裴峰，王長(zhǎng)海

納米Fe2O3對(duì)2種微藻生長(zhǎng)的影響

裴峰，王長(zhǎng)海

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)院，江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)

研究了納米Fe2O3顆粒的懸浮液對(duì)蛋白核小球藻和斜生柵藻生長(zhǎng)的影響.通過(guò)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)確定了納米Fe2O3促進(jìn)2藻種生長(zhǎng)的最佳濃度以及臨界濃度范圍，通過(guò)測(cè)定光合特性以及氧化應(yīng)激水平和酶活性層面確定了納米Fe2O3對(duì)2藻種生長(zhǎng)的內(nèi)部物質(zhì)變化的影響，并分析其具體調(diào)節(jié)機(jī)制.結(jié)果表明，納米Fe2O3顆粒的懸浮液對(duì)2藻種生長(zhǎng)的最適濃度是6 mg/L，高于此濃度即對(duì)藻細(xì)胞造成毒性抑制.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為工業(yè)生產(chǎn)廢水的處理排放提供參考.

納米Fe2O3顆粒;蛋白核小球藻;斜生柵藻;光合特性;氧化應(yīng)激

隨著現(xiàn)代工業(yè)中納米材料被大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用，一些納米產(chǎn)品及混合的廢棄物被直接排放到水體中［1-3］，破壞了自然水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定，對(duì)正常的自然環(huán)境產(chǎn)生不利的影響.藻類為一種具有很多優(yōu)勢(shì)的水生模式生物，其中蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)是分布最為廣泛的綠色微藻［4］，這2個(gè)屬的藻種具有針對(duì)污染物有不同的敏感性，通常被用在毒性試驗(yàn)中作為受試生物，它們的生命周期短、繁殖快，易于在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)處理［5-6］.

納米材料進(jìn)入到水體后，對(duì)水生生物生長(zhǎng)的影響及相關(guān)作用機(jī)制已引起了研究者的廣泛關(guān)注.Hund-Rinke等［7］研究結(jié)果表明納米TiO2溶液對(duì)海藻有強(qiáng)烈的抑制作用.此外，在濃度閾值為0.04～1 mg/L C60處理下，鯽魚(yú)體內(nèi)可表達(dá)出強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，肝細(xì)胞中抗氧化酶CAT和SOD顯著升高，并伴隨著GSH含量降低［8］.Franklin等［9］發(fā)現(xiàn)對(duì)比在納米ZnO顆粒、普通ZnO和ZnCl2分別處理下，淡水藻的生長(zhǎng)狀況基本沒(méi)有顯著影響.鐵元素作為日常生活中使用最為普遍的金屬元素，其氧化物的納米材料應(yīng)用較為廣泛，目前對(duì)于輕金屬的納米材料，尤其是關(guān)于納米Fe2O3(nFe2O3)對(duì)水生環(huán)境的影響研究較少.本實(shí)驗(yàn)以醫(yī)用工業(yè)中最常采用的nFe2O3顆粒為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)蛋白核小球藻和斜生柵藻添加不同濃度的nFe2O3顆粒，測(cè)定其對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響，尋求藻類生長(zhǎng)的最佳濃度，以期為藻類的大規(guī)模培養(yǎng)以及工業(yè)廢水的排放提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)純?cè)宸N，來(lái)源于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院海洋科學(xué)專業(yè)海藻生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室.

納米Fe2O3(nFe2O3，30 nm，純度＞99.5%)，購(gòu)于Aladdin Chemistry公司.其他試劑均為優(yōu)級(jí)純或分析純?cè)噭?溶液用超純水配置.

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

藻液培養(yǎng)基:BG-11培養(yǎng)基，120℃下高溫高壓滅菌30 min.

培養(yǎng)方法:調(diào)節(jié)光照培養(yǎng)箱溫度參數(shù)為23± 0.5℃，光暗周期比12 h∶12 h，光強(qiáng)4 000 lx，靜置培養(yǎng)，每日分時(shí)段人工搖瓶4～5次，每次大約5 min.培養(yǎng)的藻種每經(jīng)過(guò)7 d就要及時(shí)接種，更換新的培養(yǎng)基，以便保持藻種的活力［10-11］，實(shí)驗(yàn)中藻種接種量的初始細(xì)胞濃度約為5×106個(gè)/mL.

nFe2O3顆粒水懸浮液制備:稱取適量nFe2O3溶于BG-11培養(yǎng)基中，配制成濃度為5 000 mg/L的母液.將母液蒸汽滅菌(121℃，30 min)后待用，每次實(shí)驗(yàn)配制使用前，需要使用超聲儀將母液超聲振蕩30 min，等積聚沉淀的顆粒重新均勾分散和懸浮之后，取用實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)所用nFe2O3顆粒濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選取不同濃度梯度.

1.3 分析方法

蛋白小球藻細(xì)胞生物量的測(cè)定:在一定范圍內(nèi)，藻細(xì)胞干重與波長(zhǎng)680 nm下的光吸收(A680)呈線性關(guān)系，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞干重.自養(yǎng)蛋白小球藻細(xì)胞干重與A680回歸曲線為Y(×106個(gè)/L)= 5.184 5X+0.074 8，R2=0.990 1.其中Y為單位體積培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞數(shù)，X為A680值.

斜生柵藻細(xì)胞生物量的測(cè)定:自養(yǎng)斜生柵藻藻細(xì)胞干重與A680值回歸曲線為Y(×106個(gè)/L)= 11.573X-0.407 5，R2=0.996 4.其中，Y為單位體積培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞數(shù)，X為A680值.

微藻細(xì)胞破碎:采用超聲波法破碎，取30 mL藻液，5 000 r/min離心10 min，將藻泥重懸于5 mL pH =7的PBS緩沖液中，在冰浴中超聲破碎8 min(功率150 W，占空比50%)，經(jīng)5 000 r/min離心10 min，留上清.

葉綠素含量及光合參數(shù)測(cè)定:參照李合生等［12］方法并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，取5 mL實(shí)驗(yàn)藻液6 000 r/min下離心10 min，去掉上清后加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮，充分搖勻后放置在4℃冰箱中黑暗抽提24 h，再8 000 r/min離心10 min，取出適量上清液于665和649 nm處測(cè)定待測(cè)上清液的吸光度A.根據(jù)計(jì)算公式Ca=13.95×A665-6.88× A649，從而測(cè)得葉綠素a的含量，式中Ca表示葉綠素a的含量(mg/L).

在暴露實(shí)驗(yàn)24 h之后，利用Phyto-PAM分別測(cè)定2藻種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、Y(Ⅱ)、rETR-max).

蛋白質(zhì)的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法［13］，經(jīng)過(guò)回歸分析，得出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=12.712X+0.001，R2=0.998 5，Y為A595值，X為蛋白量(g/L).

MDA、H2O2、SOD、CAT活性測(cè)定均使用南京建成工程研究所的相關(guān)檢測(cè)試劑盒，根據(jù)試劑盒方法檢測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 nFe2O3對(duì)2藻種生長(zhǎng)情況的影響

不同濃度nFe2O3顆粒懸浮液(0、2、4、6、8、10、20 mg/L)處理蛋白核小球藻和斜生柵藻后，藻細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1.

圖1 不同濃度nFe2O3處理下2藻種的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of the two algae species in different concentrations of nano-Fe2O3

由圖1可見(jiàn)，在實(shí)驗(yàn)前期，nFe2O3基本上不影響蛋白核小球藻和斜生柵藻的生長(zhǎng)，nFe2O3處理組和對(duì)照組都在相同的狀態(tài)上增長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的差別;但是隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加，各nFe2O3處理組與對(duì)照組相比生物量都呈現(xiàn)出不同程度的變化.第7天時(shí)在低濃度(2 mg/L和4 mg/L)nFe2O3處理下，蛋白核小球藻的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比相差不大，都是3.2×107個(gè)/L左右;但是6 mg/L nFe2O3的處理組細(xì)胞增殖到3.9×107個(gè)/L，表現(xiàn)出一定的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)跡象，隨著nFe2O3的濃度繼續(xù)加大，出現(xiàn)一定的抑制效應(yīng)，細(xì)胞數(shù)下降，說(shuō)明高于6 mg/ L的nFe2O3對(duì)藻細(xì)胞具備一定的毒性抑制效應(yīng)(圖1 A).斜生柵藻處理組也表現(xiàn)出類似現(xiàn)象，nFe2O3處理濃度在6 mg/L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到5.4×107個(gè)/L (對(duì)照組為4.6×107個(gè)/L)，有一定促細(xì)胞生長(zhǎng)的趨勢(shì);之后隨著nFe2O3濃度繼續(xù)增加，對(duì)藻的生長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的抑制作用(圖1 B).

2.2 nFe2O3處理藻細(xì)胞后的電鏡觀測(cè)

在添加不同濃度的nFe2O3并培養(yǎng)5 d后，對(duì)納米顆粒及與藻細(xì)胞的結(jié)合情況進(jìn)行電鏡觀測(cè)，如圖2所示.可以看出，nFe2O3與藻細(xì)胞的結(jié)合較為緊密，但是低濃度下納米顆粒在藻液中分布量很小，只有少部分藻細(xì)胞會(huì)接觸到納米材料，由上述暴露實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果表明納米材料對(duì)藻細(xì)胞沒(méi)有較大的影響作用，這在電鏡下無(wú)法得出具體的解釋，只觀察到20 mg/L nFe2O3處理后，nFe2O3顆粒結(jié)合在藻細(xì)胞的表面，并在高濃度下形成膜狀存在.

圖2 nFe2O3顆粒及與藻細(xì)胞的結(jié)合電鏡圖Fig.2 The SEM picture of nano-Fe2O3on microalgae cell

2.3 nFe2O3處理對(duì)2藻種中葉綠素a的影響

不同濃度nFe2O3處理蛋白核小球藻和斜生柵藻8 d后，藻細(xì)胞中葉綠素a含量變化如圖3所示.

圖3 不同濃度nFe2O3對(duì)藻細(xì)胞中葉綠素a含量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of nano-Fe2O3on chlorophyll a content in the algae cells

由圖3 A可以看出，隨著nFe2O3濃度的增加，蛋白核小球藻的葉綠素a含量先升高再降低.低濃度處理組的葉綠素a含量和對(duì)照組相差不大，但6 mg/L nFe2O3處理組的葉綠素a含量明顯高于對(duì)照組，達(dá)到0.04 pg/細(xì)胞;隨著濃度繼續(xù)增大，葉綠素a含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，至20 mg/L nFe2O3處理組時(shí)降低到0.03 pg/細(xì)胞.圖3 B中，斜生柵藻也出現(xiàn)類似情況:6 mg/L nFe2O3處理組的葉綠素a含量達(dá)到0.043 pg/細(xì)胞，明顯高于對(duì)照組，隨著nFe2O3濃度增加，葉綠素a含量最低降至0.026 pg/細(xì)胞.葉綠素a作為藻細(xì)胞中參與進(jìn)行光合作用的重要色素，其含量改變可以用來(lái)間接地對(duì)細(xì)胞的光合系統(tǒng)的反應(yīng)變化以及生物的代謝方面進(jìn)行評(píng)價(jià).

上述結(jié)果表明，nFe2O3對(duì)蛋白核小球藻和斜生柵藻的葉綠素a含量變化有一定影響，主要體現(xiàn)在較低濃度處理時(shí)影響基本不明顯，在濃度達(dá)到6 mg/L時(shí)明顯促進(jìn)葉綠素a累積，但隨著濃度增大，又會(huì)抑制葉綠素a生成.這與2.1項(xiàng)中nFe2O3對(duì)2藻種生長(zhǎng)狀況表現(xiàn)出低濃度無(wú)影響、高濃度抑制的結(jié)論是相吻合的.在植物細(xì)胞中，光合色素尤其是葉綠素的作用是通過(guò)光反應(yīng)中心吸收光能，并且通過(guò)電子傳遞將光能進(jìn)行轉(zhuǎn)變疏導(dǎo)，納米材料本身具備的光敏性和光催化，使藻細(xì)胞對(duì)光能有一定的吸收，從而對(duì)光合作用的進(jìn)程產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而對(duì)藻類細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同效果.

2.4 nFe2O3處理對(duì)光合參數(shù)Fv/Fm、Y(Ⅱ)、rETRmax的影響

葉綠素?zé)晒庾鳛橐环N廣泛使用的良好指標(biāo)，通過(guò)對(duì)各熒光參數(shù)的數(shù)據(jù)分析，可以較為快速有效地獲取細(xì)胞有關(guān)光能利用的信息.光合系統(tǒng)中光反應(yīng)中心(PSⅡ)產(chǎn)生的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值表征植物的最大光合能力，植物實(shí)際的量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)表征植物細(xì)胞的實(shí)際光合效率，最大電子傳遞效率rETRmax是聯(lián)系光反應(yīng)和暗反應(yīng)的中間紐帶，可以間接反映出細(xì)胞吸收光量子的程度.2.4.1Fv/Fm的測(cè)定結(jié)果不同濃度nFe2O3處理5 d后，2藻種的Fv/Fm的變化見(jiàn)圖4.

圖4 不同濃度nFe2O3對(duì)2藻種Fv/Fm的影響Fig.4 Effect of different concentrations of nano-Fe2O3on Fv/ Fmof the two algae species

當(dāng)藻細(xì)胞受到外界因素脅迫時(shí)，F(xiàn)v/Fm會(huì)有明顯的下降趨勢(shì).由圖4可見(jiàn)，較高濃度nFe2O3處理下，2藻種細(xì)胞Fv/Fm均逐漸降低，顯示出一定的脅迫作用.在圖4 A、4 B中，各處理組的Fv/Fm均低于0.65，尤其在濃度高于6 mg/L的處理組中Fv/Fm值明顯降低.值得注意的是，各濃度處理組第2天的Fv/Fm都有下降趨勢(shì)，但第3天，濃度低于6 mg/L的處理組的Fv/Fm數(shù)值有一定的恢復(fù).在正常狀態(tài)下，F(xiàn)v/Fm是一個(gè)較為穩(wěn)定的數(shù)值，藻類數(shù)值約為0.65［14］，當(dāng)藻類受到外界因素的脅迫時(shí)，F(xiàn)v/Fm數(shù)值會(huì)顯著下降［15］，因此這項(xiàng)指標(biāo)可作為環(huán)境因素脅迫或光抑制對(duì)植物光合作用影響的判定指標(biāo).

2.4.2 Y(Ⅱ)的測(cè)定結(jié)果不同濃度nFe2O3對(duì)蛋白核小球藻和斜生柵藻Y(Ⅱ)的影響如圖5所示.

圖5 不同濃度nFe2O3對(duì)2藻種Y(Ⅱ)的影響Fig.5 Effect of different concentrations of nano-Fe2O3on Y(Ⅱ) of the two algae species

由圖5可以看出，nFe2O3對(duì)2藻種的作用效果基本相似:低濃度處理(＜6 mg/L)時(shí)，2藻種的Y(Ⅱ)值基本和對(duì)照組相差不大;但是當(dāng)超過(guò)該濃度臨界值時(shí)，2藻種的Y(Ⅱ)值都明顯下降，且濃度越高數(shù)值降得越低.Y(Ⅱ)值可以直觀地表征出細(xì)胞的實(shí)際光合效率，正常的生長(zhǎng)狀態(tài)下其可以和固定CO2效果保持一一對(duì)應(yīng)的線性相關(guān)，一旦細(xì)胞的電子傳遞鏈?zhǔn)艿酵庖蛩孛{迫時(shí)，線性關(guān)系就不再存在.圖5的結(jié)果表明，在濃度高于6 mg/L時(shí)，nFe2O3處理會(huì)使得2藻種的生長(zhǎng)均受到一定程度的脅迫，實(shí)際的光合效率會(huì)降低，從而造成藻細(xì)胞整個(gè)光合系統(tǒng)對(duì)光合作用產(chǎn)生影響.

2.4.3 rETRmax的測(cè)定結(jié)果不同濃度nFe2O3對(duì)蛋白核小球藻和斜生柵藻rETRmax的影響見(jiàn)圖6.

圖6基本反映出了傳遞效率的趨勢(shì):低濃度nFe2O3處理組和對(duì)照組變化基本一致，傳遞效率沒(méi)有較大的影響;但隨著濃度增大，超過(guò)臨界值(6 mg/L)時(shí)，rETRmax迅速下降，表明細(xì)胞受到一定的外界脅迫，無(wú)法正常進(jìn)行電子運(yùn)輸，間接對(duì)光合作用產(chǎn)生影響.

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加不同濃度nFe2O3進(jìn)行處理后，蛋白核小球藻和斜生柵藻的熒光參數(shù)Fv/ Fm、Y(Ⅱ)、rETRmax都有一定的變化.Fv/Fm下降說(shuō)明高濃度的nFe2O3作用使PSⅡ反應(yīng)中心受到損傷，影響到光反應(yīng)階段的原初反應(yīng)，進(jìn)而遏制了電子傳遞，使得rETRmax呈現(xiàn)出下降趨勢(shì);Y(Ⅱ)在高濃度nFe2O3處理下降低，是由于阻礙了藻細(xì)胞合成化能物質(zhì)(NADPH和ATP)的能力，影響藻細(xì)胞對(duì)碳進(jìn)行固定.

圖6 不同濃度納米Fe2O3對(duì)2藻種rETRmax的影響Fig.6 Effect of different concentrations of nano-Fe2O3on rETRmax of the two algae species

2.5 Fe2O3顆粒對(duì)2藻種氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

多種納米材料脅迫均會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化自由基，對(duì)生物體造成一定的氧化損傷，擾亂細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，甚至發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化等現(xiàn)象.本研究選取不同濃度的nFe2O3對(duì)蛋白核小球藻和斜生柵藻進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)處理，測(cè)定處理8 d后藻細(xì)胞內(nèi)氧化產(chǎn)物含量及相關(guān)抗氧化酶的活力，檢測(cè)藻體受到的氧化脅迫損傷程度，考察nFe2O3對(duì)2藻種氧化應(yīng)激水平的影響.

2.5.1 丙二醛(MDA)測(cè)定結(jié)果不同濃度nFe2O3作用5 d后，藻細(xì)胞內(nèi)的MDA含量見(jiàn)圖7.

由圖7可見(jiàn)，隨著處理濃度的增加，2藻種的MDA含量都呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，濃度高于6 mg/L的處理組比低濃度處理組表現(xiàn)出更加顯著的結(jié)果.以每毫克蛋白質(zhì)中的MDA含量計(jì)，在8 mg/L

nFe2O3處理組中MDA達(dá)到17.69 nmol/mg，比對(duì)照組高出一倍多.MDA為細(xì)胞受脅迫導(dǎo)致氧化損傷的一個(gè)重要檢測(cè)指示，它是活性氧和生物體細(xì)胞膜以及膜上酶類、不飽和脂肪酸的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的產(chǎn)物，從側(cè)面可以表征出機(jī)體受到氧化損傷的程度.可見(jiàn)，濃度大于6 mg/L的nFe2O3處理5 d后會(huì)對(duì)2藻種的細(xì)胞造成一定的氧化損傷.

圖7 不同濃度nFe2O3對(duì)2藻種MDA含量的影響Fig.7 Effect of different concentrations of nano-Fe2O3on MDA contentr of the two algae species

2.5.2 過(guò)氧化氫(H2O2)含量測(cè)定結(jié)果過(guò)氧化氫(H2O2)是生物體在自身代謝過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物，它屬于超氧自由基ROS的一種，當(dāng)有外源因子添加至生物體生長(zhǎng)環(huán)境中，機(jī)體在一定程度上受到該因素的脅迫，這時(shí)就會(huì)出現(xiàn)大量的活性氧成分，其中包括H2O2有積累現(xiàn)象產(chǎn)生，過(guò)多的H2O2會(huì)直接導(dǎo)致生物體的機(jī)能受到損傷.不同濃度nFe2O3對(duì)2藻種處理5 d后細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量結(jié)果見(jiàn)圖8.

圖8 不同濃度nFe2O3對(duì)2藻種H2O2含量的影響Fig.8 Effect of different concentrations of nano-Fe2O3on H2O2contentr of the two algae species

由圖8可見(jiàn)，不同濃度的處理組中H2O2含量相比較對(duì)照組都有一定的提高，且隨著nFe2O3濃度增加H2O2含量也呈現(xiàn)增加.一般情況下，機(jī)體的H2O2含量處于動(dòng)態(tài)平衡中，生物體通過(guò)各種途徑的調(diào)控來(lái)清除多余的H2O2，使其含量達(dá)到穩(wěn)定的、機(jī)體可承受的閾值，盡可能低的減少其對(duì)生物體的氧化損傷，但這種方式還需要與抗氧化酶配合作用，利用酶類活性調(diào)控完成.

2.5.3 過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定結(jié)果不同濃度nFe2O3對(duì)2藻種處理5 d后，藻細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9.

圖9 不同濃度納米Fe2O3對(duì)2藻種CAT活力的影響Fig.9 Effect of different concentrations of nano-Fe2O3on CAT activity of the two algae species

圖9 中3個(gè)低濃度(2、4、6 mg/L)處理組的CAT活力比對(duì)照組略微提高，而濃度高于6 mg/L的處理組則酶活力明顯增加.主要原因應(yīng)該是由于CAT能夠分解H2O2，產(chǎn)生氧和水，進(jìn)而清除細(xì)胞內(nèi)多余的H2O2，因此大于6 mg/L的高濃度處理下CAT活性的大幅度提升可能是導(dǎo)致2.5.2項(xiàng)中H2O2含量未出現(xiàn)明顯變化的主要原因.納米顆粒的添加會(huì)對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生脅迫，可能會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的H2O2含量，進(jìn)而促使上調(diào)CAT活性，以減少H2O2含量，降低納米顆粒對(duì)藻細(xì)胞造成的氧化損傷.

2.5.4 總超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定結(jié)果

不同濃度nFe2O3對(duì)2藻種處理5 d后，藻細(xì)胞內(nèi)SOD的含量變化情況見(jiàn)圖10.

由圖10可見(jiàn)，單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)中SOD的活力隨添加處理濃度的增加出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，處理濃度高于6 mg/L的處理組與對(duì)照組相比尤為明顯.綜合上述結(jié)果，在添加nFe2O3后，2藻種細(xì)胞中的SOD活力會(huì)在MDA含量增加時(shí)顯著的上調(diào)，兩者之間有著良好的正相關(guān)關(guān)系，這說(shuō)明高濃度的nFe2O3的確對(duì)2種類藻產(chǎn)生了一定毒害作用，具體表現(xiàn)為膜脂過(guò)氧化造成損傷，與此同時(shí)機(jī)體抗氧化的活力也得到相應(yīng)提高.SOD作為一種重要的超氧自由基(O2-)天然清除劑，在生物體內(nèi)氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡中扮演著決定性的角色.其主要功能是催化氫離子和超氧化物進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)，SOD活力也與MDA含量有一定關(guān)聯(lián).丙二醛(MDA)為生物體內(nèi)氧自由基攻擊脂質(zhì)作用后發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的氧化終產(chǎn)物，從側(cè)面反映了機(jī)體確實(shí)遭受到氧自由基的攻擊并有一定損傷，針對(duì)傷害機(jī)體又反饋性地上調(diào)SOD活力增強(qiáng)清除活性氧.兩者相互關(guān)聯(lián)，當(dāng)生物體遭受外界因子脅迫形成膜脂過(guò)氧化或者氧化損傷時(shí)，必定使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而在根本上影響了抗氧化酶系統(tǒng)的活力.

圖10 不同濃度nFe2O3對(duì)2藻種SOD活力的影響Fig.10 Effect of different concentrations of nano-Fe2O3on SOD activity of the two algae species

體內(nèi)外研究結(jié)果表明多種納米顆?？梢砸饳C(jī)體產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng).Andre等［1］研究結(jié)果表明目前導(dǎo)致多種納米材料引起細(xì)胞脅迫或產(chǎn)生毒性的主要方式是生成活性氧和機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng).另外，多種新型人工合成的納米顆粒會(huì)通過(guò)自身的張力和理化特性使蛋白質(zhì)變性，造成細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性發(fā)生變化甚至是喪失，這為納米材料富集的一些蛋白質(zhì)絡(luò)合物或者其他外界因素進(jìn)入細(xì)胞中提供更便利的條件，在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用上給予更多的啟示［16］.

朱小山等［17］研究表明長(zhǎng)期使用低劑量富勒烯(C60)對(duì)鯽魚(yú)進(jìn)行處理，引起氧化傷害，降低鯽魚(yú)肝臟組織中的CAT和SOD的活性.本研究的結(jié)果顯示nFe2O3處理使得蛋白核小球藻和斜生柵藻的SOD活性隨著添加的濃度的增加而上調(diào)，這與朱小山的研究結(jié)果產(chǎn)生差異，說(shuō)明不同的實(shí)驗(yàn)受體、不同的納米材料所得結(jié)果是具有差異的.

3 結(jié)論

nFe2O3在生長(zhǎng)抑制、光合影響以及氧化應(yīng)激等方面對(duì)蛋白核小球藻和斜生柵藻均會(huì)產(chǎn)生一定影響.nFe2O3對(duì)于2藻種生長(zhǎng)的臨界濃度為6 mg/L，低于此濃度的nFe2O3對(duì)蛋白核小球藻和斜生柵藻的生長(zhǎng)以及生物量變化作用前期基本無(wú)影響，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)濃度為6 mg/L的nFe2O3會(huì)對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用.濃度高于6 mg/L的nFe2O3暴露處理對(duì)2藻種都具有一定的氧化損傷，表現(xiàn)為MAD、H2O2、CAT、SOD含量增加.

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Effect of Nano-Fe2O3on Growth of Two Species of Microalgae

PEI Feng，WANG Chang-hai
(College of Resources and Environmental Science，Nanjing Agricultural University，Jiangsu Key Laboratory of Marine Biology，Nanjing 210095 China)

The effect of Fe2O3nanoparticle suspension on the growth of Chlorella pyrenoidosa and Scenedesmus obliquus is studied.The optimal concentration and critical concentration range of nano-Fe2O3to promote the growth of the two microalgae are obtained through growth inhibition test.Effect of nano-Fe2O3on internal material change of the two microalgae and the corresponding mechanisms are revealed by testing the photosynthetic characteristics，the level of oxidative stress，and the enzyme activity.The results show that optimum concentration of nano-Fe2O3on the growth of Chlorella pyrenoidosa and Scenedesmus obliquus is 6 mg/L，and higher concentration will result in cell toxicity inhibition.The results provide a reference for managing industrial waste water.

Fe2O3nanoparticle;Chlorella pyrenoidosa;Scenedesmus obliquus;photosynthetic characteristic;oxidative stress

TD7

A

(責(zé)任編輯 周雪瑩)

1004-8820(2015)03-0186-07

10.13951/j.cnki.37-1213/n.2015.03.007

2014-04-16

國(guó)家863課題資助項(xiàng)目(2012AA021706).

裴峰(1989-)，男，安徽馬鞍山人，碩士研究生.

王長(zhǎng)海(chwang@njau.edu.cn)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事海洋生化工程、微藻生物技術(shù)研究.