張智星， 馮祥禮， 毛 靖△， 肖建中， 邱進俊， 劉承美

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院口腔醫(yī)學中心，武漢 430030

2湖北省中醫(yī)院口腔科，武漢 430061

3華中科技大學材料科學與工程學院，武漢 430079

4華中科技大學化學學院，武漢 430079

可注射骨修復材料的骨組織反應評價＊

張智星1， 馮祥禮2， 毛 靖1△， 肖建中3， 邱進俊4， 劉承美4

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院口腔醫(yī)學中心，武漢 430030

2湖北省中醫(yī)院口腔科，武漢 430061

3華中科技大學材料科學與工程學院，武漢 430079

4華中科技大學化學學院，武漢 430079

目的 研究自制的可注射骨修復材料植入兔股骨缺損區(qū)后的骨組織反應特點。方法 選用25只新西蘭大白兔，在其雙側股骨內髁制作標準骨缺損區(qū)模型，分別注射不飽和聚磷酸酯／β－磷酸三鈣復合物（UPPE／β－TCP）和添加1%四環(huán)素的UPPE／β－TCP復合物（UPPE／β－TCP／TTC），按2、4、8、12、24周的植入期分為5組，對骨組織樣本進行組織病理學和形態(tài)學觀察，并比較各期植入體的吸收率。結果 在各植入期內，UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC兩種復合物的骨組織反應基本一致。植入2周時，所有材料和周圍骨組織均未發(fā)生明顯的吸收或改建，植入體未引起周圍骨組織的炎性反應和壞死；4周時植入體與骨缺損區(qū)結合良好，無纖維結締組織囊形成，在材料發(fā)生吸收而改建的區(qū)域，可見成骨細胞、新生血管和活躍的新骨形成；8周時大部分植入體仍存在于骨缺損區(qū)內，部分植入體成為“獨島”被完全整合進入新生的骨組織中；12周時骨組織有廣泛的重建；24周時植入體主體部分消失，骨組織內的生長和改建更加活躍，新生骨和骨髓樣組織中可見大量材料碎片，并可見成骨樣細胞。2種復合物植入骨缺損區(qū)后的吸收率均隨植入時間的延長而逐漸增加，在8周以前其吸收率相似（P＞0.05），而12周時UPPE／β－TCP／TTC復合物組的吸收率高于UPPE／β－TCP復合物（P＜0.05），24周時2種復合物的吸收率均在60%以上。結論 可注射骨修復材料UPPE／β－TCP復合物在動物體內具有良好的骨組織生物相容性、生物可降解性和體內骨引導性，可作為修復骨缺損的新型復合材料。

β－磷酸三鈣； 不飽和聚磷酸酯； 骨缺損； 骨修復； 吸收率

引導骨組織再生的經典方法是使用骨移植物修復骨缺損。目前，自體骨的成骨性和再生能力仍被認為是骨移植材料的金標準，但取骨時的創(chuàng)傷及自體骨移植后可能發(fā)生的吸收等缺陷限制了其在引導骨組織再生治療中的應用。使用異體骨移植也是修復骨缺損的一種常用方法，但實際的骨再生效果在研究中存在較大的爭議［1］，因此，組織工程材料仍是目前引導骨組織再生的研究熱點，其基本原理是將可生物降解的聚合物支架充填入骨缺損區(qū)，作為細胞粘附和增生、分化的臨時居所，緩慢降解后即可為新生的骨組織所替代［2］。本課題組已自行研制成功用于骨修復的新型控釋性可生物降解聚合物材料——不飽和聚磷酸酯（unsaturated polyphosphoester，UPPE），且前期已對UPPE聚合物及不飽和聚磷酸酯／β－磷酸三鈣復合物（UPPE／β－TCP）的理化性能、體外可降解性和體外細胞毒性等方面進行了檢測，證明其具有良好的生物安全性、生物相容性、藥物控釋性、可注射性和可降解性［36］，有望用作引導骨組織再生工程材料。本研究旨在評價這種新型可注射骨修復材料——UPPE／β－TCP復合物——植入兔體內的骨組織反應，以明確材料處于體內動態(tài)環(huán)境時的生物學變化和行為，評價其在動物體內的生物學相容性、生物可降解性和生物學有效性，為進一步深入研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 可注射骨組織修復材料的制備方法

1.1.1 UPPE／β－TCP復合物的制備 UPPE和β－TCP顆粒（100目）均由華中科技大學合成。將1.0 g UPPE完全溶解在0.48 g交聯(lián)劑N－乙烯基吡咯烷酮（N－vinyl pyrrolidone，NVP）中，然后混入0.018 g促進劑N，N－二甲基苯胺，接著加入2.5 g氯化鈉和1.0 gβ－TCP攪拌均勻形成糊劑；另取0.22 g NVP加入0.006 g過氧化苯甲酰引發(fā)劑形成溶解液。上述各制劑組分均經環(huán)氧乙烷消毒，使用前將2份試樣放入無菌容器中混合，攪拌均勻后，迅速用無菌注射器注入已制備好的標準骨質缺損模型中，待其在常溫下發(fā)生交聯(lián)反應10 min后，即形成交聯(lián)的UPPE／β－TCP復合物骨植入體。

1.1.2 含1%四環(huán)素（tetracycline，TTC）的UPPE／β－TCP復合物的制備 TTC為分析純，購自Sigma公司（St.Louis，MO，USA）。同法制備UPPE／β－TCP糊劑，使用時按重量比在糊劑中添加1%的TTC，迅速用無菌注射器注入已制備好的標準骨質缺損模型中，待其在常溫下發(fā)生交聯(lián)反應10 min后，即可形成含1%TTC的UPPE／β－TCP交聯(lián)復合物（UPPE／β－TCP／TTC復合物）植入體。

1.2 實驗動物分組及處理方法

本動物實驗由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院實驗動物研究中心批準，嚴格遵循“中華人民共和國實驗動物管理條例”中的規(guī)定對實驗動物進行飼養(yǎng)、管理和使用。

選擇25只骨骼發(fā)育成熟的4～5月齡雄性新西蘭大白兔，體重約為3.5 kg，將其分別單獨飼養(yǎng)在不銹鋼籠中，自由進食和飲水，要求每只動物在實驗前在本實驗動物中心有至少7 d的飼養(yǎng)期，以適應新環(huán)境。將所有大白兔按2、4、8、12、24周的植入期分為5組，每組5只，選擇股骨內側髁，左右隨機選擇注射UPPE／β－TCP復合物和UPPE／β－TCP／TTC復合物，共在骨組織中注射50個復合物樣本，為預防術后感染，每只均在術前和術后24 h內肌肉注射20萬單位的青霉素。

實驗動物手術方法按體重0.1 m L／kg的劑量用0.5%戊巴比妥鈉行耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定，取股骨下端的內側作為術區(qū)。備皮后碘伏消毒，在股骨遠中內側作2～3 cm長的切口，縱向切開膝關節(jié)內側的皮膚、皮下組織，分離骨膜，暴露股骨內側髁，在生理鹽水持續(xù)冷卻的條件下用牙科種植機以不超過450 r／min的轉速由內向外在內側髁制備約2 mm的洞型，再用直徑逐漸增大（2～4 mm）的骨鉆逐級將洞型擴大，最后形成直徑為4 mm、深為6 mm的圓柱形骨質缺損區(qū)，挖匙去盡骨質碎屑，生理鹽水沖洗，充分止血后在左右側缺損區(qū)隨機注射UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC兩種復合物糊劑，注射時應采取從底部向表面逐級后退的方式。等待約10 min，材料完全固化后去除多余的材料，無菌生理鹽水沖洗，分層嚴密縫合骨膜及軟組織（圖1）。

1.3 觀察分析指標

手術后需密切觀察動物的飲食、活動和傷口愈合狀況等。分別在植入術后2、4、8、12、24周將動物麻醉處死，完整切取復合物植入體與周圍的組織，大體觀察復合物與周圍組織的融合情況及骨組織形成情況后，再將樣本置于10%的緩沖型甲醛溶液中固定24 h，置于25%的EDTA溶液中脫鈣，50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐級梯度脫水，二甲苯浸泡脫脂，石蠟包埋，垂直于植入體長軸切取5μm左右的切片，每個樣本至少取3個切片，蘇木素－伊紅（HE）染色，光鏡下觀察骨缺損區(qū)材料及其周圍與宿主骨結合部的組織學反應和成骨情況，并使用圖像分析軟件（Image－Pro Plus Version 4.5，MediaCybernetics Inc.，MD，USA）對各時期植入骨缺損區(qū)材料的吸收率進行測量，測量方法如下:植入體吸收率＝（原植入體的橫截面積－剩余植入體的橫截面積）／原植入體的橫截面積×100%。

圖1 動物模型的建立Fig.1 Establishment of the animal model

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗結果以ˉx±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對結果進行統(tǒng)計學分析，應用單因素方差分析進行組間的均數比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察

所有實驗動物均在術后約1 h蘇醒，飲水及進食情況正常，行動正常，在股骨缺損植入區(qū)周圍未出現(xiàn)明顯不良反應，如材料暴露、皮膚潰瘍、術區(qū)感染化膿等，傷口愈合良好，無骨折發(fā)生及意外死亡情況。

在移植術后2、4、8、12、24周時分別取材，并用低速金剛砂鋸垂直于植入體長軸切開股骨缺損區(qū)，肉眼觀察骨質缺損區(qū)的愈合情況，結果顯示: UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC兩種復合體修復骨缺損的大體外觀表現(xiàn)基本一致，在各個植入期均未引起周圍組織的炎癥反應和壞死，圖2為UPPE／β－TCP復合物植入體樣本各期的大體外觀，可見植入2周后，植入體基本維持其原來的形狀，且與骨缺損區(qū)結合致密，在植入體與骨組織間無纖維囊形成；植入4周后，植入體表面均有骨組織生長，與材料結合較好，但植入體開始降解，外形變得不規(guī)則；植入8周后，骨質缺損區(qū)有塊狀骨組織形成；12周后，植入體與骨組織的界限已不甚明顯，新形成的骨組織切面呈黃白色，質地較硬；24周后，植入體主體已基本消失，新生骨質與周圍骨組織緊密結合，界限無法分辨。

圖2 股骨缺損區(qū)植入UPPE／β－TCP復合物后各期的大體外觀Fig.2 Cross－sectional photographs showing medial condyle of femur after implantation of UPPE／β－TCP composite at different time points

2.2 組織病理學觀察

在各個植入期內，2種復合物植入體的組織學反應基本相同，均可見骨組織與材料界面處無纖維組織囊插入，材料逐漸降解，骨缺損區(qū)內無炎性細胞存在。圖3為UPPE／β－TCP／TTC復合物植入體術后不同時間的組織病理學檢查:在2周時，材料和周圍的骨組織均未發(fā)生明顯的吸收或改建，植入體周圍的骨組織無炎性反應及壞死，骨組織與植入體之間未發(fā)生明顯的反應，材料與骨組織交界處的骨小梁與植入體結合緊密（圖3A）；植入4周后，由于降解而出現(xiàn)的植入體材料孔隙中及其與骨缺損區(qū)交界處開始有新骨形成，新生骨組織鈣化狀況良好，與材料結合良好，無纖維結締組織囊形成，在材料發(fā)生吸收而改建的區(qū)域，可見成骨細胞和活躍的新骨形成、新生血管（圖3B）；8周之后，大部分植入體仍存在于骨缺損區(qū)，而部分植入體成為“獨島”被完全整合進入新生的骨組織中，兩者交錯纏結在一起，“獨島”中可見成骨樣細胞（圖3C）；12周時骨組織有廣泛的重建，網狀新生骨開始充填骨缺損區(qū)，可見板層骨結構，并出現(xiàn)大量的新生血管為新骨供應營養(yǎng)（圖3D）；24周后，植入體主體部分消失，為新生骨或骨髓樣組織替代，新生骨組織結構變得致密（圖3E）。

圖3 UPPE／β－TCP／TTC復合物植入術后各期的組織病理切片圖（蘇木精－伊紅染色，×100）Fig.3 Histopathological images of UPPE／β－TCP／TTC composite after implantation at different time points（HE staining，×100）

2.3 復合物植入體的吸收率

圖4為UPPE／β－TCP復合物和UPPE／β－TCP／TTC復合物植入股骨缺損區(qū)后各時期的吸收率，可見兩組復合物的吸收率均隨植入時間的延長而逐漸增加，在8周以前其吸收率相近，組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而12周、24周時UPPE／β－TCP／TTC復合物組的吸收率高于UPPE／β－TCP復合物，其間的差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且24周時兩種復合物植入體的吸收率均在60%以上。

圖4 UPPE／β－TCP復合物和UPPE／β－TCP／TTC復合物植入骨缺損區(qū)后各時期的吸收率Fig.4 Resorption rate of UPPE／β－TCP composite and UPPE／β－TCP／TTC composite after implantation at different time points

3 討論

一種生物材料是否可用作骨替代物，在對骨替代物進行體外檢測合格后，一般還要進行動物實驗，以便從組織病理學、組織形態(tài)學等方面進行評價，獲得骨替代物的成骨性和骨整合性等各項特征，對材料的生物相容性進行完整、真實的評價［78］。骨移植物的作用是給骨缺損區(qū)提供支持、充填缺損區(qū)并促進骨的生物學修復。目前，許多材料均可引導骨組織的再生，雖然都能夠取得一定的效果，但仍有許多問題亟待解決，如材料植入體內后的機械穩(wěn)定性和生物相容性、材料在體內降解期間所造成的局部或全身炎癥反應、材料是否具有骨傳導或骨誘導等生物學活性、以及釋放抗生素以改善抗感染效果的能力等［2］。

TTC除具有眾所周知的抑菌活性外，還具有抗炎、抗膠原酶活性及阻止骨吸收等生物學特性［910］，添加TTC后的骨替代物可以在局部控釋TTC藥物以控制炎癥、防止微生物感染和改善骨修復效果。本課題組前期已對UPPE／β－TCP復合物的體外細胞毒性和成骨細胞的活性等進行了研究，結果顯示UPPE／β－TCP復合物的宏觀結構和機械性能符合作為骨替代物的要求，本研究則旨在評價這種新型控釋性可注射骨修復材料UPPE／β－TCP復合物植入實驗動物骨組織后的體內生物學相容性，以及添加TTC后對股骨缺損區(qū)修復的影響。動物模型的建立采用在兔股骨中形成直徑4 mm、深6 mm的缺損然后植入骨替代材料的方法，此方式被廣泛用于評價骨組織工程研究的骨組織形成情況［1112］。兩種復合物材料（UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC）均使用注射器從底部直接注射入骨缺損區(qū)內，這樣不但可防止產生氣泡，而且同時可使植入體與周圍骨組織緊密結合，防止植入體／骨組織界面處纖維結締組織的插入，促進骨組織的愈合。本實驗結果也證實了此注射方法充填骨缺損區(qū)的優(yōu)勢，即肉眼可見兩種復合物均成功地與動物模型中的骨缺損區(qū)發(fā)生直接接觸，并在一定的時期內維持其原來的形狀，作為充填物與骨缺損區(qū)形成骨整合，未發(fā)生組織排斥和明顯的移位現(xiàn)象，符合其他學者關于優(yōu)異復合材料骨組織反應的研究結果［13］。

同時，本研究的組織病理學和組織形態(tài)學結果證明:兩組復合體植入后均未引起骨缺損區(qū)的炎性反應，表明其具有良好的體內骨組織相容性。植入2周后，復合體均基本維持其原來的形狀，與骨缺損區(qū)結合致密，在植入體與骨組織間無纖維囊形成，說明復合物的固化未受骨髓腔中血管出血的影響；植入4周后復合體發(fā)生明顯的降解，新生骨組織在材料與骨缺損區(qū)交界處沉積，并向材料內部生長，證明材料具有較好的骨引導性，且隨著植入期的延長，材料的吸收率逐漸增加；12周后UPPE／β－TCP／TTC復合物組的吸收率高于UPPE／β－TCP復合物，表明UPPE／β－TCP／TTC復合物所釋放的藥物加速了骨組織的重建和材料的降解，但在長達24周的體內生物降解過程中，復合物植入體周圍的骨組織中均未發(fā)生明顯的炎性反應，表明其降解產物也具有較好的生物相容性。因此，可注射骨修復材料UPPE／β－TCP復合物在動物體內具有良好的骨組織生物相容性、生物可降解性和體內骨引導性，有望作為修復骨缺損的新型復合材料。

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（2015－01－26 收稿）

In Vivo Bone Tissue Response to an Injectable Bone Substitute

Zhang Zhixing1，F(xiàn)eng Xiangli2，Mao Jing1△et al
1Department of Stomatology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China
2Department of Stomatology，Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China

Objective To assess in vivo bone tissue response to an injectable bone substitute after implantation using a rabbit model.Methods Twenty－five male New Zealand white rabbits were used as experimental animals.The unsaturated polyphosphoester／β－tricalcium phosphate composite（UPPE／β－TCP）and UPPE／β－TCP composite containing 1%tetracycline（UPPE／β－TCP／TTC）were injected in circular defects as created in the femoral condyles of rabbits and were left in place for 2，4，8，12 and 24 weeks.The specimens were evaluated morphologically（histology and histomorphometry）and absorption rate of implant at different time points was compared.Single factor analysis of variance and Tukey’s multiple comparison tests were used to determine statistical significance of results.Results At different implantation stages，gross examination of retrieved implant／bone composite samples indicated that the UPPE／β－TCP composite and UPPE／β－TCP／TTC composite did not evoke inflammatory response，necrosis or fibrous encapsulation in surrounding bony tissues.Histological examination revealed excellent composite／host bone bonding.At 4 weeks，resorption induced voids between terminals of bone defects and implants were largely filled with new bone.Composite resorption，new blood vessels，osteocytes，osteons and osteoblast－like cells lining up with active new bone were observed at remodeling sites.At 12 weeks，a new bone network was developed within femoral defect，while composite became islands incorporated in the new bone.At 24 weeks，bone ingrowth and remodeling activities became so extensive that the interface between residual cement and new bone became less identifiable.In general，the resorption ratio values increased with implantation time.Conclusion These results showed that UPPE／β－TCP composite holds promise for use as a synthetic biodegradable scaffolds for tissue engineering.

β－tricalcium phosphate； unsaturated polyphosphoester； bone defects； bone repair； resorption ratio

R336

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.010

＊國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）資助項目（No.2006AA03Z0443）

張智星，男，1972年生，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，E－mail:262856134＠qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:maojing＠hust.edu.cn