陳志雄， 黃 瓊， 陶 琳， 馬紅梅

武漢大學人民醫(yī)院1老年病科2眼科，武漢 430060

重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP抗腫瘤的實驗研究＊

陳志雄1， 黃 瓊2， 陶 琳1， 馬紅梅1

武漢大學人民醫(yī)院1老年病科2眼科，武漢 430060

目的 探討Ad－PTEN－EGFP對裸鼠肺癌種植瘤的體內殺傷作用及機制。方法 構建裸鼠肺癌種植瘤模型，將Ad－PTEN－EGFP注射裸鼠體內，觀察腫瘤體積變化，進行腫瘤組織的常規(guī)病理檢查、原位凋亡染色及免疫組化染色，檢查治療后各組裸鼠腫瘤組織中有關基因的表達情況。結果 與對照組相比，治療組腫瘤組織生長速度明顯減慢，腫瘤組織體積較對照組明顯縮?。≒＜0.05），且隨腺病毒治療劑量的升高而更為明顯；原位凋亡染色法檢測腫瘤組織，發(fā)現治療組凋亡細胞明顯增多（P＜0.05），且隨腺病毒治療劑量的升高而更為明顯（P＜0.05）。此外還發(fā)現，治療后腫瘤組織或血清中的Survivin、NF－κB和PI3K表達水平明顯下降（均P＜0.05），呈負相關性，且隨腺病毒治療劑量的升高而更為明顯（P＜0.05）。結論 Ad－PTEN－EGFP能明顯抑制腫瘤組織的生長，其作用機制與促進腫瘤細胞凋亡，調節(jié)相關基因表達水平有一定聯系。

肺癌； 基因治療； PTEN基因； 腺病毒

PTEN基因是一種重要的腫瘤抑制基因，以前又被研究人員稱為MMAC1／TEP1，經過多年研究發(fā)現，該基因位于染色體10q23處。在這個基因組區(qū)域中，雜合性缺失現象常常出現在許多腫瘤中［1］。在患有常染色體顯性相關疾病的患者中，如Castleman?。–D）、Lhermitte－Duclos病（LDD）等，目前已經在80%以上這類疾病患者基因組中檢測到了PTEN基因突變的現象［2］。研究人員發(fā)現，在PTEN基因已經突變的雜合型小鼠中，高度不典型增生這種特殊的現象常常出現，而出現這種特殊現象的小鼠中，不同組織起源腫瘤的發(fā)生頻率也比較高。上述研究結果證實:在腫瘤抑制過程中，PTEN基因起著重要的作用［35］。通過前期實驗，我們成功構建了含PTEN抑癌基因的重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP，并通過體外實驗，將重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP轉染肺癌A549細胞。因此，本實驗擬構建動物模型，從體內方面探討重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP治療肺癌的機制，為進一步將PTEN基因應用于臨床實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 人肺腺癌細胞株A549，購自武漢大學醫(yī)學院腫瘤研究所。

1.1.2 重組腺病毒 本課題組前期制備及保存的Ad－PTEN－EGFP［6］；Ad－EGFP由本實驗室保存。

1.2 試劑

RPMI1640和小牛血清為Gibco公司產品；TUNEL試劑盒購自武漢博士德生物技術公司；抗Survivin、NF－κB、PI3 K和PTEN抗體購自深圳中杉生物公司，Caspase－3、Caspase－9、TGF－β1和PTEN ELISA檢測試劑盒均購自深圳晶美公司。

1.3 實驗動物

Balb／c裸鼠20只，雄性，4周齡，體重15～20 g，購自眾磊（北京）生物科技發(fā)展有限公司，飼養(yǎng)于同濟醫(yī)學院實驗動物學部（SPF級），飼養(yǎng)6～7 d后開始實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細胞為武漢大學醫(yī)學院腫瘤研究所保存細胞。在5%CO2，37℃條件下的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI1640。

1.4.2 肺癌皮下種植瘤裸鼠動物模型的制作 將A549細胞培養(yǎng)至對數生長期，用0.25%胰酶、EDTA消化貼壁的細胞，離心收集細胞，用1%的PBS洗滌3次，用PBS將細胞密度調整為2×107細胞／m L。在裸鼠右側近腋下腹部皮下注射100μL的細胞溶液（2×106個細胞）。觀察和檢測種植瘤的生長速度，如果有腫塊出現，則癌細胞種植成功。

1.4.3 動物分組及治療方法 根據腫瘤體積及瘤重各組匹配的原則，將20只裸鼠分為4組，使各組之間無明顯差異性（P＞0.05）。重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP高劑量治療組（5只）:瘤體內注射重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP病毒純化液，隔日1次，連續(xù)皮下注射5次，注射量為1×109pfu／50μL。重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP低劑量治療組（5只）:瘤體內注射重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP病毒純化液，隔日1次，連續(xù)皮下注射5次，注射量為5×108pfu／50μL。Ad－EGFP組（5只）:瘤體內注射腺病毒Ad－LacZ病毒純化液，隔日1次，連續(xù)皮下注射5次，注射量為5×108pfu／50μL。PBS組（5只）:瘤體內注射PBS，隔日1次，連續(xù)皮下注射5次，注射量為50μL。

1.4.4 療效觀察 分別在治療第0，2，4，7，9，11，13天，測量各組動物腫瘤組織的最大徑和最小徑，計算腫瘤體積:腫瘤體積（mm3）＝πab2／6（a:最大徑，b:最小徑）。重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP注射治療結束后，比較治療組與對照組腫瘤的體積及重量，并行病理學檢查。

1.4.5 組織標本取材 在重組腺病毒治療結束后的第3天處死裸鼠，取血留血清，—70℃冰箱貯存，無菌條件下取出腫瘤，用濃度為4%的多聚甲醛溶液將腫瘤組織固定，并進行石蠟切片及蘇木精－伊紅（HE）染色和免疫組化染色，觀察免疫組化結果和檢測各項指標。

1.5 病理檢查

1.5.1 原位凋亡染色（TUNEL） 實驗方法按試劑盒說明書操作，在顯微鏡下觀察切片染色情況，隨機選取每張切片中5個高倍視野觀察并計數100個細胞及陽性細胞，計數陽性細胞占總細胞數的百分比。

1.5.2 免疫組化染色檢測Survivin、NF－κB、PI3K的表達 主要步驟如下:①組織切片按乙醇濃度梯度常規(guī)脫蠟至水。②用新鮮蒸餾水與雙氧水配制成3%H2O2，室溫條件下放置10 min，用來滅活組織中的內源性酶，然后用蒸餾水清洗3次。③熱修復抗原，將組織切片浸泡到0.02 mol／L濃度的PBS中（p H 7.2），電爐加熱至沸騰后斷電，間隔時間為10 min，冷卻后用0.1 mol／L濃度的PBS洗滌2次。④用正常山羊血清封閉液封閉組織切片，室溫條件下放置30 min，去除殘留的多余液體。⑤將適當稀釋的一抗（1∶150）滴加在切片上，要覆蓋住整個切片，4℃條件下過夜孵育，0.1 mol／L濃度的PBS清洗3次，2 min／次。⑥將生物素化二抗滴加在切片上，覆蓋住整個切片，37℃條件下孵育30 min，0.1 mol／L濃度的PBS清洗3次，3 min／次。⑦滴加幾滴SABC試劑，37℃條件下孵育30 min，0.1 mol／L濃度的PBS清洗4次，5 min／次。⑧DAB顯色，在室溫條件下和顯微鏡觀察的條件下控制DAB顯色的時間，出現陽性反應可用蒸餾水洗滌以終止DAB顯色反應。⑨用蘇木精復染。⑩封片。

每次實驗中均設空白對照（磷酸鹽緩沖液）和陰性對照（正常兔血清取代一抗）。定量分析采用HPIAS－1000型高清晰度彩色病理圖文報告分析系統，在普通顯微鏡下，計算整個腫瘤組織中，陽性面積占總面積的百分比（%），每張切片均隨機選取5個視野，求平均值。

1.6 統計學處理

采用SPSS 13.0統計分析軟件進行處理，計量資料組間均數比較采用t檢驗，計數資料組間比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 構建人肺腺癌動物模型

注射肺癌細胞1周左右可見裸鼠皮下注射部位出現結節(jié)狀組織，隨時間延長，該組織可繼續(xù)生長，有時還可見有增大的腫瘤瘤體破潰和出血。

2.2 重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP腫瘤內注射對肺癌裸鼠皮下種植瘤的抑瘤效果

皮下接種Balb／c裸鼠肺腺癌A549細胞，大概7 d后，肉眼可發(fā)現有明顯的皮下腫瘤形成。經重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP注射后，裸鼠的腫瘤組織體積增長速度明顯減慢，而其他兩個對照組裸鼠腫瘤組織生長仍然較快。1周后我們可以發(fā)現Ad－PTEN－EGFP治療組的腫瘤組織較其他對照組均明顯縮?。≒＜0.01），且第11天時高劑量治療組與低劑量治療組比較，腫瘤體積也明顯縮小（P＜0.05），Ad－EGFP組腫瘤體積增長較PBS組稍緩，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組腫瘤體積變化情況及比較（ˉx±s，mm3）Table 1 Comparison of tumor volume in different groups and different time points（ˉx±s，mm3）

重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP治療結束后，將各組裸鼠種植瘤稱重，Ad－PTEN－EGFP高劑量治療組為（0.38±0.10）g；Ad－PTEN－EGFP低劑量治療組為（0.63±0.16）g；Ad－EGFP組為（1.48± 0.32）g；PBS組為（1.54±0.37）g。高劑量和低劑量Ad－PTEN－EGFP治療組腫瘤重量明顯較其余兩組小（均P＜0.01），且高劑量治療組與低劑量治療組比較，腫瘤重量也明顯減少（P＜0.05）。

2.3 各組腫瘤組織蘇木精－伊紅染色

在Ad－EGFP組和PBS組中，蘇木精－伊紅染色可見裸鼠腫瘤細胞核大，核仁清楚，不規(guī)則的分裂象，纖維間隔可在腫瘤組織內發(fā)現；而高劑量和低劑量治療組中，大量的腫瘤組織壞死可在腫瘤組織中發(fā)現，纖維組織代替壞死的腫瘤細胞。見圖1。

圖1 各組腫瘤組織病理切片圖（蘇木精－伊紅染色，×400）Fig.1 Pathological section of tumor tissues（HE Staining，×400）

2.4 重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP治療對腫瘤細胞凋亡的影響

經TUNEL染色檢測發(fā)現，重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP高劑量治療組凋亡率為（31.4± 4.5）%，Ad－PTEN－EGFP低劑量治療組凋亡率為（20.8±4.2）%，兩個治療組均明顯高于PBS組（4.4±1.7）%、Ad－EGFP組（5.8±1.8）%（P＜0.01），且高劑量治療組與低劑量組比較，凋亡率也明顯增高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組裸鼠腫瘤TUNEL法檢測凋亡（×400）Fig.2 Detection of apoptosis of tumor cells in nude mice by TUNEL method（×400）

2.5 PTEN對裸鼠腫瘤組織中Survivin、NF－κB、PI3K表達的影響

檢測PTEN基因表達是否影響Survivin、NF－κB、PI3K在腫瘤組織中的表達，以及對上述指標的表達是否具有相關性。結果發(fā)現，高劑量和低劑量治療組PTEN基因表達明顯升高（均P＜0.01），腫瘤組織中Survivin、NF－κB、PI3 K表達明顯下降（均P＜0.01），且高劑量治療組各指標均明顯低于低劑量治療組（均P＜0.05）。結果發(fā)現，PTEN與Survivin、NF－κB、PI3K表達呈負相關性（均P＜0.05），見表2，圖3～6。

表2 重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP對裸鼠腫瘤組織Survivin、NF－κB、PI3K表達的影響（%，ˉx±s）Table 2 The influence of recombinant adenovirus Ad－PTEN－EGFP on expression of Survivin，NF－κB and PI3K in tumor tissues of nude mice（%，ˉx±s）

圖3 各組裸鼠腫瘤SP法檢測PTEN（SP，×400）Fig.3 Detection of PTEN in tumor tissues of nude mice by SP method（SP staining，×400）

圖4 各組裸鼠腫瘤SP法檢測Survivin（SP，×400）Fig.4 Detection of survivin in tumor tissues of nude mice by SP method（SP staining，×400）

圖5 各組裸鼠腫瘤SP法檢測NF－κB（SP，×400）Fig.5 Detection of NF－κB in tumor tissues of nude mice by SP method（SP staining，×400）

圖6 各組裸鼠腫瘤SP法檢測PI3K（SP，×400）Fig.6 Detection of PI3K in tumor tissues of nude mice by SP method（SP staining，×400）

3 討論

肺癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，在世界范圍內肺癌死亡率呈上升趨勢。如何建立可靠而且穩(wěn)定的肺腺癌動物模型，這是進行體內試驗及開展新療法的基礎。通過參考以往的國內外研究，本實驗采用A549肺腺癌細胞注射裸鼠建立肺腺癌動物模型。

在過去十年中，人們已經研究了大量的有關細胞凋亡作用機制，及其在腫瘤發(fā)生中的作用。通過對細胞凋亡的作用機制，腫瘤細胞逃避細胞凋亡現象，以及腫瘤細胞抗藥性機制的大量研究，促進了腫瘤靶向治療的深入發(fā)展。通過TUNEL染色，本研究證實:與其它兩組比較，含PTEN基因的重組腺病毒治療組中，腫瘤組織的凋亡細胞呈明顯增加（P＜0.01）；且與低劑量組比較，高劑量組腫瘤組織的凋亡細胞也明顯增加（P＜0.05）。

Survivin是目前科研人員能夠克隆出的分子量最小的IAP家族成員，與凋亡抑制因子Bcl－2蛋白的組織結構不同，它僅僅由1個阻斷細胞凋亡的分子組成，但是它抑制細胞凋亡的生理作用卻大大超過Bcl－2家族的作用［79］。Survivin抗凋亡作用已被大量的研究結果所證實，它不僅通過阻斷線粒體細胞色素C在體內的釋放，還與下游凋亡效應因子Caspase－3和Caspase－7相結合，進而對其活性產生直接的抑制作用，而且它還能通過與紡錘體纖維之間的相互結合，起到間接抑制Caspase對紡錘體的水解作用，這樣就有利于保護有絲分裂細胞器的完整性，從而抑制細胞發(fā)生凋亡現象［1012］。PTEN則是一種重要的抑癌基因，可通過PI3K／Akt途徑將Survivin的表達水平上調而導致它的失活，使它能夠發(fā)揮抑制腫瘤組織生長和血管內皮細胞發(fā)生凋亡的作用，促進腫瘤細胞大量增殖，血管快速生長和保持穩(wěn)定狀態(tài)，這樣更有利于腫瘤組織的生長和侵襲作用。PTEN基因的失活和Survivin基因的過表達都是肺癌發(fā)生發(fā)展和發(fā)生遠處轉移的關鍵之處，與肺癌的不良生物學行為和不良預后有著密切的聯系。本研究中，Survivin與PTEN表達呈顯著負相關（P＜0.05），此結果表明Survivin和PTEN在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中均起著重要的作用。

核轉錄因子NF－κB是科研人員在漿細胞和成熟B細胞中發(fā)現的一種蛋白，這種蛋白能與免疫球蛋白κ輕鏈內含有增強子的特異性序列相結合，所以被人們命名為κB［13］。它在真核生物中廣泛存在，屬于一個多肽亞單位組成的蛋白家族，目前相關研究結果認為，它與機體免疫過程，腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展，細胞發(fā)生凋亡現象以及人類的胚胎發(fā)育等大多數事件有著十分密切的聯系。本研究采用免疫組織化學方法，發(fā)現腫瘤組織細胞質與胞核中NF－κB的蛋白表達均為陽性，此結果與國內外報道一致［1416］，其原因可能是細胞受到各種因素的刺激作用，誘導了NF－κB在細胞內的活化，NF－κB進入細胞核以后，與細胞核內特定的DNA片段相互結合。本實驗研究結果顯示，NF－κB與PTEN之間呈負相關關系，提示二者可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中有一定的作用。

PI3K則是許多人類生命活動中關鍵的信號分子，PI3K介導的信號轉導通路調節(jié)了細胞的分裂、分化、凋亡等各種生理活動。PI3K是一種胞內磷脂酰激酶，被刺激活化以后，可產生位于細胞質膜上的第二信使PI3，PI3與Akt相互結合以后可以促進其發(fā)生激活，從而引起腫瘤細胞的大量增生［1718］。另外，Bertram等［19］研究也證實，PI3 K還可能通過抑制Fas的凋亡過程而抵抗細胞的凋亡過程。人體大部分腫瘤組織內都缺乏PTEN基因的表達。而PTEN可以使PI3K的脂類產物PI－3，4－P2、PI－3，4，5－P3的3位脫磷酸下調，通過PI3 K－PKB通路而對細胞生長與存活現象進行控制［2021］。在本研究中PI3K和PTEN呈負相關關系，此結果提示PTEN基因表達的缺失促進了PI3 K的過表達，從而引起PI3K活性的釋放，進而激活了下游的Akt，最終刺激細胞的生長發(fā)育和生存信號在體內的傳遞過程。Lee［22］研究認為對PI3K途徑進行有效阻礙可以特異性地抑制NSCLC細胞的大量增殖。

往腫瘤內注射重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP，可以使裸鼠皮下移植瘤的生長速度（體積、重量）明顯減慢，本研究發(fā)現，PTEN基因表達上升可以使腫瘤組織或血清的Survivin、NF－κB、PI3K表達明顯下調（均P＜0.01），呈負相關性（均P＜0.05），提示本實驗構建的含PTEN基因的重組腺病毒Ad－PTEN－EGFP對肺癌具有潛在的治療價值，為進一步的研究和應用奠定了良好的基礎。

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（2014－09－23 收稿）

Anti－tumor Effect of Recombinant Adenovirus Ad－PTEN－EGFP

Chen Zhixiong1，Huang Qiong2，Tao Lin1et al
1Department of Geriatrics，2Department of Ophthalmology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China

Objective To determine the efficacy and mechanism of Ad－PTEN－EGFP as therapeutic protocol for lung cancer in vivo in nude mice.Methods The model of lung implantation tumor in nude mice was established.The tumor volume changes were observed after Ad－PTEN－EGFP was injected to the nude mice，then the routine pathological examination，situ apoptosis staining and immunohistochemical staining of tumor tissue were performed.The levels of genes in tumor tissues of nude mice were determined after treatment.Results As compared with the control group，the growth rate of tumor and tumor size in treatment group was significantly decreased（P＜0.05）in a dose－dependent manner.The apoptotic cells in the treatment group were significantly increased by situ apoptosis staining of tumor tissues（P＜0.05）in a dose－dependent manner.In addition，the levels of Survivin，NF－κB and PI3 K were significantly decreased in tumor tissues and serum after treatment（P＜0.05）in a dosedependent manner.Conclusion Ad－PTEN－EGFP can significantly inhibit the growth of tumor tissues，which is related with promoting apoptosis of tumor cell gene and regulating relevant gene expression.

lung carcinoma； gene therapy； PTEN gene； adenovirus

R734.2

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.005

＊湖北省自然科學基金資助項目（No.2012FKB04450）

陳志雄，男，1970年生，副主任醫(yī)師，E－mail:191902185＠qq.com