和分析

利用BI法和ML法重建無(wú)籽刺梨的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，所得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，僅部分節(jié)點(diǎn)獲得的支持率不同，因而，僅選用BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)用于結(jié)果分析；并且，將采用BI法和ML法分別得到的具有顯著性的后檢驗(yàn)率(PP)和靴帶支持率(LB)標(biāo)注在BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上。

2.1 基于葉綠體基因片段的系統(tǒng)發(fā)育重建

利用5個(gè)葉綠體基因片段聯(lián)合建樹(shù)分析，經(jīng)比對(duì)調(diào)整后，得到1個(gè)全長(zhǎng)3 365 bp的數(shù)據(jù)集。系統(tǒng)發(fā)育重建結(jié)果(圖1)顯示：薔薇屬植物聚于分支Ⅰ和Ⅱ內(nèi)。在分支Ⅱ里，無(wú)籽刺梨與長(zhǎng)尖葉薔薇(RosalongicuspisBertol.)聚在一起，且支持率較高，PP值為0.96、LB值為81%。

分支上和分支下的數(shù)據(jù)分別為后檢驗(yàn)率(PP)和靴帶支持率(LB) Datums above and below the branches indicate posterior probability (PP) and bootstrap percentage (LB), respectively.

圖1 依據(jù)5個(gè)cpDNA 基因序列的擴(kuò)增結(jié)果聯(lián)合構(gòu)建的無(wú)籽刺梨與薔薇屬部分種類的貝葉斯分析(BI)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig. 1 Bayesian inference (BI) phylogenetic tree ofRosa×sterilisS. D. Shi and some species inRosaLinn. combined constructed by amplification result of five cpDNA gene sequences

2.2 基于ITS基因片段的系統(tǒng)發(fā)育重建

從供試的19種薔薇屬植物和小葉金露梅中總共獲得43條ITS序列，經(jīng)比對(duì)調(diào)整后，得到1個(gè)全長(zhǎng)617 bp的數(shù)據(jù)集。系統(tǒng)發(fā)育重建結(jié)果(圖2)顯示：無(wú)籽刺梨所有單倍型分別位于2個(gè)分支上。其中，無(wú)籽刺梨單倍型H4、H5、H6和H7與繅絲花、白花刺梨(Rosaroxburghiif.candidaS. D. Shi)和無(wú)刺刺梨(R.roxburghiif.inermisS. D. Shi)構(gòu)成分支a，該節(jié)點(diǎn)PP值為1.00、LB值為98%;無(wú)籽刺梨單倍型H1、H2和H3與軟條七薔薇(R.henryiBouleng.)以及長(zhǎng)尖葉薔薇單倍型H1和H2共同構(gòu)成分支b，該節(jié)點(diǎn)PP值為0.93、LB值為85%。

分支上和分支下的數(shù)據(jù)分別為后檢驗(yàn)率(PP)和靴帶支持率(LB) Datums above and below the branches indicate posterior probability (PP) and bootstrap percentage (LB), respectively. H: 單倍型 Haplotype.

圖2 依據(jù)ITS片段序列的擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建的無(wú)籽刺梨與薔薇屬部分種類的貝葉斯分析(BI)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig. 2 Bayesian inference (BI) phylogenetic tree ofRosa×sterilisS. D. Shi and some species inRosaLinn. constructed by amplification result of ITS fragment sequence

2.3 基于GAPDH基因片段的系統(tǒng)發(fā)育重建

從供試的19種薔薇屬植物和小葉金露梅中共獲得63條GAPDH基因序列，經(jīng)比對(duì)調(diào)整后，得到1個(gè)全長(zhǎng)883 bp的數(shù)據(jù)集。系統(tǒng)發(fā)育重建結(jié)果(圖3)顯示：無(wú)籽刺梨單倍型H2與H1和H3分別聚于分支A與分支B內(nèi)，無(wú)籽刺梨單倍型H4單獨(dú)聚為一支。無(wú)籽刺梨單倍型H2與長(zhǎng)尖葉薔薇單倍型H1和H2聚成分支A，該節(jié)點(diǎn)PP值為1.00、LB值為99%；無(wú)籽刺梨單倍型H1和H3與繅絲花、白花刺梨、無(wú)刺刺梨聚成分支B，該節(jié)點(diǎn)PP值為1.00、LB值為100%。觀察和比對(duì)結(jié)果顯示:無(wú)籽刺梨單倍型H4的堿基構(gòu)成由繅絲花與長(zhǎng)尖葉薔薇單倍型H1整合而成。據(jù)此推測(cè)，由于無(wú)籽刺梨單倍型H4特殊的堿基構(gòu)成，導(dǎo)致其系統(tǒng)位置異于其他單倍型。

分支上和分支下的數(shù)據(jù)分別為后檢驗(yàn)率值(PP)和靴帶支持率值(LB) Datums above and below the branches indicate posterior probability values (PP) and bootstrap percentage values (LB), respectively. H: 單倍型 Haplotype.

圖3 依據(jù)GAPDH基因序列的擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建的無(wú)籽刺梨與薔薇屬部分種類的貝葉斯分析(BI)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig. 3 Bayesian inference (BI) phylogenetic tree ofRosa×sterilisS. D. Shi and some species inRosaLinn. constructed by amplification result ofGAPDHgene sequence

基于葉綠體基因片段psbA-trnH、trnL-trnF、trnK-matK、psbI-psbK和rpoC1以及核基因片段ITS和GAPDH的系統(tǒng)發(fā)育重建分析結(jié)果顯示：無(wú)籽刺梨與同屬的長(zhǎng)尖葉薔薇和繅絲花為近緣種，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上得到了可信的支持。葉綠體基因片段的系統(tǒng)發(fā)育重建分析中，無(wú)籽刺梨與長(zhǎng)尖葉薔薇互為姐妹關(guān)系；在核基因片段的系統(tǒng)發(fā)育重建分析中，無(wú)籽刺梨的相應(yīng)基因單倍型均分別與長(zhǎng)尖葉薔薇和繅絲花聚在一起。由于薔薇科植物的葉綠體基因系母系遺傳，因而，綜合分析認(rèn)為無(wú)籽刺梨起源于長(zhǎng)尖葉薔薇與繅絲花的天然雜交，長(zhǎng)尖葉薔薇為母本、繅絲花為父本。

3 討 論

對(duì)雜交物種的準(zhǔn)確鑒定，傳統(tǒng)的方法是找尋物種的中間或過(guò)渡性狀，尤其是形態(tài)上的中間性狀，并通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其親本物種。但是在雜交物種的形成過(guò)程中也存在相應(yīng)的親本性狀丟失的現(xiàn)象，誤導(dǎo)判定工作，因而，即使得到形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)研究支持，仍需其他證據(jù)驗(yàn)證雜交物種的親本來(lái)源[12]。

在本研究中，選取了5個(gè)葉綠體基因片段psbA-trnH、trnL-trnF、trnK-matK、psbI-psbK和rpoC1，以及2個(gè)核基因片段ITS和GAPDH，并利用系統(tǒng)發(fā)育分析方法探討了無(wú)籽刺梨的物種形成方式?；?個(gè)葉綠體基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及基于2個(gè)核基因片段分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)均得出無(wú)籽刺梨系雜交起源的結(jié)論，其親本為長(zhǎng)尖葉薔薇和繅絲花；并且在雜交成種過(guò)程中，長(zhǎng)尖葉薔薇及繅絲花分別扮演母本及父本的角色。長(zhǎng)尖葉薔薇為常綠高大攀緣灌木，廣泛分布于中國(guó)云南、四川和貴州海拔400～2 700 m的山區(qū)(也見(jiàn)于印度北部)，花期5月至7月[13]375；繅絲花為開(kāi)展灌木，中國(guó)大多數(shù)地方均有分布(也見(jiàn)于日本)，在中國(guó)西南地區(qū)分布較多，生長(zhǎng)在海拔500～1 400 m的林緣、向陽(yáng)山坡、灌叢和溪邊等處，花期5月至7月[13]381。長(zhǎng)尖葉薔薇和繅絲花的花期一致，生境與分布海拔大部分重疊，為二者的基因交流奠定了基礎(chǔ)條件；無(wú)籽刺梨為狹域分布于貴州省的1個(gè)天然雜交種，迄今為止僅發(fā)現(xiàn)在貴州省西南部的興仁和安順地區(qū)有分布。因此，推測(cè)在長(zhǎng)尖葉薔薇及繅絲花的進(jìn)化歷史中，貴州地區(qū)扮演了雜交帶(hybrid zone)的角色，在這個(gè)雜交帶內(nèi)，長(zhǎng)尖葉薔薇和繅絲花進(jìn)行頻繁的基因交流，最終形成天然雜交種——無(wú)籽刺梨。形態(tài)特征比較結(jié)果也顯示無(wú)籽刺梨的主要形態(tài)均與長(zhǎng)尖葉薔薇和繅絲花相應(yīng)性狀一致。

雜交不親和及雜交后代高度不育是月季花(RosachinensisJacq.)遠(yuǎn)緣育種面臨的重要問(wèn)題[14]，同樣的問(wèn)題在無(wú)籽刺梨中也存在。在無(wú)籽刺梨果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中，最開(kāi)始能形成胚珠，但伴隨果實(shí)的發(fā)育胚珠逐漸枯萎[4]，最終薔薇果內(nèi)僅能形成極少的種子[15-16]。染色體數(shù)目及花粉形態(tài)觀察結(jié)果顯示：無(wú)籽刺梨與繅絲花同為二倍體植物(2n=2x=14)，其不育機(jī)制屬于花粉敗育型[15]。對(duì)于無(wú)籽刺梨少籽的現(xiàn)象，推測(cè)其原因?yàn)闊o(wú)籽刺梨在物種形成過(guò)程中經(jīng)歷了基因組沖擊(genomic shock)。在自然雜交過(guò)程中，來(lái)自2個(gè)不同種的基因組同時(shí)進(jìn)入1個(gè)核內(nèi)，新形成的基因組發(fā)生了一系列的變化，其變化可能體現(xiàn)在DNA水平[17]、染色體水平[18]以及基因調(diào)控表達(dá)調(diào)節(jié)[19-21]等方面，最終引起控制無(wú)籽刺梨花粉正常發(fā)育的相關(guān)基因的表達(dá)受到一定程度抑制，從而造成無(wú)籽刺梨少籽現(xiàn)象。然而，對(duì)于無(wú)籽刺梨雜交成種后因花粉敗育造成的少籽現(xiàn)象，目前鮮有研究報(bào)道，因此亟待開(kāi)展更深入的研究來(lái)揭示控制這一現(xiàn)象的根本機(jī)制。

文曉鵬等[5]認(rèn)為無(wú)籽刺梨與貴州繅絲花近緣。貴州繅絲花是1981年由俞德浚和谷粹之發(fā)表的貴州特有種，對(duì)于貴州繅絲花的采集信息，目前僅有1份模式標(biāo)本(1936年采于貴陽(yáng)清鎮(zhèn))和1份普通標(biāo)本(1975年采于貴陽(yáng)花溪區(qū)農(nóng)學(xué)院)，均為花期標(biāo)本，未見(jiàn)果期標(biāo)本。作者于2013年和2014年多次前往貴州繅絲花的標(biāo)本采集地及其周邊地區(qū)搜尋調(diào)查，均未發(fā)現(xiàn)該種的蹤跡。當(dāng)年用于實(shí)驗(yàn)研究的貴州繅絲花并未保存憑證標(biāo)本、影像圖片、分子材料或DNA樣品等相關(guān)材料，因而，對(duì)于貴州繅絲花現(xiàn)今是否存在依然存疑?；谏鲜銮闆r，無(wú)籽刺梨與貴州繅絲花之間的物種關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

致謝： 野外調(diào)查過(guò)程中得到貴州省科學(xué)技術(shù)廳陳訓(xùn)老師、貴州生物研究所陳翔老師、貴州植物園金平老師及貴州師范大學(xué)向剛老師等的協(xié)助，在此一并致謝！

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(責(zé)任編輯： 張明霞)

Molecular evidence for hybridization origin ofRosa×sterilis(Rosaceae)

DENG Hengning1a,1b, GAO Xinfen1a,1b,①, LI Xianyuan2, ZHOU Hongying3

(1. Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences: a. Key Laboratory of Mountain Ecological Restoration and Bioresource Utilization of Chinese Academy of Sciences， b. Key Laboratory of Ecological Restoration and Biodiversity Conservation of Sichuan Province, Chengdu 610041, China; 2. Chongqing Engineering Research Center for Floriculture, College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716, China; 3. Guizhou Botanical Garden, Guiyang 550004, China),

J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(4): 10-17

In order to trace back to origin ofRosa×sterilisS. D. Shi, takingR.×sterilisand fourteen species, two varieties and two forms ofRosaLinn. in its same domain distribution as materials and takingPotentillaparvifoliaFisch. as outgroup, five chloroplast gene fragments (includingpsbA-trnH,trnL-trnF,trnK-matK,psbI-psbKandrpoC1) and two nuclear gene fragments (including ITS andGAPDH) were amplified and sequenced, on this basis, phylogenetic reconstruction was performed by Bayesian inference (BI) and Maximum likelihood method (ML). The results show that a dataset with whole length of 3 365 bp is constructed by combining five chloroplast gene fragments, and in BI phylogenetic tree hereby constructed,R.×sterilisandR.longicuspisBertol. are clustered together, with posterior probability (PP) of 0.96 and bootstrap percentage (LB) of 81%. A dataset with whole length of 617 bp is constructed by 43 ITS sequences,and inBIphylogenetic tree hereby constructed,four haplotypes ofR.×sterilis,R.roxburghiiTratt.,R.roxburghiif.candidaS. D. Shi andR.roxburghiif.inermisS. D. Shi are constituted together in branch a, with PP value of 1.00 and LB value of 98%, and other three haplotypes ofR.×sterilis,R.henryiBouleng. and two haplotypes ofR.longicuspisare constituted together in branch b, with PP value of 0.93 and LB value of 85%. A dataset with whole length of 883 bp is constructed by 63GAPDHgene sequences, and in BI phylogenetic tree hereby constructed,R.×sterilishaplotype H2 and two haplotypes ofR.longicuspisare clustered in branch A, with PP value of 1.00 and LB value of 99%,R.×sterilishaplotype H1 and H3,R.roxburghii,R.roxburghiif.candidaandR.roxburghiif.inermisare clustered in branch B, with PP value of 1.00 and LB value of 100%, andR.×sterilishaplotype H4 is clustered alone in a branch. The comprehensive analyzed result shows thatR.×sterilisoriginates in natural hybrid ofR.longicuspisandR.roxburghii, andR.longicuspisandR.roxburghiiare its maternal parent and paternal parent, respectively.

Rosa×sterilisS. D. Shi; speciation; nuclear gene; chloroplast gene; hybrid parent; phylogenetic tree

2015-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31070173; 31110103911); 中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新項(xiàng)目(KSCX2-EW-J-22; KSCX2-EW-Z-1); 貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合NY字[2010]3030)

鄧亨寧(1988—)，男，四川資陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事植物資源利用與系統(tǒng)發(fā)育方面的研究。

①通信作者 E-mail： xfgao@cib.ac.cn

Q74; Q949.751.8

A

1674-7895(2015)04-0010-08

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.04.02