彭雪微，孫麗麗，霍洪亮

（東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130024）

Apelin-13通過(guò)ERK1／2信號(hào)通路促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖及侵襲

彭雪微，孫麗麗，霍洪亮

（東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130024）

采用MTT、Brdu流式細(xì)胞術(shù)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，ElISA、Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)研究了apelin-13對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲的影響.結(jié)果表明：apelin-13能夠激活ERK1／2信號(hào)傳導(dǎo)通路，上調(diào)Cyclin D1和MMP-1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖及侵襲，可為臨床乳腺癌的診斷、防治及愈后評(píng)估提供新的思路和方法.

apelin-13；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1／2；細(xì)胞周期蛋白D1；基質(zhì)金屬蛋白酶1

1998年，Tatemoto等人［1］首次在牛胃分泌物中提取出G蛋白偶聯(lián)受體APJ（putative receptor protein related to ATJ）的內(nèi)源性配體，命名為apelin.迄今的研究表明，apelin是APJ唯一的天然配體.前體含77個(gè)氨基酸，可被ACE2水解成多種亞型：apelin-12，apelin-13，apelin-17，apelin-28，apelin-31，apelin-36.研究發(fā)現(xiàn)apelin在小鼠的肺、子宮、睪丸的主要存在形式是apelin-36，乳腺中則是apelin-13.另有研究表明，apelin與多種癌癥有密切關(guān)系，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移；apelin還可以促進(jìn)癌組織中血管新生，從而加速癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移；apelin在人的乳腺癌組織中含量高于正常組織［2］.目前apelin在乳腺癌中的作用機(jī)制仍不是十分清楚.細(xì)胞的各種生理生化反應(yīng)均受到相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控［3］，因此，本文重點(diǎn)研究了外源性apelin-13對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制.

細(xì)胞周期蛋白cyclin D1調(diào)控細(xì)胞周期由G1期向S期過(guò)渡，cyclin D1過(guò)度表達(dá)與癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)［4－6］.研究發(fā)現(xiàn)，在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞進(jìn)入S期后，cychin D1會(huì)迅速分解.細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，cyclin D1蛋白高表達(dá)，使細(xì)胞周期的G1期縮短，提前進(jìn)入S期，細(xì)胞異常增殖.因此，cyclin D1可能在乳腺癌發(fā)生及細(xì)胞增殖過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用.

基質(zhì)金屬蛋白酶1（metal matric proteinase，MMP-1）是一種間質(zhì)膠原酶，可以特異性降解Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型膠原蛋白，破壞基底膜促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展.正常情況下，MMP-1的表達(dá)量很低，但是當(dāng)受到佛波醇酯類、生長(zhǎng)因子、炎性因子等刺激時(shí)，表達(dá)量顯著升高.有研究表明，MMP-1在晚期乳腺癌組織中高表達(dá)，可作為預(yù)測(cè)侵潤(rùn)性腫瘤的標(biāo)志分子［7］，抑制MMP-1的表達(dá)可明顯阻礙乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移［8］.因此，MMP-1已成為研究乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn).

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是真核細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳遞途徑.在哺乳動(dòng)物體內(nèi)共鑒定出4個(gè)MAPK亞家族，包括：C-Jun N末端激酶、應(yīng)激活化蛋白激酶JNKs／SAPKs、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶ERKs以及P38MAPK，他們之間的氨基酸序列同源性大于40%［9］.其中ERK（extracellular signal-regulated kinase）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.ERK在多種惡性腫瘤組織中均出現(xiàn)異常表達(dá)或活性增強(qiáng)［10－11］.因此，研究ERK信號(hào)通路與乳腺癌的關(guān)系具有十分重要的意義.

1 材料方法

1.1 試劑

DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司）；MTT，Tris，甘氨酸，SDS，apelin-13，ERK抑制劑PD98059（美國(guó)Sigma公司）；單克隆抗兔Phospho-p44／42ERK1／2抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；單克隆抗體鼠β-肌動(dòng)蛋白和ECL蛋白印跡試劑盒（美國(guó)Santa Cruz公司）；冰醋酸、胰蛋白酶、甘油、蛋白酶抑制劑PMSF、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、二甲基亞砜（DMSO）和結(jié)晶紫（北京鼎國(guó)生物公司），青霉素-鏈霉素溶液-雙抗（中國(guó)碧云天公司）；DEPC水、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、Trizol裂解液（大連寶生物公司）；人MMP-1和CyclinD1ELISA試劑盒（美國(guó)RD公司）；Transwell侵襲小室（美國(guó)Corning公司）；Brdu細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（北京中昊生物科技有限公司）；脫脂奶粉、溴化乙啶EB（長(zhǎng)春尚寶生物公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒；PVDF膜（Millipore公司）.

1.2 MTT法細(xì)胞增殖檢測(cè)

將200μL生長(zhǎng)狀態(tài)良好的乳腺癌MCF-7細(xì)胞（1×104個(gè)）接種到96孔板中，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；小心吸棄上清，按180μL／孔加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12h；加apelin-13（0.01，0.1，10μmol／L）刺激細(xì)胞24h或10μmol／L apelin-13和10μmol／L PD98059抑制劑；再分別向每孔加入20μL MTT溶液（終質(zhì)量濃度為0.5mg／mL），繼續(xù)孵育4h；小心吸棄上清，每孔加DMSO 150μL，震蕩10min，使孔中殘留的MTT-甲臜結(jié)晶充分溶解，采用終點(diǎn)法酶標(biāo)儀檢測(cè)D（490）值.每組實(shí)驗(yàn)5次重復(fù)，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性.

1.3 Brdu流式細(xì)胞術(shù)

將2mL生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞（1×106個(gè)）接種到6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；小心吸棄上清，按2mL／孔加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12h；apelin-13（0.01，0.1，10μmol／L）刺激細(xì)胞12h，根據(jù)Brdu細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖率.

1.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將MCF-7細(xì)胞撤血清饑餓12h，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，以2×105個(gè)／mL的濃度接種于含有apelin-13（0.01，0.1，10μmol／L）或apelin-13和PD98059（均為10μmol／L）底部鋪有基質(zhì)膠的Transwell上室（小孔直徑8.0μm），24孔板下室中加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h.用棉球擦除聚碳酸酯膜的上部細(xì)胞，用10%甲醇溶液固定聚碳酸酯膜下部的細(xì)胞30s，之后用0.1%結(jié)晶紫室溫染色20min.將內(nèi)置小室正置于載玻片上，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野顯微拍照.按0.1mL／孔加入33%醋酸脫色，震蕩，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)D（570）值.

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液或裂解液，3 000r／min離心10min，取上清液，－20℃保存?zhèn)溆?；?℃冰箱中取出ELISA試劑盒室溫平衡20min，37℃水浴鍋中加熱溶解試劑盒中的濃縮洗滌液，并用蒸餾水按照1∶20的比例（體積比）稀釋；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，向包被待測(cè)抗體的微孔中一次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體；封口膜封口，37℃溫浴1h；用洗滌液洗滌5次，1min／次；徹底洗滌之后加入TMB，37℃避光溫浴15min顯色（TMB能夠在過(guò)氧化物酶的作用下變成藍(lán)色、在酸的作用下轉(zhuǎn)變成最后的黃色），顏色的深淺和樣品中的蛋白量呈正相關(guān).加入終止液之后在酶標(biāo)儀上使用終點(diǎn)法檢測(cè)D（450）值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度曲線計(jì)算樣品濃度.

1.6 Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS（0.01mol／L，pH＝7.2～7.3）漂洗2次.吸凈PBS，加入預(yù)冷的1mL RIPA裂解液，RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑PMSF（終濃度1mmol／L）.用細(xì)胞刮刮取貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞及裂解液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，冰上裂解30min.將超聲探頭沒(méi)入混懸液內(nèi)，超聲破碎2min，破碎分4次進(jìn)行，每次30s.4℃條件下12 000r／min離心10min.輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，置于冰上，吸取的上清即為提取蛋白；棄沉淀，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度.為確保每個(gè)蛋白樣品上樣量的一致性，－20℃保存?zhèn)溆?；測(cè)定前，100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白.SDSPAGE電泳分離目的蛋白，根據(jù)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)切割凝膠并將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h.一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育60min.ECL檢測(cè)試劑盒曝光.

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用Sigma plot10.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù).統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用樣本平均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間數(shù)值的比較，P＜0.05為差異顯著.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Apelin-13促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲

Apelin-13刺激MCF-7細(xì)胞24h后檢測(cè)D（490）值.結(jié)果顯示，隨著apelin-13濃度的升高，D（490）值隨之增大，10μmol／L apelin-13刺激組D（490）值最大（見(jiàn)圖1A）.Brdu標(biāo)記的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，apelin-13刺激組細(xì)胞的增殖率明顯提高（見(jiàn)圖1B）.Transwell侵襲小室檢測(cè)apelin-13促M(fèi)CF-7細(xì)胞的侵潤(rùn)作用：用不同濃度的apelin-13刺激MCF-7細(xì)胞6h，結(jié)晶紫染色.與對(duì)照組相比，apelin-13刺激組著色面積明顯升高，且隨著apelin-13濃度的升高著色程度逐漸加深.說(shuō)明進(jìn)入小室下室的細(xì)胞數(shù)量增多（見(jiàn)圖1C）.再收集小室下室的細(xì)胞，檢測(cè)D（570）值，結(jié)果與侵襲小室實(shí)驗(yàn)中各組結(jié)果一致，隨著Apelin-13濃度的增加，D（570）值隨之增大（見(jiàn)圖1D）.細(xì)胞增殖和侵襲時(shí)cyclin D1和MMP-1基因異常活躍.因此，我們用ELISA檢測(cè)了apelin-13刺激MCF-7細(xì)胞后增殖基因cyclin D1和MMP-1的蛋白表達(dá).結(jié)果顯示，cyclin D1和MMP-1的表達(dá)與apelin-13濃度呈正相關(guān)（見(jiàn)圖1E，F(xiàn)）.

圖1 Apelin-13促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲結(jié)果

2.2 ERK1／2信號(hào)通路調(diào)控apelin-13誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲

為了確定apelin-13促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖及侵襲所依賴的信號(hào)途徑，我們檢測(cè)了apelin-13刺激組MCF-7細(xì)胞ERK1／2的磷酸化水平.Western blot結(jié)果顯示，ERK1／2磷酸化水平與apelin-13刺激濃度呈正相關(guān)，10μmol／L apelin-13刺激組ERK1／2磷酸化達(dá)到了顯著水平（見(jiàn)圖2A）.apelin-13孵育MCF-7細(xì)胞12h后，再用10μmol／L ERK1／2抑制劑PD98059處理MCF-7細(xì)胞1h，ERK1／2磷酸化水平明顯降低，表明PD98059能夠阻斷ERK信號(hào)通路（見(jiàn)圖2B）.

大量研究表明，ERK1／2調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切.上述結(jié)果證明，外源性apelin-13能夠激活ERK1／2的表達(dá)，apelin-13可能通過(guò)激活ERK1／2信號(hào)通路促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖及侵襲.因此，我們用PD98059預(yù)處理MCF-7細(xì)胞1h，利用MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況.結(jié)果顯示，apelin-13刺激組D（570）值明顯高于對(duì)照組，而PD98059處理組D（570）值均有明顯降低，且略低于對(duì)照組（見(jiàn)圖2C）.說(shuō)明apelin-13對(duì)MCF-7細(xì)胞的促增殖作用被PD98059所抑制.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，apelin-13刺激組結(jié)晶紫著色面積明顯高于對(duì)照組，侵入到下室的細(xì)胞數(shù)量增加；PD98059處理后，結(jié)晶紫著色面積減少，侵入到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（見(jiàn)圖2D）.ELISA結(jié)果顯示，PD98059能夠抑制cyclin D1和MMP-1的表達(dá)，使cyclin D1和MMP-1表達(dá)與對(duì)照組表達(dá)量幾乎一致（見(jiàn)圖2E，F(xiàn)）.

圖2 Apelin-13通過(guò)ERK1／2信號(hào)通路調(diào)控MCF-7細(xì)胞的增殖及侵襲

3 討論

近年來(lái)，大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明內(nèi)源性配體apelin在人體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用.如apelin在人體結(jié)腸癌中過(guò)量表達(dá)，可促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展［12］.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)apelin在乳腺組織和乳汁中含量較高，在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中也有高水平表達(dá).但是，apelin對(duì)乳腺癌發(fā)生的作用機(jī)制還沒(méi)有明確結(jié)論，為此，我們做了大量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外源性apelin-13對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖和侵襲的影響.

不同濃度的apelin-13能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖（見(jiàn)圖1A，B）及侵襲（見(jiàn)圖1C，D）.同時(shí)，能上調(diào)cyclin D1（見(jiàn)圖1E）及MMP-1（見(jiàn)圖1F）的表達(dá)且具有濃度依賴性，10μmol／L apelin-13刺激組cyclin D1和MMP-1蛋白表達(dá)增加量最為明顯.在細(xì)胞周期中，cyclin D1過(guò)度表達(dá)則會(huì)縮短G1期間隔，降低細(xì)胞對(duì)促細(xì)胞分裂劑的依賴性，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展.MMP-1能夠刺激腫瘤細(xì)胞的侵襲和分化，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移.為了進(jìn)一步研究apelin-13促進(jìn)MCF-7增殖及侵襲的分子機(jī)制，我們應(yīng)用ERK1／2抑制劑PD98059，檢測(cè)了ERK1／2與apelin-13刺激MCF-7細(xì)胞增殖及侵襲的關(guān)系.結(jié)果表明，PD98059能夠明顯抑制apelin-13誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞增殖和cyclin D1的高水平表達(dá)（見(jiàn)圖2C，E）.說(shuō)明ERK1／2在apelin-13誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖周期中起到了重要的調(diào)控作用.同樣，PD98059也能夠明顯抑制apelin-13誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞侵襲及MMP-1的表達(dá)（見(jiàn)圖2D，F(xiàn)）.Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)apelin-13刺激后ERK1／2磷酸化水平升高，apelin-13能夠激活ERK1／2信號(hào)傳導(dǎo)通路（見(jiàn)圖A，B）.因此，apelin-13可能是通過(guò)激活ERK1／2信號(hào)通路促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖及侵襲的.

綜合以上結(jié)果，apelin-13激活ERK1／2作用于相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶等多種底物進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)cyclin D1，MMP-1等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等多種生理過(guò)程，這一機(jī)制的闡明可為乳腺癌的治療及預(yù)防提供新方向.

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The effect of apelin-13on breast MCF-7cell proliferation and invasion via activate ERK1／2signaling pathways

PENG Xue-wei，SUN Li-li，HUO Hong-liang
（School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

This papers researched the effect of apelin-13on breast MCF-7cell proliferation and invasion through MTT，Brdu flow cytometry assay，Transwell assay，Elisa，Western Blot.These results showed that apelin-13could increase cyclin D1and MMP-1and induce MCF-7cells proliferation and migration via activate ERK1／2signaling pathways.

apelin-13；ERK1／2；cyclin D1；MMP-1

Q 253 ［學(xué)科代碼］ 180·2130

A

（責(zé)任編輯：方 林）

2015-01-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51478096）；吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140204059YY）.

彭雪微（1989—），女，碩士研究生；通訊作者：霍洪亮（1963—），男，博士，副教授，主要從事細(xì)胞生理學(xué)研究.