李蓓蕾 張一秋 蔡 良 侯曉廣 石洪成 袁清習(xí) 陳紹亮△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 上海 200032;2中國科學(xué)院北京高能物理研究所 北京 100049)

同步輻射衍射增強(qiáng)成像(DEI)技術(shù)檢測離體人肝細(xì)胞癌(HCC)新生血管

李蓓蕾1張一秋1蔡 良1侯曉廣1石洪成1袁清習(xí)2陳紹亮1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 上海 200032;2中國科學(xué)院北京高能物理研究所 北京 100049)

腫瘤新生血管形成是實體腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中一個標(biāo)志性的事件[1]。評價腫瘤血管生成傳統(tǒng)的影像學(xué)方法包括血管成像技術(shù)CT血管造影(CT angiography,CTA)、磁共振血管造影(magnetic resonance angiography,MRA)、數(shù)字減影血管造影(digital subtract angiography,DSA)[2-3]等,然而其分辨率均不高。而同步輻射相位襯度成像(phase contrast image,PCI)結(jié)合高分辨率、高速成像的X射線CCD探測系統(tǒng)將微血管的分辨率大大提高[4-5]。目前主要的PCI技術(shù)有4種:干涉法(interferemetry)、衍射增強(qiáng)成像(diffraction enhanced imaging,DEI)、光柵相襯成像(grating based phase-contrast X-ray imaging,GB-PCI)和類同軸相襯成像(in-line phase contrast imaging,IL-PCI)。其中,DEI是利用分析晶體將X射線穿過樣品時產(chǎn)生的透射光、折射光和散射光彼此分開,從而獲得高襯度和高空間分辨率的圖像[6-8]。張汐等[9-10]使用DEI技術(shù)結(jié)合分辨率為10.9 μm的CCD探測器,在無對比劑情況下即可以顯示40 μm左右直徑的肝血管。本研究旨在利用DEI技術(shù)進(jìn)行高質(zhì)量、大視野的無對比劑的人肝細(xì)胞癌(hepatocelllular carcinoma,HCC)標(biāo)本新生血管成像。

標(biāo)本準(zhǔn)備 選用2011年6月至2011年7月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝腫瘤外科切除的HCC標(biāo)本3例。術(shù)前未注射任何對比劑,術(shù)后離體HCC標(biāo)本均常溫浸泡在4%甲醛溶液中固定12 h,取出后清水沖洗,分層脫水,切片,厚度3～4 mm,準(zhǔn)備DEI成像。成像前將標(biāo)本充分干燥。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院回顧性臨床和生物標(biāo)本倫理委員會批準(zhǔn)。

同步輻射成像 DEI試驗在北京同步輻射裝置(Beijing synchrotron radiation facility,BSRF)的4W1A束線X射線成像站。同步輻射X射線DEI成像裝置見圖1。儲存環(huán)電子束能量2.5 GeV,光子能量范圍為3～22 keV,光斑20 mm(H)×11 mm(V)。采用VHR-16 X射線CCD探測器(英國Photonic Science公司),像素尺寸7.4 μm×7.4 μm,像素陣列4 872×3 248,可根據(jù)樣品尺寸選取成像區(qū)域。本實驗選擇X射線能量為12 KeV,樣品探測器距離0.3 m,曝光時間的選取根據(jù)盡可能使圖像占據(jù)整個動態(tài)范圍而不致飽和的原則(峰位曝光時間較短)。實驗中,首先改變分析晶體與單色晶體之間的夾角,測量X射線反射率隨雙晶體夾角變化的函數(shù)曲線——搖擺曲線,然后將樣品放置于兩晶體之間的光路上,分別在搖擺曲線的峰位和反射率為50%的左、右半腰進(jìn)行成像。

圖1 BSRF 4W1A束線實驗線站DEI示意圖Fig 1 Schematic DEI experimental set-up at 4W1A beamline of BSRF

圖像處理分析 應(yīng)用Matlab 2012b軟件(美國MathWorks公司)獲得表觀吸收圖像和表觀折射圖像[11]。

使用Image Pro Plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)對最細(xì)血管直徑進(jìn)行測量。測量血管直徑時,垂直于血管長軸畫一直線,由灰階變化曲線的半高寬距離乘以最小分辨率計算(圖2)。由2位醫(yī)師分別進(jìn)行測量,將測得的最細(xì)血管的平均值作為最終結(jié)果。

圖2 血管直徑測量方法Fig 2 Method for calculating the vessel diameter

病理學(xué)分析 標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定、石蠟包埋、4 μm厚度連續(xù)切片,進(jìn)行HE常規(guī)染色。再用抗CD34抗體(C-18,美國Santa Cruz公司)進(jìn)行免疫組化分析,評價腫瘤新生血管[12]。

DEI結(jié)果 DEI成像結(jié)果中,我們可以看到腫瘤呈膨脹性生長,邊界清晰,腫瘤邊緣或周圍可見較粗大的血管受壓呈弧形移位;瘤內(nèi)微小血管較豐富,分布雜亂無章,形態(tài)無規(guī)則,測得的最細(xì)血管直徑約為25 μm。在搖擺曲線不同位置記錄的HCC圖像的差異顯著。在搖擺曲線峰位,即分析晶體和單色器晶體的衍射面完全平行時,采集的峰位圖像(圖3A)是濾除了散射吸收襯度和消光襯度的疊加像,圖像的清晰度比較好,能大致顯示腫瘤的輪廓及纖細(xì)的血管結(jié)構(gòu)。當(dāng)分析晶體的衍射面偏離搖擺曲線峰位,X射線穿過樣品時產(chǎn)生的微小折射將改變其經(jīng)分析晶體的強(qiáng)度,從而產(chǎn)生折射襯度。將分析晶體調(diào)節(jié)到搖擺曲線低角端和高角端最陡峭的點即左、右半腰處時,穿過樣品后偏離的X射線反射率為50%,可以獲得折射襯度與吸收襯度疊加的最大襯度的圖像(圖3C、D),顯示的血管邊緣以及血管與血管之間、癌與癌旁組織之間的位置關(guān)系要明顯優(yōu)于峰位圖像。此外,還可以顯示腫瘤內(nèi)部結(jié)節(jié)樣癌巢的結(jié)構(gòu)特征。將邊緣效應(yīng)相反的左、右半腰圖像疊加在一起,獲得含有吸收和消光信息的表觀吸收圖像(圖3B)。盡管圖像中可以看到腫瘤的邊界及瘤內(nèi)外的血管分布,但整個圖像的分辨率遠(yuǎn)不如峰位像。將左、右半腰圖像相減,獲得只含有折射信息的折射圖像(圖3E)。折射圖像和其他在搖擺曲線各個部位獲得的圖像相比,顯示了最高的襯度。圖像中,腫瘤邊緣和瘤內(nèi)外血管的更清晰、空間感更強(qiáng),呈現(xiàn)強(qiáng)烈的浮雕效果。

圖3 人HCC標(biāo)本中血管微觀形態(tài)的DEI成像結(jié)果Fig 3 DEI images of detailed appearances of blood vessels in local area of human hepatocelluar carcinoma

腫瘤標(biāo)本HE染色和CD34免疫組化光學(xué)顯微圖像見圖4。HE染色:癌組織與正常肝臟分界明顯,癌巢內(nèi)可見壞死灶,間質(zhì)中見彌漫分布粗細(xì)不均的新生血管,異常擴(kuò)張的大血管和裂隙狀的新生血管并存。CD34陽性染色主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜和胞質(zhì),腫瘤組織的微血管密度顯著高于癌旁組織。著色的腫瘤新生血管分布、形態(tài)和排列具有不均一性,形態(tài)失常,多為條索狀,或是管壁極薄的有腔血管,管腔粗細(xì)不均。

圖4 肝細(xì)胞癌標(biāo)本HE染色和CD34免疫組化光學(xué)顯微圖像 (×4)Fig 4 The optical microscope image of HE staining and CD34 immunoche mistry of HCC (×4)

討論 HCC是我國常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和病死率均位列惡性腫瘤第2位[13]。HCC是典型的多血管惡性腫瘤,腫瘤細(xì)胞的無節(jié)制性生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都是建立在腫瘤新生血管形成的基礎(chǔ)上的[1]。因此,早期顯示這些微血管的改變,對HCC的早期診斷和治療都具有重要臨床意義。

當(dāng)X射線穿過物體時,其相位因為樣品各部分的折射率不同而發(fā)生改變。PCI即是利用X射線在不同組織折射率的差異進(jìn)行成像,與X射線的吸收無關(guān),因此可以將傳統(tǒng)X射線吸收成像無法顯示的弱吸收組織(如血管)的分辨率大大提高至微米量級[6]。無對比劑血管PCI的原理是基于血液紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白含有的大量鐵原子,其比重和周圍的組織不同而可以導(dǎo)致相位對比的改變[9]。此外,隨著樣品在空氣中暴露的時間的延長,以及成像時X線和樣品相互作用的產(chǎn)熱作用,樣品脫水干燥,空氣取代了樣品血管中的水分,造成血管腔和管壁之間相位對比差異更加明顯,可見的血管數(shù)目、襯度和分辨率均增加[14]。

DEI對組織的邊界有很強(qiáng)分辨能力,當(dāng)分析晶體設(shè)置到搖擺曲線不同的位置時,對腫瘤、血管及其交界面的敏感性不同。將在搖擺曲線的左、右半腰處位置獲得的圖像相減得到的折射圖像的襯度加倍,使得血管突顯出來,是最適合進(jìn)行血管成像的[10-11]。本研究應(yīng)用DEI方法,選用分辨率為7.4 μm的CCD探測器,在沒有對比劑的情況下顯示了肝癌明顯的占位效應(yīng),周圍或邊緣血管受壓弧形移位,腫瘤內(nèi)部分布雜亂無章,形態(tài)無規(guī)則的微小血管,測量得到的腫瘤血管最小直徑約為25 μm,并顯示了癌巢的結(jié)節(jié)樣形態(tài)特征。這是臨床常用 CTA、MRA、DSA所不及的[2-3]。而且,隨著CCD探測器分辨率的提高,可以顯示更細(xì)直徑的腫瘤血管。但是值得注意的是,折射圖像需要在搖擺曲線的兩側(cè)半腰處各獲得一幅圖像后,再進(jìn)行圖像處理而獲得,因此必然要進(jìn)行2次曝光,這就造成了輻射劑量的加倍。此外,由于DEI圖像包含了傳統(tǒng)X射線成像可以顯示的和無法顯示的結(jié)構(gòu),圖像立體感強(qiáng),使得其與傳統(tǒng)影像學(xué)的成像結(jié)果不同,增加了DEI圖像解釋的難度[15]。例如,本研究獲得的圖像可以顯示很多數(shù)十微米的分布雜亂無章,形態(tài)無規(guī)則的樹枝狀結(jié)構(gòu)以及更加細(xì)小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),但是由于沒有使用高對比度血管對比劑,我們尚不能確定這些結(jié)構(gòu)都是血管,或是其中同時存在由于腫瘤壞死而出現(xiàn)的裂隙。兩者的鑒別有待于進(jìn)一步的研究?？傊?本研究通過同步輻射DEI技術(shù)進(jìn)行無對比劑條件下離體人HCC 標(biāo)本腫瘤新生血管顯像,獲得了較滿意的圖像。

同步輻射; 衍射增強(qiáng)成像(DEI); 肝細(xì)胞癌(HCC); 腫瘤新生血管

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國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2010CB834305)

R 812

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10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.024

2013-12-10;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:liangwen2@yeah.net