員夢夢，李保印，劉會超，周秀梅

（河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

香薷葉表皮腺毛及其分泌黃酮類物質(zhì)的組織化學(xué)研究

員夢夢，李保印，劉會超，周秀梅＊

（河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

利用光學(xué)顯微技術(shù)和掃描電鏡技術(shù)，研究了香薷營養(yǎng)生長期和生殖生長期的枝條上部、中部、下部葉片的腺毛種類、分布及數(shù)量；采用組織化學(xué)染色和熒光顯微技術(shù)，觀察香薷腺毛分泌黃酮類物質(zhì)的過程，探討香薷葉表皮腺毛的泌香機理，為生產(chǎn)中確定提取香薷黃酮類物質(zhì)的最佳取材時期提供依據(jù)。結(jié)果表明：（1）香薷葉表皮有頭狀腺毛和盾狀腺毛，成熟的頭狀腺毛包括基細(xì)胞、柄細(xì)胞和頭部，頭部較小，呈半圓球型，直徑為（20±2）μm；發(fā)育近成熟的盾狀腺毛頭部較大，呈盾狀，直徑為（60±5）μm。（2）香薷葉片遠(yuǎn)軸面和近軸面均有腺毛的分布，遠(yuǎn)軸面分布較多，近軸面分布較少；盾狀腺毛主要分布在葉的遠(yuǎn)軸面，頭狀腺毛在葉的兩面均有分布；腺毛密度隨節(jié)位的降低而減少，節(jié)位相同時，營養(yǎng)生長期葉片上的腺毛密度（283.9個／mm2）高于生殖生長期（194.4個／mm2）。（3）香薷頭狀腺毛和盾狀腺毛均能分泌黃酮類物質(zhì)，且隨著腺毛的發(fā)育成熟，黃酮類物質(zhì)逐漸積累于腺毛的頭部。

香薷；腺毛；黃酮類物質(zhì)；掃描電鏡；組織化學(xué)

香薷［Elsholtzia ciliata（Thunb.）Hyland］是唇形科（Lamiacea）香薷屬（Elsholtzia）的一年生草本藥食兼用植物［1］，其莖、葉、花具絨毛，且具有濃郁的香味。除新疆、青海外幾產(chǎn)全國各地；全草入藥，治急性腸胃炎、腹痛吐瀉、夏秋陽暑、頭痛發(fā)熱、惡寒無汗、霍亂、水腫、口臭等癥［2］。在河南豫北太行山區(qū)，還被人民用于治療偏頭痛。

腺毛是植物葉片表皮上具有分泌功能的毛狀體［3］，是揮發(fā)油合成和分泌的主要場所。許多芳香植物正是因為其葉表皮具有分泌多種揮發(fā)性物質(zhì)的腺毛才具香味。唇形科中許多植物的葉表皮都具有腺毛。其主要作用在于分泌揮發(fā)油、保護(hù)幼嫩植物免受啃食及病毒和微生物的攻擊等［3］。香薷含有揮發(fā)油類（主要包括香薷酮和脫氧香薷酮等）、黃酮類化合物等成分［4］。黃酮類化合物具有抗炎、抗病毒、解熱、保肝、抗氧化、清自由基、抗腫瘤、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎免疫、抗衰老等功效［5］。芳香植物的殺菌抑菌、自我保護(hù)、凈化環(huán)境的功效與其分泌揮發(fā)油的成份和濃度有關(guān)，而揮發(fā)油的成份和濃度又與其表皮腺毛的種類、分布、密度、發(fā)育狀況等因素有著密切的關(guān)系。

目前，對葉表皮腺毛曾進(jìn)行過研究報道的唇形科植主要有：薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）［6－7］、水棘針（Amethystea caerulea）［8］、細(xì)葉益母草（Leonurus sibiricus）［9］、多裂葉荊芥（Schizonepeta multifida）［10］、紫蘇（Perilla frutescens）［11］、蘭花鼠尾草（Salvia farinacea）［12］、白花羅勒（Ocimum basilium）［13］、地椒（Thymus quinquecostatus）［14］、木香薷（Elsholtzia stauntonii）［15］等。研究內(nèi)容主要集中于腺毛結(jié)構(gòu)、類型、發(fā)育及分泌過程。但有關(guān)香薷葉表皮腺毛的研究報道極少，僅有胡鳳蓮［16］的報道中涉及到了香薷腺毛的類型和形態(tài)。這對于深入了解和深度開發(fā)利用香薷這一藥食兩用的芳香植物，顯然是很不夠的。為此，本試驗采用光學(xué)顯微技術(shù)和掃描電鏡技術(shù)研究了香薷營養(yǎng)生長期、生殖生長期枝條上部、中部、下部葉表皮腺毛的種類、分布與數(shù)量；采用徒手切片結(jié)合組織化學(xué)染色和熒光顯微技術(shù)，研究香薷葉表皮兩種腺毛的黃酮類物質(zhì)分泌過程，旨在豐富香薷葉表皮腺毛相關(guān)的基本理論知識，為進(jìn)一步研究香薷葉表皮腺毛的分泌過程提供參考，為香薷黃酮類物質(zhì)提取時取材時期的確定提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料為香薷葉片。分別于2012年6月22日、10月10日取河南科技學(xué)院（35.28°N，113.93° E）校園內(nèi)栽種的香薷植株營養(yǎng)生長期、生殖生長期的同一枝條上部（枝頂剛展開的嫩葉）、中部（上部取材處下數(shù)3節(jié)）、下部（中部取材處下數(shù)3節(jié)）的完整葉片。

1.2 試驗方法

1.2.1 香薷葉表皮腺毛的光學(xué)顯微觀察 在備用的每片香薷完整葉片5個位置處（圖版Ⅰ，1），分別取面積約25mm2的正方形小方塊10塊，浸泡在盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，制作徒手切片。切片選用土豆塊莖為夾持物，用雙面刀片切成薄片后在XSZ－4G生物顯微鏡10倍目鏡（WF10X－18mm）、10倍物鏡下觀察。用目鏡測微尺測量20個發(fā)育成熟腺毛的頭部直徑，分別記錄其格數(shù)。用公式“目鏡測微尺的格值＝兩重合線間臺式測微尺的小格數(shù)×10 μm／兩重合線間目鏡測微尺的小格數(shù)”換算，求其平均值，即為腺毛的頭部直徑（μm）。

1.2.2 香薷葉表皮腺毛的掃描電鏡觀察植物 用吸耳球清除備用的香薷葉片上的灰塵后，在葉片5個位置處（圖版Ⅰ，1）分別取10塊長×寬≈5mm× 5mm正方形小塊，并依順序粘在樣品臺的導(dǎo)電膠上，用Quanta 2000掃描電鏡對樣品的近軸面和遠(yuǎn)軸面及時快速地進(jìn)行觀察，每個樣點取3個清楚的視野拍照。根據(jù)電子照片統(tǒng)計并計算單位面積上的腺毛平均數(shù)量。圖1主脈上部和下部5個位置的正方形小塊分別用于測算葉片近軸面和遠(yuǎn)軸面的腺毛數(shù)量，近軸面和遠(yuǎn)軸面腺毛數(shù)量之和，即為香薷葉表皮腺毛數(shù)量。

1.2.3 香薷葉表皮腺毛的熒光顯微觀察 取1.2.1中制作完好的切片，置于載玻片上，滴加Neu’s（2－氨基乙基二苯基硼酸酯∶甲醇＝1∶99）試劑，蓋上蓋玻片（厚度0.17mm）后，用甘油／水（15∶85）封片。冷藏12～24h后備用。在Nikon80i多功能研究型正置顯微鏡下，在環(huán)境較暗的室內(nèi)，以藍(lán)光或紫外光為激發(fā)光源，觀察香薷葉片腺毛黃酮類物質(zhì)的分泌過程并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 香薷葉表皮腺毛的類型

基于對香薷不同發(fā)育時期、不同部位葉表皮的光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)香薷葉表皮有頭狀腺毛和盾狀腺毛兩種類型（圖版Ⅰ，2、3）。成熟頭狀腺毛包括基細(xì)胞、柄細(xì)胞和頭部，頭部呈半圓球型，頭部直徑為（20±2）μm。發(fā)育近成熟的盾狀腺毛頭部呈盾狀，頭部直徑為（60±5）μm。隨著腺毛的進(jìn)一步發(fā)育，腺毛進(jìn)入成熟期，頭部出現(xiàn)不同程度的凹陷，最后表皮破裂、衰亡。

2.2 香薷葉表皮腺毛的分布

光學(xué)顯微鏡下觀察到香薷葉片近軸面和遠(yuǎn)軸面均有腺毛分布（圖版Ⅰ，4）；掃描電鏡下，在同一葉片同一取樣位置處，香薷葉表皮腺毛在葉的近軸面分布較少（圖版Ⅰ，5），而在葉的遠(yuǎn)軸面分布較多（圖版Ⅰ，6）。盾狀腺毛主要分布在葉的遠(yuǎn)軸面，而頭狀腺毛在葉的兩面均有分布。從香薷葉表皮遠(yuǎn)軸面的腺毛分布圖（圖版Ⅰ，7～12）可以看出，營養(yǎng)生長和生殖生長期不同節(jié)位香薷葉表皮均有盾狀腺毛和頭狀腺毛的分布，且腺毛密度隨節(jié)位的降低而減少，上部節(jié)位密度高于中、下部節(jié)位；而從相同節(jié)位上分布看，營養(yǎng)生長期密度要高于生殖生長期。

2.3 香薷葉表皮腺毛數(shù)量

由表1可以看出，香薷營養(yǎng)生長期的葉表皮腺毛數(shù)（283.9個／mm2）遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于生殖生長期的腺毛數(shù)（194.4個／mm2）。從營養(yǎng)生長期和生殖生長期，同一枝條不同部位葉片腺毛數(shù)量來看，均為枝條上部葉片的腺毛數(shù)量最多，中部葉片次之，枝條下部葉片最少。各時期各節(jié)位葉表皮的頭狀腺毛數(shù)量均多于盾狀腺毛數(shù)量。營養(yǎng)生長期枝條上部節(jié)位葉表皮頭狀腺毛和盾狀腺毛數(shù)量最多，分別為106.2個／mm2和69.6個／mm2。

2.4 香薷腺毛發(fā)育過程中黃酮類物質(zhì)的分泌過程

2.4.1 頭狀腺毛 熒光顯微鏡下，香薷頭狀腺毛發(fā)育到成熟前期時，柄細(xì)胞和頭部均未顯現(xiàn)熒光（圖版Ⅱ，1），表明此時尚無黃酮類物質(zhì)生成；隨著腺毛成熟進(jìn)入分泌初期，腺毛頭部出現(xiàn)較弱的橙黃色熒光（圖版Ⅱ，2），表明香薷頭狀腺毛分泌物中存在些許黃酮類物質(zhì)；隨后熒光出現(xiàn)在腺毛頭部的頂端，且熒光亮度增強（圖版Ⅱ，3），表明分泌的黃酮類物質(zhì)進(jìn)一步增加；最后，腺毛的整個頭部均激發(fā)出強烈的橙黃色熒光（圖版Ⅱ，4），表明腺毛進(jìn)入分泌盛期，黃酮類物質(zhì)的含量也達(dá)到最高。

2.4.2 盾狀腺毛 在香薷盾狀腺毛發(fā)育到成熟前期，腺毛的頭部未顯現(xiàn)熒光（圖版Ⅱ，5），表明此時尚無黃酮類物質(zhì)生成。隨著腺毛的進(jìn)一步成熟，先是在腺毛頭部的四周出現(xiàn)微弱的檸檬黃色熒光（圖版Ⅱ，6），表明香薷盾狀腺毛進(jìn)入分泌初期，且分泌物中存在少量的黃酮類物質(zhì)；隨后在頭部中央的凹陷部位出現(xiàn)較為明亮的檸檬黃色熒光（圖版Ⅱ，7），表明腺毛進(jìn)入分泌期，黃酮類物質(zhì)含量增多；最后幾乎整個頭部都呈現(xiàn)明亮的檸檬黃色熒光（圖版Ⅱ，8），表明腺毛進(jìn)入分泌盛期。

3 討 論

表1 不同發(fā)育期不同取樣部位的香薷葉表皮腺毛數(shù)量Table 1 The number of glandular hairs on the leaf epidermis from the leaves at different nodes of the branches at different developmental stages of E.ciliata

本研究發(fā)現(xiàn)香薷葉表皮有頭狀腺毛和盾狀腺毛2種類型，這與胡鳳蓮［16］對香薷腺毛種類的研究一致。香薷葉表皮同一視野內(nèi)存在不同形態(tài)的頭狀、盾狀腺毛，表明腺毛發(fā)育是不同步的，這與吳姝菊等［3］的看法一致。劉孟奇等［17］發(fā)現(xiàn)唇形科冬凌草（Isodon rubescens）的頭狀腺毛頭部直徑為（20±2）μm，盾狀腺毛的頭部直徑為（50±5）μm。這與本研究發(fā)現(xiàn)的香薷頭狀腺毛頭部直徑為（20±2）μm，成熟盾狀腺毛的頭部直徑為（60±5）μm這一結(jié)果有差異，可能的原因是植物種不同或者栽培條件不同等因素所致。

Werker等［18］認(rèn)為，只要羅勒葉保留分生區(qū)，腺毛就不斷產(chǎn)生；在其他區(qū)域，葉生長到3cm長腺毛將停止產(chǎn)生。朱廣龍等［15］認(rèn)為木香薷成熟葉中依然有新腺毛的發(fā)生，只是數(shù)量較少。本研究在對營養(yǎng)生長期枝條的中、下部葉片及生殖生長期的上、中、下部葉片的光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察時，均未發(fā)現(xiàn)新腺毛，且對腺毛的統(tǒng)計結(jié)果也表明，香薷營養(yǎng)生長期葉表皮的腺毛數(shù)量比生殖生長期的多?？赡艿脑蚴窍倜S葉片成熟而逐漸成熟、頭部破裂、脫落，導(dǎo)致后期葉片腺毛數(shù)量減少。香薷成熟葉上是否有新腺毛的發(fā)生還有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)同一枝條上部葉片的腺毛數(shù)量高于中、下部葉片的腺毛數(shù)量。這與孔光輝等［19］發(fā)現(xiàn)“煙葉（Nicotiana tabacum）隨枝條部位的升高，腺毛密度增加”的研究結(jié)論相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)香薷葉表皮頭狀腺毛的數(shù)量比盾狀腺毛的數(shù)量多。這與鄭寶江等［10］認(rèn)為唇形科多裂葉荊芥的“盾狀腺毛數(shù)量比頭狀腺毛多”這樣結(jié)果不一致。我們分析這可能與物種及植物栽培的環(huán)境條件等因素有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，香薷腺毛分泌前期無熒光出現(xiàn)，隨著香薷腺毛發(fā)育成熟進(jìn)入分泌期，在頭狀和盾狀腺毛的頭部出現(xiàn)熒光，且隨著腺毛的發(fā)育，熒光逐漸增強。這與彭勵等［20］對甘草（Glycyrrhiza uralensis）腺毛的組織化學(xué)研究結(jié)果一致。證實了香薷腺毛中存在黃酮類物質(zhì)，表明香薷頭狀腺毛和盾狀腺毛都是黃酮類物質(zhì)的分泌和積累場所。

其他文獻(xiàn)中未明確指出Neu’s試劑的染色時間，本研究發(fā)現(xiàn)Neu’s試劑染色24h后用熒光顯微鏡觀察，效果較好，可為今后同類研究提供參考。

一般說來，香薷腺毛分泌物與腺毛總數(shù)成正比，腺毛數(shù)量最多時腺毛分泌物也最多。因此，以提取香薷葉片揮發(fā)性成分為目的時，最適宜取材時期為營養(yǎng)生長期，適宜取材部位為中、上部枝條葉片。同時可結(jié)合修剪、去頭等技術(shù)措施，促使香薷多發(fā)新枝，只取中上部枝條來代替整株，以便持續(xù)利用。

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圖版Ⅱ 香薷葉表皮頭狀腺毛和盾狀腺毛分泌黃酮類物質(zhì)組織化學(xué)特征的熒光顯微圖1～4.頭狀腺毛：1.紫外光下觀察：腺毛頭部未顯現(xiàn)熒光；2.紫外光下觀察：腺毛頭部出現(xiàn)較弱的橙黃色熒光；3.藍(lán)光下觀察：腺毛頭部頂端出現(xiàn)較強的檸檬黃色熒光；4.紫外光下觀察：腺毛整個頭部激發(fā)出強烈的橙黃色熒光；5～8.盾狀腺毛：藍(lán)光下觀察：5.腺毛頭部未顯現(xiàn)熒光；6.腺毛頭部出現(xiàn)較弱的檸檬黃色熒光；7.腺毛頭部中央激發(fā)出較強烈的檸檬黃色熒光；8.腺毛整個頭部出現(xiàn)較強的檸檬黃色熒光。PlateⅡ Fluorescence microscope micrographs showing histochemical characterization of the secretory flavonoids of the capitate and peltate glandular hairs on the leaf surface of E.ciliata Figs.1－4.Capitate glandular hairs：Fig.1.No yellow－orange fluorescence observed under UV light；Fig.2.Weak yellow－orange fluorescence in the head under UV light；Fig.3.Stronger lemon－yellow observed in the head under blue light；Fig.4.Strong yellow－orange fluorescence in the whole head；Figs.5－8.Peltate glandular hairs：Under blue light：Fig.5.No lemon－yellow fluorescence observed；Fig.6.Weak lemonyellow fluorescence in the head；Fig.7.Stronger lemon－yellow fluorescence in the central of head；Fig.8.Strong lemon－yellow fluorescence observed in the whole head.

圖版Ⅰ 香薷葉表皮腺毛的類型、形態(tài)和分布Pe.盾狀腺毛；Ca.頭狀腺毛；BC.基細(xì)胞；SC.柄細(xì)胞；H.頭部1.葉片取材位置；2.香薷營養(yǎng)生長期上部葉片上的頭狀腺毛的縱切面的光學(xué)顯微圖；3.營養(yǎng)生長期上部葉片的掃描電鏡圖，示頭狀腺毛和盾狀腺毛的表觀形態(tài)；4.營養(yǎng)生長期枝條中部葉脈處的縱切面的光學(xué)顯微圖，上面為葉的遠(yuǎn)軸面；5.生殖生長期枝條下部葉的近軸面的掃描電鏡圖；6.生殖生長期枝條下部葉的遠(yuǎn)軸面的掃描電鏡圖；7～12.葉遠(yuǎn)軸面的掃描電鏡圖：7.為營養(yǎng)生長期枝條上部葉表皮8.營養(yǎng)生長期枝條中部葉表皮；9.營養(yǎng)生長期期枝條下部葉表皮；10.生殖生長期枝條上部葉表皮；11.生殖生長期枝條中部葉表皮；12.生殖生長期枝條下部葉表皮（取樣位點在葉片的位置3）。PlateⅠ Types，morphology and distribution of the glandular hairs of leaf epidermis of E.ciliata Ca.Capitate glandular hair；Pe.Peltate glandular hair；H.Head，SC.Stalk cell，BC.Basal cell Fig.1.Sampling sites on the blade；Fig.2.Light microscope micrograph of the leaf at upper node of branch at vegetative stage，showing the longitudinal section of capitate glandular hair；Fig.3.SEM（scanning electron microscope）micrograph of the abaxial surface of the leaf at the upper node of the branch at vegetative stage，showing the morphology of capitate and peltate glandular hairs；Fig.4.Light microscope micrograph of the vein longitudinal section from the middle node of the branch at vegetative stage，abaxial surface was on the upper；Fig.5.SEM micrograph of adaxial epidermis of the leaves from the lower node of the branch at productive stage；Fig.6.SEM micrograph of abaxial epidermis of the leaves from the lower node of the branch at productive stage；Figs.7－12.SEM micrograph of abaxial epidermis of the leaves：Fig.7.From the upper node；Fig.8.From the middle node；Fig.9.from the lower node of the branch at vegetative stage；Fig.10.From the upper node；Fig.11.From the middle node；Fig.12.From the lower node of the branch at productive stage（sampling site is at site 3of the leaf）.

（編輯：潘新社）

Glandular Hairs on the Leaf Epidermis of Elsholtzia ciliata（Thunb.）Hyland and the Process of Secreting Flavonoids by the Glandular Hairs Based on Histochemistry Method

YUN Mengmeng，LI Baoyin，LIU Huichao，ZHOU Xiumei＊
（School of Horticulture and Landscape Architecture，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang，He’nan 453003，China）

The types，distribution and numbers of glandular hairs on the leaves at the upper，middle and lower nodes of the branches at vegetative and productive stage of Elsholtzia ciliata（Thunb.）Hyland were investigated by means of optical microscopy and scanning electron microscope technology；The process of secreting flavonoids by the glandular hairs were studied based on histochemistry method and fluorescence microscopy.The results showed that：（1）leaf epidermis of E.ciliata possessed peltate and capitate glandular hairs.Mature capitate glandular hair included basal cell，stalk cells and head.The head was small and hemispherical，with a diameter of（20±2）μm.Head of nearly mature peltate glandular hair was large and shield－shaped，with a diameter of（60±5）μm.（2）Glandular hairs distributed in abaxial and adaxial leaf epidermis of E.ciliata.The number of glandular hairs of the adaxial epidermis was more than that of the abaxial epidermis.Peltate glandular hairs were mainly distributed in the abaxial epidermis and capitate hairs were distributed in both sides of the leaves；the density of glandular hairs decreased with the lower of node.At the same node，the density of glandular hairs on the leaf at vegetative growth stage（283.9per mm2）was higher than that at reproductive growth stage（194.4per mm2）.（3）Flavonoids can be secreted by peltate and capitate glandular hairs.With glandular hair development and maturation，flavonoids accumulated gradually in the head.This study provides a reference for further study on the mechanism of secreting essential oils by the glandular hairs of E.ciliata，and also provides a theoretical basis for determining the best sampling time to extract the flavonoids from the leave of E.ciliata.

Elsholtzia ciliata（Thunb.）Hyland；glandular hairs；flavonoids；scanning electron microscope technology；histochemistry

Q744.62

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1129

1000－4025（2015）06－1129－06

2014－12－17；修改稿收到日期：2015－04－23

2013年河南省科技計劃（132102310255）；2012年河南教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目（12A220001）

員夢夢（1992－），女，在讀碩士研究生，主要從事芳香植物資源與應(yīng)用研究。E－mail：ymm11206190＠163.com

＊通信作者：周秀梅，博士，副教授，主要從事芳香植物資源與應(yīng)用研究。E－mail：zxm＠hist.edu.cn