李潔瓊， 紀(jì)玉強(qiáng)， 楊 威， 姚英民， 劉青光， 郭 成△

1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061

2西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710002

Cp G ODN對Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞分化的影響＊

李潔瓊1， 紀(jì)玉強(qiáng)2， 楊 威1， 姚英民1， 劉青光1， 郭 成1△

1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061

2西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710002

目的 研究免疫佐劑CpG ODN對小鼠脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞分化的影響，為進(jìn)一步的臨床免疫治療應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法 體外分離小鼠脾細(xì)胞后，加入抗CD3單抗及抗CD28單抗培養(yǎng)，并相應(yīng)加入誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化的細(xì)胞因子TGF－β、IL－2或誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的細(xì)胞因子TGF－β、IL－6、IL－23，培養(yǎng)24 h后加入CpG1982、CpG1826繼續(xù)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg／Th17細(xì)胞，利用實(shí)時定量PCR檢測Foxp3、RORγt、IL－10、IL－17 mRNA的水平，Western blot檢測Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)，ELISA檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL－10、IL－17水平。結(jié)果 在細(xì)胞因子TGF－β、IL－2的誘導(dǎo)下，CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增多，核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 m RNA和蛋白水平均增高，且細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL－10的水平也升高，在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的同時加入CpG1826培養(yǎng)后CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少，F(xiàn)oxp3水平降低，培養(yǎng)上清中IL－10的水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；單獨(dú)加入Cp G1826以及在培養(yǎng)液中加入細(xì)胞因子TGF－β、IL－6、IL－23后，Th17細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，核轉(zhuǎn)錄因子RORγt水平升高，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL－17水平增加，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），Cp G1826聯(lián)合細(xì)胞因子組則對Th17細(xì)胞分化具有更加明顯的刺激效應(yīng)（P＜0.05）。結(jié)論 免疫佐劑CpG1826具有抑制小鼠脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞分化、促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的作用，從而發(fā)揮對Treg／Th17系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能。

Cp G ODN； 免疫調(diào)節(jié)； Treg細(xì)胞； Th17細(xì)胞

CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞是T細(xì)胞中具有特異細(xì)胞膜表面分子和核轉(zhuǎn)錄因子的兩類細(xì)胞亞群，叉頭樣螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）對于CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞的發(fā)育與功能維持具有重要的作用［1－3］，維甲酸相關(guān)孤兒受體（RORγt）是Th17細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子［4－5］。CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的CD4 T淋巴細(xì)胞亞群，而Th17細(xì)胞作為效應(yīng)T細(xì)胞亞群，在防御感染、腫瘤相關(guān)免疫中具有重要作用，Treg／Th17的動態(tài)平衡在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

Cp G ODN是指一類人工合成的含Cp G基序的寡聚脫氧核糖核苷酸，作為免疫佐劑Cp G ODN被較為廣泛地應(yīng)用于腫瘤免疫治療。研究發(fā)現(xiàn)，Cp G ODN可以通過刺激DC細(xì)胞分泌IL－12促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向分化，同時Cp G ODN具有抑制CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞的功能［6］，但Cp G ODN對CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞，加入不同誘導(dǎo)因素，同時加入Cp G ODN，研究CpG ODN對Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞分化的影響，探討通過人為干預(yù)，改變細(xì)胞微環(huán)境中CD4＋CD25＋Treg／Th17動態(tài)平衡的效果，并在此基礎(chǔ)上，未來進(jìn)一步研究細(xì)胞微環(huán)境中CD4＋CD25＋Treg／Th17動態(tài)平衡對腫瘤細(xì)胞生長的影響，為Cp G ODN在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用，提供良好的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象 健康雌性C57BL／6小鼠50只，清潔級動物，6～8周齡，體重18～21 g，平均20 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 PE抗小鼠Foxp3、PE大鼠Ig G2b，κ同型對照、小鼠Foxp3緩沖液、BD Cytofix／CytopermTMFixation／Permeabilization Kit購自美國BD公司；FITC抗小鼠CD4、Alexa Fluor?647抗小鼠IL－17 A、Alexa Fluor?647大鼠IgG2a同型對照購自美國eBioscience公司；rh TGF－β、rmIL－2、rmIL－6、rmIL－23購自英國Pepro Tech公司；ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（芬蘭Thermo公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio－tekEL×800）；熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國Bio－Rad）；流式細(xì)胞儀FACS Calibur（美國貝克曼公司）；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠脾細(xì)胞懸液制備 參照我實(shí)驗(yàn)室既往常用方法制備小鼠脾細(xì)胞懸液［7］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 在24孔板中每孔加入1.0 m L脾細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后根據(jù)文獻(xiàn)［8－12］加入不同細(xì)胞因子，進(jìn)行脾細(xì)胞誘導(dǎo)刺激，實(shí)驗(yàn)分組如下:①正常脾細(xì)胞對照；②脾細(xì)胞＋CpG1982（無免疫活性的對照Cp G ODN）；③脾細(xì)胞＋Cp G1826（B型 CpG ODN）；④脾細(xì)胞＋TGF－β＋I(xiàn)L－2；⑤脾細(xì)胞＋TGF－β＋I(xiàn)L－2＋Cp G1982；⑥脾細(xì)胞＋TGF－β＋I(xiàn)L－2＋CpG1826；⑦脾細(xì)胞＋TGF－β＋I(xiàn)L－6＋I(xiàn)L－23；⑧脾細(xì)胞＋TGF－β＋I(xiàn)L－6＋I(xiàn)L－23＋Cp G1982；⑨脾細(xì)胞＋TGF－β＋I(xiàn)L－6＋I(xiàn)L－23＋Cp G1826。

每孔脾細(xì)胞培養(yǎng)液中加入抗CD3單抗（3 ng／mL）及抗CD28單抗（3 ng／m L），第4、5、6組分別加入TGF－β（3 ng／m L）、IL－2（5 ng／m L），第7、8、9組分別加入TGF－β（3 ng／m L）、IL－6（20 ng／m L）、IL－23（20 ng／m L）；脾細(xì)胞培養(yǎng)48 h后第2、5、8組加入CpG1982（3μg／m L），第3、6、9組加入CpG1826（3 μg／m L），所有試劑濃度都為在激活混合物中的終濃度，每組做5個復(fù)孔。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg、Th17細(xì)胞 將每組脾細(xì)胞懸液分為4管，一管用于檢測Treg細(xì)胞，一管用于檢測Th17細(xì)胞，另兩管分別為相應(yīng)同型對照。分別加入FITC－CD4抗體、PE－Foxp3、Alexa Fluor?647－IL－17抗體進(jìn)行固定、破膜、染色后，應(yīng)用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測，通過Cellquest軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 實(shí)時定量PCR測定Foxp3、RORγt、IL－10、IL－17 m RNA的表達(dá) 參照本實(shí)驗(yàn)室既往常用方法進(jìn)行定量PCR檢測［13］。根據(jù)文獻(xiàn)報道合成Foxp3、RORγt、IL－17引物，根據(jù)Primer Premier 5.0軟件參照GenBank cDNA序列設(shè)計IL－10、HPRT引物，并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯配）。委托上海生物工程技術(shù)公司合成（表1）。

表1 PCR引物Table 1 PCR primer sequences

1.2.5 Western blot檢測Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)參照本實(shí)驗(yàn)室既往常用方法進(jìn)行Western blot檢測［13］。

1.2.6 ELISA檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL－10、IL－17水平 參照本實(shí)驗(yàn)室既往常用方法［7］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，根據(jù)方差齊性采用單因素方差分析（ANOVA）或非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CpG ODN對Treg細(xì)胞分化的影響

2.1.1 Cp G ODN對Treg細(xì)胞數(shù)量的影響 分離小鼠脾細(xì)胞后，加入抗CD3單抗（3 ng／m L）及抗CD28單抗（3 ng／m L）培養(yǎng)，并相應(yīng)加入誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化的細(xì)胞因子TGF－β（3 ng／m L）、IL－2（5 ng／mL），培養(yǎng)24 h后加入3μg／mL Cp G1982、CpG1826繼續(xù)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色流式細(xì)胞檢測，以CD4＋細(xì)胞設(shè)門進(jìn)行分析。CpG ODN對Treg細(xì)胞分化的影響結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示:CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞在正常小鼠脾細(xì)胞中占CD4＋T細(xì)胞的（12.98±1.35）%，單獨(dú)加入Cp G1982（無免疫活性的對照Cp G）、CpG1826（B型）培養(yǎng)后CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的（13.06±1.21）%、（13.64±1.30）%，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；在小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TGF－β、IL－2后CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量明顯升高，占CD4＋T細(xì)胞的（23.96± 1.97）%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；加入TGF－β、IL－2的同時加入CpG1982培養(yǎng)后CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的（24.05±1.98）%，與不加CpG組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而加入Cp G1826培養(yǎng)后CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少，占CD4＋T細(xì)胞的（15.80±1.47）%，與只加細(xì)胞因子組及細(xì)胞因子加CpG1982組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），但仍然高于對照組（P＜0.05）。

2.1.2 不同劑量CpG1826對Treg細(xì)胞分化的影響 在脾細(xì)胞培養(yǎng)液中加入抗CD3單抗（3 ng／m L）及抗CD28單抗（3 ng／m L），并相應(yīng)加入誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化的細(xì)胞因子TGF－β（3 ng／m L）、IL－2（5 ng／m L），培養(yǎng)24 h后分別加入1、3、6、9μg／m L CpG1826培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色檢測CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞，結(jié)果見圖2。加入不同濃度的CpG1826均能明顯抑制CD4＋Foxp3＋Treg的分化，但3、6、9μg／m L三個不同劑量的Cp G1826的抑制效果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 CpG ODN對Treg細(xì)胞分化的影響Fig.1 Effects of CpG ODN on cell differentiation

圖2 不同劑量CpG1826對Treg細(xì)胞分化的影響Fig.2 Effects of Cp G1826 at different doses on cell differentiation

2.1.3 不同作用時間Cp G1826對Treg細(xì)胞分化的影響 我們選擇3μg／m L Cp G1826作為刺激劑量，并以PBS溶液作陰性對照，觀察在不同的作用時間對CD4＋Foxp3＋Treg的分化的影響，結(jié)果見圖3，在加入Cp G1826 12 h后就可以發(fā)揮抑制作用，作用12、24、48、72、96 h后CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞分別為:（21.12±1.96）%、（16.80± 2.01）%、（15.16±1.37）%、（16.05±1.68）%、（15.06±1.54）%。作用48 h后抑制達(dá)到高峰，48、72、96 h抑制效果未見顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 CpG ODN對Th17細(xì)胞分化的影響

更換誘導(dǎo)因子為TGF－β（3 ng／m L）、IL－6（20 ng／m L）、IL－23（20 ng／m L），同法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色檢測。Cp G ODN對Th17細(xì)胞分化的影響的結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示:Th17細(xì)胞在正常小鼠脾細(xì)胞中僅占CD4＋T細(xì)胞的（0.49±0.16）%，單獨(dú)加入無免疫活性的CpG1982培養(yǎng)后Th17細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的（0.62±0.19）%，而單獨(dú)加入CpG1826后Th17細(xì)胞數(shù)量明顯增加，占CD4＋T細(xì)胞的（3.01 ±0.75）%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TGF－β（3 ng／m L）、IL－6（20 ng／m L）、IL－23（20 ng／m L）后Th17細(xì)胞數(shù)量明顯升高，占CD4＋T細(xì)胞的（3.68± 0.87）%，同時加入Cp G1982培養(yǎng)后Th17細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的（3.79±1.02）%，與不加Cp G組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而同時加入CpG1826培養(yǎng)后Th17細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的（5.11 ±1.08）%，與單純細(xì)胞因子組及同時加入CpG1982組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖3 不同干預(yù)時間CpG1826對Treg細(xì)胞分化的影響Fig.3 Effects of CpG1826 at different time points on cell differentiation

圖4 CpG ODN對Th17細(xì)胞分化的影響Fig.4 Effects of Cp G ODN on Th17 cell differentiation

2.3 CpG ODN對Foxp3、RORγt、IL－10、IL－17 mRNA表達(dá)的影響

2.3.1 CpG ODN對Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，對照組、單獨(dú)CpG1982組及單獨(dú)Cp G1826組Foxp3 mRNA水平分別為（6.46±1.38）、（5.76±1.65）、（7.01±1.80），之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而在細(xì)胞因子TGF－β、IL－2誘導(dǎo)下Foxp3 mRNA水平明顯增高（16.11±3.76），明顯高于對照組、CpG1982組及CpG1826組，相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），同時加入CpG1982 Foxp3 mRNA水平（16.39±4.06）與細(xì)胞因子組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在TGF－β、IL－2存在的情況下同時加入CpG1826，F(xiàn)oxp3 mRNA水平降低（10.21± 3.20），與只加TGF－β、IL－2組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），但仍然高于對照組。

圖5 不同誘導(dǎo)因素作用下小鼠脾細(xì)胞Foxp3 mRNA的表達(dá)Fig.5 Foxp3 mRNA expression in splenocytes of mice under different inducing conditions

而Th17細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA水平在細(xì)胞因子TGF－β、IL－6、IL－23誘導(dǎo)下表達(dá)明顯增高（2.43±0.51），明顯高于對照組（0.49±0.26）及單獨(dú)CpG1982組（0.60±0.20），相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。單獨(dú)加入CpG1826后RORγt mRNA水平增高（1.77±0.64），與對照組及單獨(dú)CpG1982組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在TGF－β、IL－6、IL－23存在的情況下加入CpG1826后RORγt mRNA水平（3.91±0.58）高于只加細(xì)胞因子組，相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。2.3.2 CpG ODN對IL－10、IL－17 mRNA表達(dá)的影響 Treg細(xì)胞可以分泌IL－10，Th17細(xì)胞主要分泌效應(yīng)分子IL－17，為了研究Cp G ODN對CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞功能的影響，我們利用熒光定量PCR檢測了不同誘導(dǎo)因素作用下細(xì)胞因子IL－10、IL－17基因表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞在細(xì)胞因子TGF－β、IL－2誘導(dǎo)下IL－10 mRNA水平明顯增高（24.25±4.86），明顯高于對照組（8.25 ±1.57）、Cp G1982組（9.10±1.97）及Cp G1826組（9.24±2.11），相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；在TGF－β、IL－2存在的情況下加入CpG1826，IL－10 mRNA水平降低（15.34±3.99），與只加TGF－β、IL－2組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但仍然高于正常對照組（P＜0.05）。見圖7。

圖6 不同誘導(dǎo)因素作用下小鼠脾細(xì)胞RORγt m RNA的表達(dá)Fig.6 RORγt mRNA expression in splenocytes of mice under different inducing conditions

圖7 CpG ODN對IL－10 mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effect of CpG ODN on IL－10 mRNA expression

在脾細(xì)胞培養(yǎng)液中加入細(xì)胞因子TGF－β、IL－6、IL－23后IL－17 mRNA水平明顯增高（3.88± 1.21），明顯高于對照組（0.89±0.21）及CpG1982組（0.98±0.26），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。單獨(dú)加入Cp G1826，IL－17 m RNA水平也升高（2.57±0.87），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在TGF－β、IL－6、IL－23存在的情況下加入CpG1826，IL－17 mRNA水平（5.55±1.69）高于只加細(xì)胞因子組及細(xì)胞因子加Cp G1982組，相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖8）。

圖8 CpG ODN對IL－17 mRNA表達(dá)的影響Fig.8 Effect of CpG ODN on IL－17 mRNA expression

2.4 CpG ODN對Foxp3、RORγt、IL－10、IL－17蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 Cp G ODN對Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)的影響 Foxp3、RORγt是Treg、Th17細(xì)胞特異的核轉(zhuǎn)錄因子，為了研究CpG ODN對Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞分化的影響，我們利用Western blot檢測了RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖9A）發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3蛋白在細(xì)胞因子TGF－β、IL－2誘導(dǎo)下水平明顯增高（0.42±0.08），明顯高于對照組（0.14±0.03）、CpG1982組（0.15±0.03）及CpG1826組（0.15±0.04），相比差異具統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；在TGF－β、IL－2存在的情況下加入CpG1826，F(xiàn)oxp3蛋白水平降低（0.26±0.05），與只加TGF－β、IL－2組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但仍然高于對照組。Th17細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子RORγt蛋白在細(xì)胞因子TGF－β、IL－6、IL－23誘導(dǎo)下水平明顯增高（0.28±0.05），明顯高于對照組（0.08±0.02）及CpG1982組（0.09±0.02），相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。單獨(dú)加入CpG1826時，RORγt蛋白水平增高（0.22±0.05），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在TGF－β、IL－6、IL－23存在的情況下加入CpG1826，RORγt蛋白水平（0.42±0.08）高于只加細(xì)胞因子組及細(xì)胞因子加CpG1826組，相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。圖9B。

圖9 Cp G ODN對Foxp3和RORγt蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of CpG ODN on Foxp3 and RORγt protein expression

2.4.2 CpG ODN對脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL－10、IL－17水平的影響 在培養(yǎng)結(jié)束時，收集脾細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測IL－17、IL－10水平，結(jié)果如圖10所示。在培養(yǎng)液中加入TGF－β、IL－2時IL－10水平明顯增高（211.25±38.57）pg／m L，明顯高于對照組（48.24±12.24）pg／m L、CpG1982組（45.21±11.79）pg／m L及CpG1826組（47.58±12.21）pg／m L，相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），同時再加入Cp G1826培養(yǎng)上清IL－10水平降低（107.27±29.67）pg／m L，與只加TGF－β、IL－2組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），但仍然高于對照組。在細(xì)胞因子TGF－β、IL－6、IL－23誘導(dǎo)下培養(yǎng)上清中IL－17水平明顯增高（187.24±37.56）pg／m L，明顯高于對照組（24.25 ±6.78）pg／m L及CpG1982組（26.89±7.24）pg／mL，相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。CpG1982組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），單獨(dú)加入Cp G1826時，IL－17水平增高（127.58±26.78）pg／m L，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在TGF－β、IL－6、IL－23存在的情況下加入CpG1826，IL－17水平（288.57±61.25）pg／mL）高于只加細(xì)胞因子組及細(xì)胞因子加CpG1982組，相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫防御作用的過程是復(fù)雜而精細(xì)的，在識別并清除外來抗原的同時亦伴隨相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，既要避免對自身抗原的應(yīng)答又要將免疫應(yīng)答對宿主組織的病理損傷控制在最小范圍，同時還要維持自穩(wěn)狀態(tài)，在此過程中，Th細(xì)胞和調(diào)節(jié)性細(xì)胞發(fā)揮重要的作用。Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞均屬CD4 T細(xì)胞亞群，介導(dǎo)細(xì)胞因子發(fā)揮不同的免疫效應(yīng)，兩者存在動態(tài)平衡關(guān)系。Th17／Treg失衡參與多種炎癥、自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［1415］。Treg分化主要受TGF－β誘導(dǎo)，而在TGF－β和IL－6同時作用下CD4 T細(xì)胞則分化為Th17細(xì)胞，兩者之間也存在競爭相關(guān)平衡關(guān)系，在Th17和Treg細(xì)胞間存在相互調(diào)控影響的微妙關(guān)系［16］。同時，RORγt是Th17細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子［1718］，主要參與炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病及腫瘤。TGF－β與IL－6可以促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化，而單獨(dú)TGF－β可以促進(jìn)Th0細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化［19］，研究證實(shí)i Treg細(xì)胞可以向Th17細(xì)胞方向分化［2021］。CpG是指由胞嘧啶、鳥嘌呤及使兩者相連的磷酸酯鍵組成的二核苷酸（Cytidine－phosphatte－guanine oligodeoxynucl－eotides，Cp G ODN），是一類以非甲基化Cp G為核心的寡聚脫氧核苷酸序列，作為一種免疫佐劑能激活多種免疫細(xì)胞［2223］。目前認(rèn)為Cp G ODN作為免疫佐劑，主要是通過激活機(jī)體CTL、NK細(xì)胞來發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用，但關(guān)于Cp G ODN對Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞的影響研究甚少。

我們在體外分離小鼠脾細(xì)胞后，在細(xì)胞因子TGF－β、IL－2的誘導(dǎo)下，CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增多，核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA和蛋白水平均增高，且細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL－10的水平也升高，說明TGF－β、IL－2可以上調(diào)Foxp3表達(dá)，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化，促進(jìn)其分泌IL－10。在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的同時加入CpG1826培養(yǎng)后CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少，F(xiàn)oxp3水平降低，提示Cp G1826可以通過抑制Foxp3的表達(dá)來抑制CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞的生成，減少分泌IL－10，而加入無免疫原性的CpG1982這種抑制作用則不存在。Treg細(xì)胞分n Treg和i Treg兩種，為了研究Cp G1826的抑制作用是針對哪種Treg細(xì)胞發(fā)揮的，我們在沒有細(xì)胞因子存在的培養(yǎng)條件下單獨(dú)加入Cp G1826，CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞與正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示其對n Treg細(xì)胞無明顯的抑制作用，而在加入誘導(dǎo)細(xì)胞因子的同時加入CpG1826后CD4＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示CpG1826對iTreg細(xì)胞有抑制作用。

既往研究［18］認(rèn)為Cp G ODN可以促進(jìn)B細(xì)胞分化，刺激B細(xì)胞、DC及巨噬細(xì)胞分泌IL－6，而IL－6在Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用，TGF－β與IL－6可以促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化，而單獨(dú)TGF－β可以促進(jìn)Th0細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化。因此我們推測，CpG1826可能是通過刺激B細(xì)胞、DC及巨噬細(xì)胞分泌IL－6，從而發(fā)揮其抑制i Treg細(xì)胞分化、促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的功能，通過改變Treg／Th17的動態(tài)平衡而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能。CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)中兩類重要的效應(yīng)細(xì)胞，二者的數(shù)量及功能的動態(tài)平衡對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，免疫功能缺陷或機(jī)能失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一，也是眾多免疫相關(guān)性疾病的致病因素。因此，我們期望未來在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對Treg／Th17動態(tài)平衡的改變在相關(guān)疾病免疫治療中的效應(yīng)做更加深入的探討，為免疫佐劑CpG1826在免疫治療方面的應(yīng)用奠定更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

圖10 CpG ODN對培養(yǎng)液中IL－10、IL－17水平的影響Fig.10 Effect of Cp G ODN on IL－10 and IL－17 expression in culture solution

［1］ Marson A，Kretschmer K，F(xiàn)rampton G M，et al.Foxp3 occupancy and regulation of key target genes during T－cell stimulation［J］.Nature，2007，445（7130）:931－935.

［2］ Wang L，Xie Y，Zhu L J，et a1.An association between immunosenescence and CD4（＋）CD25（＋）regulatory T cells:a systematic review［J］.Biomed Environ Sci，2010，23（4）:327－322.

［3］ Hossain D M，Panda A K，Manna A，et a1.Foxp3 acts as a cotranscription factor with STAT3 in tumor－induced regulatory T cells［J］.Immunity，2013，39（6）:1057－1069.

［4］ Huh J R，Leung M W，Huang P，et a1.Digoxin and its derivatives suppress TH17 cell differentiation by antagonizing RORγt activity［J］.Nature，2011，472（7344）:486－490.

［5］ Hsieh C S，Lee H M，Lio C W.Selection of regulatory T cells in the thymus［J］.Nat Rev Immunol，2012，12（3）:157－167.

［6］ La Rosa D F，Gelman A E，Rahman A H，et al.CpG DNA inhibits CD4＋CD25＋Treg suppression through direct My D88－dependent costimulation of effector CD4＋T cells［J］.Immunol Lett，2007，108（2）:183－188.

［7］ 郭成，劉青光，楊威，等.融合基因GM－CSF／IL－2轉(zhuǎn)基因疫苗在肝癌特異性免疫治療中的應(yīng)用［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，28（2）:188－192.

［8］ Xiao S，Jin H，Korn T，et al.Retinoic acid increases Foxp3＋regulatory T cells and inhibits development of Th17 cells by enhancing TGF－beta－driven Smad3 signaling and inhibiting IL－6 and IL－23 receptor expression［J］.J Immunol，2008，181（4）:2277－2284.

［9］ Gu Y，Yang J，Ouyang X，et al.Interleukin 10 suppresses Th17 cytokines secreted by macrophages and T cells［J］.Eur J Immunol，2008，38（7）:1807－1813.

［10］ Zaph C，Du Y，Saenz S A，et al.Commensal－dependent expression of IL－25 regulates the IL－23－IL－17 axis in the intestine［J］.J Exp Med，2008，205（10）:2191－2198.

［11］ Kopf H，de la Rosa G M，Howard O M，et al.Rapamycin inhibits differentiation of Th17 cells and promotes generation of Foxp3＋T regulatory cells［J］.Int Immunopharmacol，2007，7（13）:1819－1824.

［12］ Yang J，Yang M，Htut T M，et al.Epstein－Barr virus－induced gene 3 negatively regulates IL－17，IL－22 and RORgammat［J］.Eur J Immunol，2008，38（5）:1204－1214.

［13］ Guo C，Liu Q G，Zhang L，et al.Double lethal effects of fusion gene of wild－type p53 and JunB on hepatocellular carcinoma cells［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog［Med Sci］，2012，32（5）:663－668.

［14］ 鄭莉，陳紫君，劉純.Th3、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子在自身免疫性甲狀腺疾病發(fā)病中的作用［J］.中國免疫學(xué)雜志，2013，29（1）:43－47.

［15］ Chu M P，Wang D，Zhang Y Y，et al.Pachymantreatment improves CD4 CD25 Treg counts and serum interleukin 4 and interferon levels in a mouse model of Kawasaki disease［J］.Mol Med Rep，2012，5（5）:1237－1240.

［16］ Darmochwal－Kolarz D，Kludka－Sternik M，Tabarkiewicz J，et a1.The predominance of Th17 lymphocytes and decreased number and function of Treg cells in preeclampsia［J］.J Reprod Immunol，2012，93（2）:75－81.

［17］ Manel N，Unutmaz D，Littman D R.The differentiation of human T（H）－17 cells requires transforming growth factor－beta and induction of the nuclear receptor RORgammat［J］.Nat Immunol，2008，9（6）:641－649.

［18］ Michel M L，Mendes－da－Cruz D，Keller A C，et al.Critical role of ROR－gammat in a new thymic pathway leading to IL－17－producing invariant NKT cell differentiation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（50）:19845－19850.

［19］ Bettelli E，Carrier Y，Gao W，et al.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells［J］.Nature，2006，441（7090）:235－238.

［20］ Ayyoub M，Deknuydt F，Raimbaud I，et al.Human memory FOXP3＋Tregs secrete IL－17 ex vivo and constitutively express the T（H）17 lineage－specific transcription factor ROR－gamma t［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（21）:8635－8640.

［21］ Voo K S，Wang Y H，Santori F R，et al.Identification of IL－17－producing FOXP3＋regulatory T cells in humans［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（12）:4793－4798.

［22］ 陳蓮一，謝林.Sertoli細(xì)胞對同種異體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞／輔助性T細(xì)胞17分化平衡的調(diào)節(jié)作用［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2014，43（6）:626－630，635.

［23］ Cerkovnik P，Novakovic B J，Stegel V，et al.Tumor vaccine composed of C－class Cp G oligodeoxynucleotides and irradiated tumor cells induces long－term antitumor immunity［J］.BMC Immunol，2010，11（13）:45－55.

（2014－12－17 收稿）

Effect of CpG ODN on the Differentiation of Treg／Th17 Cells

Li Jieqiong1，Ji Yuqiang2，Yang Wei1et al
1Department of Hepatobiliary Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，School of Medicine，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China
2Department of Cardiology，The First Hospital of Xi’an，Xi’an 710002，China

Objective To examine the effects of Cp G ODN on differentiation of Treg／Th17 cells in vitro.Methods Mouse spleen cells separated in vitro were cultured with anti－CD3 and anti－CD28 monoclonal antibody and TGF－β，IL－2 or TGF－β，IL－6，IL－23.After 24 h，CpG1982 or CpG1826 was added to the culture system.Treg／Th17 cells were detected by flow cytometry（FCM）after collecting spleen cells.The m RNA expression levels of Foxp3，RORγt，IL－10 and IL－17 were measured by real time PCR and the protein expression levels of Foxp3 and RORγt were measured by Western blotting.The levels of IL－10 and IL－17 in supernatant were measured by ELISA.Results The number of CD4＋Foxp3＋Treg cells increased significantly in the presence of TGF－βand IL－2（P＜0.05）.The mRNA and protein levels of Foxp3 and IL－10 in the cell culture supernatant were significantly increased（P＜0.05）.CD4＋Foxp3＋Treg cells were reduced significantly after adding CpG1826（P＜0.05）.The levels of Foxp3 and IL－10 significantly decreased（P＜0.05）.The number of Th17 cells was increased significantly in the presence of Cp G1826，or TGF－β，IL－6 and IL－23（P＜0.05）.The levels of RORγt and IL－10 in the cell culture supernatant were increased（P＜0.05）.There was a more significant stimulating effect of CpG1826 combined with TGF－β，IL－6 and IL－23 on Th17 cells（P＜0.05）.Conclusion Cp G1826 can regulate Treg／Th17 cells in vitro through inhibiting differentiation of Treg cells and stimulating differentiation of Th17 cells

CpG ODN； immunoloregulation； Treg； Th17

R392.1

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.003

＊國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81402039）；陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.2014JM4103）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（No.xjj2010010）

李潔瓊，女，1979年生，副主任護(hù)師，博士研究生，E－mail:39251157＠qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:guocheng1977＠aliyun.com.cn