步 軍，孫建華，吳圣楣

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心新生兒科，上海200127；2.貝因美母乳研究中心，上海200127)

上海部分地區(qū)母乳核苷特征的初步研究

步 軍1，孫建華1，吳圣楣2

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心新生兒科，上海200127；2.貝因美母乳研究中心，上海200127)

目的 通過檢測上海部分地區(qū)婦女母乳中所含潛在可利用核苷的組成和含量，初步探究中國人群母乳核苷酸的特征。方法 從來自上海部分地區(qū)的56名健康哺乳期婦女志愿者中采集母乳樣本71份，其中初乳(分娩后3～7天采集)39份，成熟乳(分娩后1～2個月采集)32份。全部母乳樣本經過標準酶解處理，將所含的各種核苷酸物質分解為最終代謝產物核苷，再應用高效液相色譜儀逐一檢測每個母乳樣本中5種核苷濃度，最后相加計算得到母乳中總潛在可利用核苷的含量。結果 在全部母乳樣本中均檢測出胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷和腺嘌呤核苷，其濃度中位數(shù)分別為100mol/L、47mol/L、15mol/L、21mol/L；因為在不到半數(shù)的樣本(32/71)中檢測到低濃度的次黃嘌呤核苷，故將前4種母乳核苷成分之和作為總潛在可利用核苷，其濃度中位數(shù)為193mol/L。初乳和成熟乳中的尿嘧啶核苷和鳥嘌呤核苷濃度存在差異(Z值分別為-2.64、-2.13，均P<0.05)，初乳的總潛在可利用核苷含量高于成熟乳(Z=-2.09，P<0.05)。結論 上海地區(qū)母乳總潛在可利用核苷的平均水平和核苷組成與歐美以及亞洲其他地區(qū)人群中應用相同方法檢測所得結果類似，以胞嘧啶核苷濃度最高，而次黃嘌呤核苷僅在部分樣本中存在。

母乳；初乳；核苷酸；核苷

母乳是國際公認的喂養(yǎng)嬰兒“黃金標準”，嬰兒奶粉的配方通常要求盡可能接近母乳。由于反芻動物乳中的核苷酸含量明顯低于人乳，主要以牛乳為原料的嬰兒配方乳需要進行核苷酸強化，針對母乳核苷酸特征的研究是母乳營養(yǎng)研究的重要組成部分。自從上世紀60年代早期首次從人類母乳中分離出核苷酸后，有關母乳核苷酸特征的研究報道逐漸增多，但是由于檢測方法不同，導致不同的研究結果差異很大。1995年Leach等建立了一種新的方法，以“總潛在可利用核苷”(total potential available nucleoside，TPAN)來全面評價母乳中可被嬰兒消化吸收的核苷類物質，應用此方法檢測所得歐美人群母乳TPAN平均水平被作為核苷酸的推薦添加量，在部分嬰兒奶粉配方中應用至今。但是迄今為止，國內僅有部分研究報道了嬰幼兒配方食品如奶粉的核苷酸定量檢測方法[1-2]，尚無針對中國人群母乳核苷酸成份和含量特征的研究報道。本研究擬對上海部分地區(qū)哺乳婦女母乳中的TPAN水平進行檢測，并對母乳所含核苷的特點和影響因素進行初步了解，為進一步深入研究中國人群母乳核苷酸的總體特征打下基礎。

1 對象和方法

1.1 研究對象

自2013年2至10月在上海市浦東新區(qū)和崇明縣根據(jù)入選標準募集母乳捐贈者，經過知情同意后成為研究對象，按標準流程采集母乳，并填寫乳母基礎資料。研究方案經過上海兒童醫(yī)學中心倫理委員會審核批準。

入選標準：既往身體健康、營養(yǎng)良好的足月分娩產婦，年齡在22～40歲之間，無嚴重妊娠合并癥和感染性疾病史，完全或主要以母乳喂養(yǎng)為主，哺乳期間無發(fā)熱等疾病和用藥史。所生新生嬰兒體健，無特殊疾病史。

本研究共募集研究對象56人，采集合格母乳樣本71份，包括初乳39份，成熟乳32份；其中15人采集初乳和成熟乳各1份，41人僅采集初乳或成熟乳1份。提供母乳樣本的哺乳期婦女年齡為23～34歲，孕齡37+5～41+3周；順產36人，剖宮產20人，其中初產42人；上海籍27人，非上海籍29人；新生兒出生體重為2 755～4 050g，其中純母乳喂養(yǎng)45人，混合喂養(yǎng)11人。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集

分別于分娩后3～7天和/或1～2個月采集研究對象母乳樣本，采集過程由專人負責操作。本研究以分娩后3～7天采集樣本作為初乳組，分娩后1～2個月采集樣本作為成熟乳組。

采集和儲存方法如下：采集前檢查乳房和乳頭無異常破損后用溫水洗凈，輕擠乳房使乳汁自然流出，觀察顏色性狀無異常后改用吸乳器吸引，直至基本吸空單側乳房，在10分鐘內完成。檢查吸出乳汁無血液等異物混入后取10mL置于無菌冷凍離心管中，迅速放入-20℃以下冰箱暫存，之后轉送至-70℃深低溫冰箱長期儲存?zhèn)錂z。

1.2.2 樣本處理

本研究采用Leach等1995年報道的方法檢測單個母乳樣本中的核苷濃度。儲存母乳在檢測前置于室溫自然融化后加入1mol/L的NaOH水溶液，密封后振蕩，用鹽酸調節(jié)混合液pH至中性，用蒸餾水稀釋至100mL，以5-甲基胞苷(sigma，M-6254)為內標，取9μg加入5mL稀釋液中，分別加入磷酸二酯酶P1(sigma，N-8630)19單位、焦磷酸酶(sigma，P-7383)0.4單位、堿性磷酸酶(sigma，P-4252)16單位進行水解，振蕩反應48小時，將反應體系轉移至25mL容量瓶中，并加入12.5mL磷酸氫二鉀溶液，定容至25mL，以0.22μm濾器過濾備用。

1.2.3 固相抽提

將裝備有150μL Affi-Gel 601凝膠(Bio-Rad，153-6101)的固相萃取柱用磷酸氫二鉀緩沖液(pH10.5)平衡3次，取待檢母乳樣品1mL過柱，用1mol/L磷酸溶液進行洗脫，再用0.22μm過濾器過濾后進樣檢測。

1.2.4 樣本檢測

本研究采用Agilent HP1100高效液相色譜質譜儀(HPLC)進行檢測分析，選擇SB-C18 5μm 150×2.1mm色譜柱為固定相，以乙酸鉀和己烷磺酸鈉(20:1)以及乙腈分別為流動相，流速每分鐘0.2mL，柱溫24.5℃，核苷檢測波長設定為255nm。

1.2.5 數(shù)據(jù)計算

每種核苷的校準曲線通過計算系列稀釋濃度的5種核苷標準品(sigma：U-3750；C-9505；I-4125；G-6752；A-9251)和固定濃度的內標5-甲基胞苷面積比值構成。通過HPLC分析測得的各種核苷內標面積比值進行計算得到該種核苷濃度，母乳中的各種核苷濃度之和即為母乳TPAN含量。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有檢測母乳樣本中各種核苷含量數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布，故以中位數(shù)、四分位間距(M，Q75-25)表示；初乳和成熟乳核苷含量的差異采用兩組獨立樣本的Mann-Whitney檢驗進行比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 母乳核苷類物質水平

在所有的母乳標本中均檢測到除次黃嘌呤核苷(I)以外的4種核苷，而I僅在不到半數(shù)的樣本中(32/71)檢測到低濃度的含量，故未納入統(tǒng)計分析。母乳中的胞嘧啶核苷(C)濃度為(100，56) μmol/L；尿嘧啶核苷(U)濃度為(47，29)μ mol/L；鳥嘌呤核苷(G)濃度為(15，19) μmol/L；腺嘌呤核苷(A)濃度為(21，16) μmol/L；4種核苷濃度合計為TPAN濃度，經過計算得出TPAN濃度為(193，74) μmol/L。

2.2 初乳和成熟乳核苷類物質水平的比較

初乳組與成熟乳組4種核苷和TPAN的濃度進行比較，結果顯示兩組之間的TPAN濃度差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，初乳濃度高于成熟乳；4種核苷中U和G的濃度差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見附表。

附表 初乳和成熟乳核苷濃度的比較結果[(M，Q75-25)，mmol/L]

Table Comparison of nucleosides concentration between colostrum and mature [(M，Q75-25)，mmol/L]

3 討論

3.1 母乳核苷酸的生理作用和成分特征

核苷酸(Nucleotides)及其相關代謝產物在許多生物學過程中起著關鍵作用，體內核苷酸的來源既可為內源性生化途徑，也可為外源性營養(yǎng)途徑。由于外源性核苷類物質的供給對于維持人體部分組織器官的正常功能具有重要意義，因此核苷酸和其化合物被稱為“條件”必需或半必需營養(yǎng)素，尤其對處于快速生長發(fā)育階段的新生嬰兒顯得更為重要。較早的研究已發(fā)現(xiàn)核苷酸對于嬰兒整體免疫和腸道局部免疫、營養(yǎng)代謝、抗感染等多方面具有促進作用[3-4]，近年以來還發(fā)現(xiàn)其對于嬰兒睡眠節(jié)律的形成有一定作用[5]，但是未證實嬰兒期核苷類物質的攝入和兒童早期過敏性疾病相關[6]。在膳食中進行強化是補充嬰兒外源性核苷酸的主要途徑，但是添加的種類和適宜量尚不明確，而母乳中的核苷酸譜和含量則成為主要的參考依據(jù)。

上世紀80年代起國外開始應用高效液相色譜法(HPLC)研究母乳所含核苷酸和核苷類物質，由于母乳中核苷類物質來源的多樣性和不穩(wěn)定性，母乳核苷類物質來源于細胞內和細胞外，除了游離狀態(tài)的核苷酸和核苷以外，還包括了核苷酸加合物(如NAD和UDP糖)和主要為RNA的核苷酸聚合物等，同時母乳中所包含的生物活性酶對于核苷酸具有分解作用，因此不同的處理和評價方法導致不同的研究結果差異很大。雖然已有研究應用反向高效液相色譜-串聯(lián)質譜法和毛細管電泳法測定嬰兒配方乳中的核苷酸和核苷含量[7-8]，但是尚無應用于母乳研究的報道。Leach等的檢測方法模擬核苷酸在人體消化道的吸收過程，首先通過酶解法將母乳所含包括游離核苷、游離核苷酸、核苷酸加合物(如NAD和UDP糖)和主要為RNA的核苷酸聚合物在內的所有核苷物質分解為單體核苷，再通過HPLC技術測定各種核苷含量，并將其總和稱為TPAN。與以往的檢測指標相比，TPAN是一個反映母乳中總體核苷酸含量的綜合指標。Leach等檢測了采集自3個歐洲國家100個哺乳期婦女不同泌乳階段的母乳匯集而成的16個樣本池，其結果顯示所測母乳的TPAN含量為189±70mmol/L(范圍82～402μmol/L)，母乳中不同核苷含量差異大，平均含量以胞嘧啶核苷為最高，而次黃嘌呤核苷僅在一個樣本池中檢出。2003年Tressler等報道了亞洲婦女母乳中的TPAN含量，其從香港地區(qū)、菲律賓和新加坡的135名健康乳母中采集了160份4個不同階段的母乳，每10份樣本匯集成1個樣本池，應用Leach等的方法進行檢測，結果顯示TPAN的平均濃度為203μmol/L，其中初乳、過渡乳、早期和晚期成熟乳的平均濃度分別為171.9μmol/L、208.1μmol/L、221.6μmol/L和210.6μmol/L，不同國家之間無明顯差異。

以上研究均以多個樣本匯集成的樣本池為檢測對象，雖然也可反映母乳核苷酸的總體水平，為了更好地反映人乳核苷酸含量的個體差異，本研究采用了單個母乳樣本檢測法，結果顯示TPAN濃度中位數(shù)和上述研究結果相類似。在母乳核苷譜組成上也以C為主，I的濃度最低，在超過半數(shù)的樣本中未能檢出。但是各種核苷的濃度中位數(shù)和上述研究報道的平均濃度有所差異，C和U的濃度較高，而G和A的濃度較低，而且不同個體樣本之間各種核苷濃度的差異明顯。這與本研究測定個體母乳樣本，而上述研究測定多樣本混合的母乳池有關。在不同階段母乳TPAN水平的比較上，本研究結果和前述研究不同，初乳的TPAN水平高于成熟乳。為了易于操作，本研究將初乳的采集時間定為出生后3～7天，此與標準的初乳定義有所不同，多種因素均可能影響核苷的測定結果，因此需要擴大檢測樣本量以進一步評估。

3.2 母乳核苷酸研究的問題和展望

本研究首次報道了中國大陸地區(qū)母乳所含核苷的總體含量和成分特征，發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)母乳TPAN的平均水平和核苷組成與歐美以及亞洲其他地區(qū)人群中應用相同方法檢測所得結果相類似，以胞嘧啶核苷濃度最高，而次黃嘌呤核苷僅在部分樣本中存在。

本研究采用的方法除母乳樣本的酶解時間有所延長以外，基本與Leach等的方法相一致，因為條件所限，本研究未對該檢測方法進行方法學驗證。由于母乳核苷酸的多元性和影響因素較多，母乳樣本收集流程、樣本處理和檢測的標準化也可能影響最終結果，迄今為止尚未得到公認的母乳核苷酸評價標準和方法。除了Tressler等的研究基本采用Leach等的TPAN評價法外，Thorell等(1996年)的研究采用不同的方法也得到了相似的結論，但是Liao等[9]報道的臺灣地區(qū)母乳核苷酸特征卻存在較大的差異，因此需要通過進一步的方法學論證研究選擇最佳的檢測方法，并擴大檢測樣本的來源和數(shù)量以正確評估中國人群母乳核苷酸的含量和影響因素，為最終建立符合中國人群特點的嬰兒食品如配方奶粉的核苷酸添加標準奠定基礎。

[1]俞莎,陳曉春,潘洪峰,等.UPLC-MS/MS法測定嬰幼兒配方乳粉中五種核苷酸的研究[J].營養(yǎng)學報,2010,32(2):187-189.

[2]郝巖平,張秋梅,王象欣.嬰幼兒配方食品和乳粉中核苷酸的測定方法[J].中國乳品工業(yè),2011,39(4):48-52.

[3]Yau K I,Huang C B,Chen W,etal.Effect of nucleotides on diarrhea and immune responses in healthy term infants in Taiwan[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2003,36(1):37-43.

[4]Hawkes J S, Gibson R A, Roberton D,etal.Effect of dietary nucleotide supplementation on growth and immune function in term infants:A randomized controlled trial[J].Eur J Clin Nutr,2006,60(2):254-264.

[5]Arslanoglu S, Bertino E, Nicocia M,etal.WAPM Working Group on Nutrition:Potential chronobiotic role of human milk in sleep regulation[J].J Perinat Med,2011,40(1):1-8

[6]Timmermans M J, Daqnelie P C, Theunisz E H,etal.Dietary nucleotide and nucleoside exposure in infancy and atopic dermatitis, recurrent wheeze, and allergic sensitization[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2015,60(5):691-693.

[7]Gill B D, Indyk H E, Manley-Harris M.Analysis of nucleosides and nucleotides in infant formula by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Anal Bioanal Chem,2013,405(15):5311-5319.

[8]Rodriguez-Gonzalo E, Dominguez-Alvarez J, Mateos-Vivas M,etal.A validated method for the determination of nucleotides in infant formulas by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry[J].Electrophoresis,2014,35(11):1677-1684.

[9]Liao K Y, Wu T C, Huang C F,etal.Profile of nucleotides and nucleosides in Taiwanese human milk[J].Pediatr Neonatol,2011,52(2):93-97.

[專業(yè)責任編輯：古桂雄]

低出生體重和先兆子癇可能與家族史相關

低出生體重和先兆子癇與家族史有關，這是2015年2月在圣迭戈(加利福尼亞州)舉行的母胎醫(yī)學學會(懷孕會議)年會上展示的一項以色列研究成果。比爾謝瓦的索羅卡大學醫(yī)學中心的醫(yī)師對1991至2012年間在醫(yī)學中心出生的2 315位母親、女兒和孫子(女)的三元組數(shù)據(jù)進行了分析。分析結果表明，如果母親低出生體重，盡管調整了年齡和胎盤病理等因素之后，對于其后代低出生體重仍是一個重要的預測因子；對于先兆子癇也是同樣的結果，盡管調整了其他影響因素之后，這種情況也再次出現(xiàn)在后代中。研究報告作者Yehonatan Sherf表示：“母系家族有低出生體重或先兆子癇的孕婦應該被告知關于這些后果的情況，并對其進行嚴密監(jiān)控”，從而使這些并發(fā)癥在早期階段就可以被檢測到。

Primary study on characteristics of human breast milk nucleosides in some areas of Shanghai

BU Jun1, SUN Jian-hua1, WU Sheng-mei2

(1.DepartmentofNeonatology, 2.BeingmateBreastMilkResearchCenter,ShanghaiChildren’sMedicalCenterAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Objective To explore the characteristics of human breast milk nucleotides in Chinese population by measurement of total potential available nucleoside (TPAN) in breast milk of women in some areas of Shanghai. Methods Totally 71 milk samples were collected from 56 healthy lactating women volunteers in Shanghai, including 39 colostrum samples (3 to 7 days after birth) and 32 mature milk samples (1 to 2 months after birth). All samples were processed by standard methodology. Nucleotides were enzymatically hydrolyzed to their constituent nucleosides, and free and hydrolyzed nucleosides were then measured by HPLC to yield TPAN value. Results The medium values were 100mol/L for cytidine, 47mol/L for uridine, 15mol/L for guanosine, and 21mol/L for adenosine, and they were found in all of the samples. Less than half of milk samples (32/71) contained inosine with low concentration, and the accumulation of the above four nucleotides were considered as TPAN with medium value of 193mol/L. There were differences in the value of uridine and guanosine between colostrum and mature milk (Zvalue was -2.64 and -2.13, respectively, bothP<0.05), and the TPAN value of colostrum was higher than mature milk (Z=-2.09,P<0.05).Conclusion The average TPAN level and the composition of nucleosides of breast milk from lactating women in Shanghai are similar to these in population in European, American and other Asian measured by the same methods. Cytidine is the predominant nucleoside in human milk, and inosine is found only in some samples.

breast milk；colostrum；nucleotides；nucleoside

2015-01-28

步 軍(1969-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事新生兒臨床和營養(yǎng)的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.004

R174

A

1673-5293(2015)03-0409-03