徐 明，徐靖宇，楊冬爽，張 婧，金曉飛，石連旋

（1.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130024；2.吉林省農(nóng)作物新品種引育中心，吉林長(zhǎng)春130062）

鹽脅迫下黃豆亞屬植物游離脯氨酸積累響應(yīng)的差異分析

徐 明1，徐靖宇1，楊冬爽1，張 婧1，金曉飛2，石連旋1

（1.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130024；2.吉林省農(nóng)作物新品種引育中心，吉林長(zhǎng)春130062）

以中國(guó)同一緯度的不同黃豆亞屬植物為試驗(yàn)材料，通過(guò)分析栽培大豆、半野生大豆、耐鹽型野生大豆、鹽敏感型野生大豆在鹽脅迫下的生長(zhǎng)及游離脯氨酸代謝的響應(yīng)過(guò)程，研究了黃豆亞屬植物生理代謝的演化趨勢(shì)及進(jìn)化規(guī)律.結(jié)果表明：耐鹽型野生大豆游離脯氨酸含量的增加主要取決于鳥(niǎo)氨酸合成途徑的增強(qiáng)；栽培大豆游離脯氨酸含量的變化與谷氨酸合成途徑的增強(qiáng)及其降解途徑的顯著增加有關(guān)；半野生大豆游離脯氨酸含量的變化與鳥(niǎo)氨酸、谷氨酸合成途徑的增強(qiáng)以及降解途徑的降低均密切相關(guān).黃豆亞屬植物適應(yīng)環(huán)境選擇的壓力以及人工選育的需要，體內(nèi)游離脯氨酸代謝途徑發(fā)生了顯著的變化.

大豆；進(jìn)化；鹽脅迫；酶活性；游離脯氨酸

栽培大豆（Glycine max（linn.）Merr.）是世界上主要的農(nóng)作物，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一.其同一屬還包括有半野生大豆（Glycine gracilis Skv.）和野生大豆（Glucine sojaSieb.et Zucc.），這3個(gè)物種具有明顯的親緣關(guān)系［1－2］.野生大豆在適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境過(guò)程中也產(chǎn)生了不同的生態(tài)類型，如在高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)的野生大豆抗鹽性顯著增強(qiáng)，形成了抗鹽型野生大豆［3］.將同一緯度不同黃豆亞屬植物一起進(jìn)行比較研究，有助于對(duì)大豆屬植物進(jìn)化歷程的理解.

游離脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其在植物體內(nèi)有兩種合成途徑，關(guān)鍵的限速酶分別是Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ-OAT）.脯氨酸在植物體內(nèi)降解途徑的限速酶為脯氨酸脫氫酶（ProDH）［4－6］.脯氨酸代謝過(guò)程和含量與植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)有著密切的關(guān)系，它的積累量與逆境水平、抗性密切關(guān)聯(lián)［7］.

大豆屬植物進(jìn)化的研究，不僅僅是基礎(chǔ)生物學(xué)的問(wèn)題，在大豆種質(zhì)資源利用方面也具有重要的意義.對(duì)現(xiàn)存生態(tài)群體從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)等方面進(jìn)行系統(tǒng)的比較實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研究，是目前大豆起源進(jìn)化研究的根本方法［8］.本研究以中國(guó)同一緯度的不同黃豆亞屬植物為試驗(yàn)材料，人工模擬鹽脅迫處理大豆幼苗，測(cè)定了其生長(zhǎng)參數(shù)、葉片游離脯氨酸含量以及脯氨酸代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性，分析了鹽脅迫下不同黃豆亞屬植物生長(zhǎng)及脯氨酸代謝的響應(yīng)過(guò)程，以從生理代謝的角度揭示豆科黃豆亞屬植物的進(jìn)化規(guī)律和演化趨勢(shì)，為大豆種質(zhì)資源的利用以及大豆新品種的選育提供參考.

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料：栽培大豆（M）、半野生大豆（S）、鹽敏感型（W1）和耐鹽型（W2）野生大豆種子，吉林省農(nóng)作物新品種引育中心提供.其中栽培大豆品種為吉農(nóng)24，耐鹽型野生大豆保存號(hào)為Tongyu06311，鹽敏感型野生大豆保存號(hào)為Huinan06116.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將供試材料采用沙培方式進(jìn)行培養(yǎng)，花盆直徑為19cm.出苗后每盆定苗5株，并于每天清晨用2倍Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌一次，待幼苗生長(zhǎng)到3出復(fù)葉時(shí)期開(kāi)始進(jìn)行鹽脅迫處理.脅迫處理溶液采用NaCl和Na2SO4（n（NaCl）∶n（Na2SO4）＝1）及1倍Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制，其中Na＋濃度為45mmol／L；對(duì)照組用1倍Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌.每一處理5盆重復(fù).脅迫處理3周后采集植物葉片，進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的測(cè)量.收集試驗(yàn)材料地上部分和地下部分，測(cè)定株高和根長(zhǎng)；測(cè)定后將植物材料120℃殺青，80℃烘干至恒重，分別對(duì)地上部分和地下部分進(jìn)行稱重.

1.3 游離脯氨酸含量及其代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定

游離脯氨酸含量測(cè)定采用磺基水楊酸法-酸性茚三酮方法［9］；Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性的測(cè)定采用Hayzer的方法［10］，酶活性單位定義為單位時(shí)間內(nèi)生成1μmolγ-谷氨酞胺所需要的酶量，以U／（g·min）（鮮重）表示；鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ-OAT）活性的測(cè)定采用余光輝等的方法［11］，以單位時(shí)間內(nèi)生成1mmolΔ-吡咯啉-5-羧酸（P5C）的量為一個(gè)δ-OAT活性單位；脯氨酸脫氫酶（ProDH）活性的測(cè)定采用趙福庚等的方法［12］，以D（600）／（g·min）（鮮重）為一個(gè)酶活力單位.采用UV754N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行比色.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)取15次重復(fù)的平均值，以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）表示；采用單向方差分析法（ANOVA）進(jìn)行多重比較（P＜0.05）；采用Sigma Plot 10.0軟件完成圖表的繪制.

2 結(jié)果分析

2.1 鹽脅迫下不同黃豆亞屬植物生長(zhǎng)的變化

不同黃豆亞屬植物植株干重差異顯著.無(wú)鹽脅迫下，植株地上部分干重和根干重均表現(xiàn)為栽培大豆＞半野生大豆＞野生大豆.鹽脅迫下不同黃豆亞屬植物地上、地下部分干重均呈下降的趨勢(shì)，半野生大豆下降最高，其次是栽培大豆和野生大豆.鹽脅迫下，不同黃豆亞屬植物脅變反應(yīng)差異明顯，地上部分干重栽培大豆和鹽敏感型野生大豆、耐鹽型野生大豆的降低幅度分別為21.27%，20.95%，22.15%；半野生大豆的降低幅度較小，比對(duì)照組降低了8.19%.根干重栽培大豆、半野生大豆、鹽敏感型野生大豆，分別比對(duì)照組降低了26.22%，21.39%，46.15%，耐鹽型野生大豆與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（見(jiàn)圖1）.

圖1 鹽脅迫下不同黃豆亞屬植物地上部分干重、株高、地下部分干重、根長(zhǎng)的變化

鹽脅迫下，4種大豆植株的高度均呈降低的變化趨勢(shì)，但降低的幅度顯著不同，栽培大豆、半野生大豆、耐鹽型野生大豆分別比對(duì)照組降低了6.94%，5.81%，9.91%，鹽敏感型野生大豆降低的幅度最大，比對(duì)照組降低了20.16%.無(wú)鹽脅迫時(shí)，耐鹽型野生大豆的根最長(zhǎng)，其次為栽培大豆和半野生大豆，鹽敏感型野生大豆的根較短；鹽脅迫下，除耐鹽型野生大豆的根長(zhǎng)無(wú)顯著性變化外，其他均呈下降趨勢(shì)，其中栽培大豆、半野生大豆、鹽敏感型野生大豆分別比對(duì)照組降低了7.22%，5.56%，7.50%（見(jiàn)圖1）.

2.2 鹽脅迫下不同黃豆亞屬植物游離脯氨酸含量的變化

無(wú)鹽脅迫下，不同黃豆亞屬植物葉片游離脯氨酸含量差異顯著（見(jiàn)表1），半野生大豆含量為最高，分別比栽培大豆、鹽敏感型野生大豆、耐鹽型野生大豆高32.14%，23.33%，131.25%.鹽脅迫后，不同黃豆亞屬植物葉片游離脯氨酸含量均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)（見(jiàn)表1），半野生大豆含量同樣為最高.但是，游離脯氨酸含量增加幅度顯著不同，其中耐鹽型野生大豆的變化幅度最大，為43.75%；其次為栽培大豆和半野生大豆，分別為16.22%，17.86%，鹽敏感型野生大豆增加趨勢(shì)不顯著.

表1 鹽脅迫下不同黃豆亞屬植物葉片游離脯氨酸含量（FW）μg／g

2.3 鹽脅迫下不同黃豆亞屬植物游離脯氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的變化

鹽脅迫下，不同黃豆亞屬植物葉片P5CS活性差異顯著，半野生大豆葉片的P5CS活性為最高，分別比栽培大豆和鹽敏感型野生大豆高59.38%.同時(shí)，只有栽培大豆呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，比對(duì)照組降低了18.84%；半野生大豆呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，比對(duì)照組增加了28.26%；而野生大豆與對(duì)照組相比無(wú)顯著性變化.無(wú)脅迫下，不同黃豆亞屬植物葉片δ-OAT活性并無(wú)顯著性差異；鹽脅迫時(shí)，δ-OAT活性變化各異，栽培大豆和半野生大豆變化不顯著，均比鹽敏感型野生大豆高27.94%；而鹽敏感型野生大豆比耐鹽型野生大豆低11.54%.當(dāng)受到鹽脅迫時(shí)，不同黃豆亞屬植物的葉片δ-OAT活性變化幅度不同，栽培大豆比對(duì)照組增加了14.15%，其他與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異.無(wú)脅迫時(shí)，半野生大豆葉片的ProDH活性最高，分別比栽培大豆和鹽敏感型野生大豆高178.13%，123.43%，鹽敏感型野生大豆比栽培大豆高24.48%，比耐鹽型野生大豆低53.14%.在鹽脅迫下，只有半野生大豆ProDH活性呈降低的趨勢(shì)，比對(duì)照組降低了39.51%；栽培大豆和鹽敏感型野生大豆葉片ProDH活性呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，分別比對(duì)照組增加104.17%，61.92%；而耐鹽型野生大豆ProDH活性與對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異（見(jiàn)圖2）.

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于豆科大豆屬黃豆亞屬中各類型間的分類地位及其遺傳關(guān)系一直都存在著很大的爭(zhēng)議［13－15］.鹽脅迫下，植物生物量等生長(zhǎng)參數(shù)的變化顯示了受鹽脅迫抑制的程度以及抗脅迫能力的高低［16］.本試驗(yàn)的結(jié)果表明，生物量、株高、根長(zhǎng)等生長(zhǎng)參數(shù)的變化均顯示出耐鹽型野生大豆的抗逆性強(qiáng)于鹽敏感型野生大豆；而栽培大豆的抗逆性低于鹽敏感型野生大豆.這與前人的研究結(jié)果相一致［17］，同時(shí)也為后續(xù)游離脯氨酸的分析提供了依據(jù)和基礎(chǔ).

游離脯氨酸是最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一.游離脯氨酸的積累量與植物適應(yīng)逆境的能力有著密切的關(guān)系［18－19］.從游離脯氨酸含量的測(cè)試分析可以看出，耐鹽型野生大豆的游離脯氨酸增加的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鹽敏感型野生大豆、半野生大豆和栽培大豆，表現(xiàn)出較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力.植物體內(nèi)有兩條脯氨酸合成途徑，谷氨酸途徑是由谷氨酸通過(guò)兩步連續(xù)還原合成脯氨酸，關(guān)鍵酶為Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶；鳥(niǎo)氨酸途徑是由鳥(niǎo)氨酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用后又經(jīng)還原作用生成脯氨酸，關(guān)鍵酶為鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶；而脯氨酸的降解主要依賴于脯氨酸脫氫酶［7］.本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，鹽脅迫下，耐鹽型野生大豆、半野生大豆和栽培大豆脯氨酸代謝途徑的變化有著明顯的不同.耐鹽型野生大豆游離脯氨酸含量的增加主要取決于鳥(niǎo)氨酸合成途徑的增強(qiáng)；栽培大豆游離脯氨酸含量的變化與谷氨酸合成途徑增強(qiáng)及其降解途徑的顯著增加有關(guān)；而半野生大豆游離脯氨酸含量的變化與鳥(niǎo)氨酸和谷氨酸合成途徑的增強(qiáng)以及降解途徑的降低均密切相關(guān).同時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種不同黃豆亞屬植物游離脯氨酸的積累主要受鳥(niǎo)氨酸合成途徑與脯氨酸降解途徑控制.

圖2 鹽脅迫下不同黃豆亞屬植物脯氨酸代謝關(guān)鍵酶（δ-OAT、P5CS、ProDH）活性的變化

野生大豆、半野生大豆、栽培大豆3種不同黃豆亞屬植物隨著自然環(huán)境的選擇以及人工栽培的選育，植物體內(nèi)游離脯氨酸代謝途徑也隨之發(fā)生著變化.耐鹽型野生大豆為了適應(yīng)鹽漬化環(huán)境，脯氨酸合成增加的同時(shí)其降解過(guò)程未出現(xiàn)類似栽培大豆的增強(qiáng)，因此，游離脯氨酸在體內(nèi)大量積累，進(jìn)而適應(yīng)鹽環(huán)境.栽培大豆在合成增加的同時(shí)其降解過(guò)程也大幅度提高，因此脯氨酸積累量顯著小于耐鹽型野生大豆.半野生大豆脯氨酸代謝過(guò)程與3種關(guān)鍵酶均密切相關(guān)，與栽培大豆和野生大豆均不同，可以認(rèn)為，其屬于黃豆亞屬植物進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)中間類型.

［1］ 王克晶，李福山，海妻矩彥，等.中國(guó)河北省和日本東北部天然野生大豆群體性狀調(diào)查比較［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2000，22（4）：17-22.

［2］ WU X L，HE C Y，CHEN S Y.The diversity and evolution relation of Glycine［J］.Nature Science Progress，2001（7）：689-698.

［3］ TUYEN D D，LAL S K，XU D H.Identification of a major QTL allele from wild soybean（Glycine sojaSieb.＆Zucc.）for increasing alkaline salt tolerance in soybean［J］.Theor Appl Genet，2010，121：229-236.

［4］ DELAUNEY A J，HU C A A，KISHOR P B K，et al.Cloning of ornithine-aminotransferase cDNA fromVigna aconitifolia by trans-complementation in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis［J］.Biol Chem，1993，268：18673-18678.

［5］ KISHOR P B K，SANGAM S，AMRUTHA R N，et al.Regulation of proline biosynthesis，degradation，up-take and transport in higher plants：its implications in plant growth and abiotic stress tolerance［J］.Current Science，2005，88：424-438.

［6］ 夏方山，董秋麗，董寬虎.堿性鹽脅迫對(duì)堿地鳳毛菊苗期脯氨酸代謝途徑的影響［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2011，33（1）：48-52.

［7］ 趙貴林，陳強(qiáng)，胡國(guó)霞，等.水稻脯氨酸代謝關(guān)鍵酶對(duì)水分脅迫的響應(yīng)［J］.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2011，29（3）：80-83.

［8］ 田清震，蓋鈞鎰.大豆起源與進(jìn)化研究進(jìn)展［J］.大豆科學(xué)，2001，20（1）：54-59.

［9］ 鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：161-162.

［10］ HAYZER D J，LEISINGER T.The gene-enzyme relationships of proline biosynthesis in Escherichia Coli.J.Gen［J］.Microbiol，1980，118：287-293.

［11］ 余光輝，劉正輝，曾富華，等.脯氨酸累積與其合成關(guān)鍵酶活性的關(guān)系［J］.湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，23（6）：57-60.

［12］ 趙福庚，孫誠(chéng)，劉友良，等.ABA和NaCl對(duì)堿蓬多胺和脯氨酸代謝的影響［J］.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2002，28（2）：117-120.

［13］ 王克晶，李向華.中國(guó)野生大豆（Glycine soja）遺傳資源主要形態(tài)、遺傳變異和結(jié)構(gòu)［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2012，3（6）：917-928.

［14］ 吳三玲.半野生大豆（Glycine gracilis）基因組深度測(cè)序及其進(jìn)化分析［D］.浙江：浙江大學(xué)，2013：3-4.

［15］ WANG K J，LI X H.Interspecific gene flow and the origin of semi-wild soybean revealed by capturing the natural occurrence of in-trogression between wild and cultivated soybean populations［J］.Plant Breeding，2011，130：117-17.

［16］ 劉濱碩，康春莉，李忠民，等.不同鹽堿梯度生境下羊草根莖生長(zhǎng)的研究［J］.東北師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，45（3）：110-114.

［17］ 羅慶云，於丙軍，劉友良，等.大豆苗期耐鹽性鑒定指標(biāo)的檢驗(yàn)［J］.大豆科學(xué)，2001，20（3）：178-182.

［18］ 阮成江，謝慶良.鹽脅迫下沙棘的滲透調(diào)節(jié)效應(yīng)［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2002，11（2）：45-47.

［19］ 郭立泉，王紅宇，麻瑩，等.星星草響應(yīng)鹽堿脅迫的滲透調(diào)節(jié)和離子平衡機(jī)制［J］.東北師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，42（2）：120-125.

The difference analyses on free proline metabolism of plant soybeans subgenus under salt stress

XU Ming1，XU Jing－yu1，YANG Dong-shuang1，ZHANG Jing1，JIN Xiao-fei2，SHI Lian-xuan1
（1.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；2.Jilin Center of Germplasm Introduction and Breeding of Crops，Changchun 130062，China）

In order to explore the different physiological metabolism evolution trend and evolution between cultivated soybean，semi-wild soybean，salt tolerance wild soybean，salt sensitive wild soybean，the response of growth and metabolism process of proline under salt stress were investigated.The results showed that，the increasing proline content of salt tolerance wild soybean depended on the enhancing of ornithine pathway；the change of proline content in cultivated soybean depended on the enhancing of both glutamate pathway and degradation；and that of semi-wild soybean depends on all three pathways.Significant changes had happened in proline metabolism pathway of sojain order to adapt to the environment selection pressure and the requirement for artificial breeding.

soybean；evolution；salt stress；enzyme activity；free proline

Q 945.79 ［學(xué)科代碼］ 180·5140

A

（責(zé)任編輯：方 林）

1000-1832（2015）03-0122-05

10.16163／j.cnki.22-1123／n.2015.03.025

2014-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31270366）.

徐明（1990—），女，碩士研究生；通訊作者：石連旋（1972—），男，博士，副教授，主要從事大豆生理生態(tài)學(xué)研究.