吳丹丹，劉小璇，劉建元，劉勇，陶襄萍，楊樹(shù)廣，樊東升，劉少君

一個(gè)脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)家系的分子遺傳學(xué)研究

吳丹丹，劉小璇，劉建元，劉勇，陶襄萍，楊樹(shù)廣，樊東升，劉少君

目的研究1個(gè)漢族脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCAs)家系的基因分型。方法收集該SCAs家系中的6例患者和有血緣關(guān)系的40例無(wú)癥狀者共46人的外周血樣品，結(jié)合先證者的臨床體征及二代測(cè)序結(jié)果，采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)該家系致病基因ATXN2的CAG三核苷酸重復(fù)片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和PCR產(chǎn)物測(cè)序的方法確定該家系所有成員的正常與異常擴(kuò)增等位基因內(nèi)三核苷酸重復(fù)次數(shù)。結(jié)果該家系的遺傳性SCAs為常染色體顯性遺傳，4代46人中有6例SCA2患者，7例為致病等位基因攜帶者?；颊逜TXN2兩個(gè)等位基因中的1條CAG三核苷酸重復(fù)次數(shù)在正常范圍內(nèi)，另1條CAG三核苷酸重復(fù)次數(shù)在異常范圍?；颊弋惓５任换駽AG三核苷酸重復(fù)次數(shù)范圍為40～46次。結(jié)論該家系為CAG三核苷酸重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變引起的常染色體顯性遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅱ型，基因診斷還發(fā)現(xiàn)該家系中有7名致病等位基因攜帶者。

脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)；三核苷酸重復(fù)；動(dòng)態(tài)突變；基因診斷

脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxias，SCAs)是一大類由遺傳因素引起的遲發(fā)型神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，占神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的10%～15%，具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性[1-2]。該病是由三核苷酸或五核苷酸動(dòng)態(tài)突變擴(kuò)展引起的，多呈常染色體顯性遺傳，其病理改變主要是脊髓、小腦和腦干的神經(jīng)元變性脫失與膠質(zhì)增生[2-3]，臨床表現(xiàn)為小腦共濟(jì)失調(diào)伴構(gòu)音障礙、意向性震顫、錐體系及錐體外系癥狀等[4]。根據(jù)其臨床特點(diǎn)與基因定位可分為SCA1－30共30種亞型[5]。該病雖病情進(jìn)展緩慢，但呈進(jìn)行性惡化與遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象，嚴(yán)重危害患者健康，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。本研究收集到1個(gè)甘肅地區(qū)漢族遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)家系并進(jìn)行研究，對(duì)先證者進(jìn)行核磁共振掃描及肌電圖檢查，結(jié)合臨床癥狀，確診為脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)，但亞型無(wú)法確定。取先證者及其弟弟的外周血進(jìn)行外顯子測(cè)序，獲得與該病相關(guān)的突變基因ATXN2，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增ATXN2基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該家系中6例患者及7例致病等位基因攜帶者的ATXN2基因中包含1條異常等位基因，異常等位基因內(nèi)的CAG異常擴(kuò)增，而家系內(nèi)其他成員ATXN2基因的CAG重復(fù)均在正常范圍內(nèi)。

1 資料與方法

1.1 家系調(diào)查 本家系收集自甘肅地區(qū)，家系成員5代77人，其中5人因該病去世。家系第一代由于年代久遠(yuǎn)且都已去世，詳細(xì)資料無(wú)法收集。剩余成員中有6例患者，患者均有不同程度的小腦共濟(jì)失調(diào)癥狀，其他人表現(xiàn)正常。在得到軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)同意并征得家系成員知情同意的情況下，采集家系成員46人的外周血各4ml，凍存于本實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱內(nèi)備用。

1.2 疾病診斷 先證者于2014年年初在甘肅省臨夏州人民醫(yī)院接受核磁共振檢查，隨后在北京大學(xué)第三醫(yī)院進(jìn)行了臨床體征檢查與肌電圖檢查。

1.3 致病基因檢測(cè)

1.3.1 外顯子捕獲及二代測(cè)序 將先證者及其弟弟外周血各200μl送華大基因進(jìn)行外顯子測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為HiSeq 2000，獲得與該家系疾病相關(guān)的突變基因。

1.3.2 基因組DNA提取 使用天根生物科技公司的血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取家系成員血液基因組DNA，用作PCR反應(yīng)模板。

1.3.3 PCR擴(kuò)增ATXN2基因 對(duì)于華大基因外顯子測(cè)序所獲與該家系疾病相關(guān)的突變基因ATXN2，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，正向引物為5'-ACGCCACCACAGCCTCCAGAC-3'，反向引物為5'-CTCGCCTCCCTCCGCCTCAG-3'，送至生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：總體積50μl，TaKaRa PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl，上下游引物(20μmol/L)各1μl，基因組DNA 2μl，雙蒸水21μl。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min預(yù)變性；98℃ 20s變性、66℃ 15s退火、72℃ 60s延伸，38個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。PCR產(chǎn)物片段大小為965bp。

1.4 致病基因ATXN2內(nèi)CAG三核苷酸重復(fù)次數(shù)的確定 對(duì)1.3中的PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用天根生物科技公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(普通離心柱型)對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收，將回收后的DNA送至生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果，計(jì)數(shù)CAG三核苷酸重復(fù)次數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 家系分析及臨床診斷

2.1.1 家系分析 調(diào)查發(fā)現(xiàn)該家系共5代77人，在世成員中有6例患者，發(fā)病年齡20～40歲，患者均有不同程度的小腦共濟(jì)失調(diào)癥狀。該家系中無(wú)近親婚配史，5代中均有患者，男女均可患病，患者的雙親之一必定為患者，符合常染色體顯性遺傳性疾病的遺傳特點(diǎn)(圖1)。

圖1 甘肅地區(qū)脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)家系系譜圖Fig.1 The pedigree diagram of the family with spinocerebellar ataxias in Gansu

2.1.2 臨床診斷 先證者，Ⅲ-7，38歲發(fā)病，發(fā)病7年?；颊?年前無(wú)明顯誘因出現(xiàn)行走不穩(wěn)伴持物不穩(wěn)，雙下肢發(fā)僵，進(jìn)食嗆咳，并逐漸加重，其余無(wú)異常。臨床體征：雙上肢震顫，雙下肢發(fā)抖，行走不穩(wěn)。神經(jīng)系統(tǒng)檢查：輕度構(gòu)音障礙，指鼻及跟-膝-脛試驗(yàn)欠穩(wěn)妥，輪替障礙，辨距不良。肌電圖檢查：雙上肢和下肢深感覺(jué)傳導(dǎo)路徑阻滯，雙側(cè)聽(tīng)覺(jué)-腦干徑路波幅下降，雙側(cè)視覺(jué)徑路波幅下降，四肢肌張力下降，腱反射減弱。頭部核磁掃描顯示：小腦和腦干萎縮，以小腦萎縮為著(圖2)。結(jié)合以上資料，確診先證者患有脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)。

2.2 致病基因檢測(cè)

圖2 先證者頭顱MRI掃描(箭頭示意腦萎縮部位)Fig.2 Brain MRI images of proband (arrows point to the brain atrophy) A. Sagittal scanning; B. Axial scanning

2.2.1 外顯子捕獲及二代測(cè)序 在華大基因測(cè)序的兩位患者外顯子測(cè)序結(jié)果與人類基因組參考序列(UCSC hg 19 version)比對(duì)，兩位患者相同的突變?yōu)?4個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)和8個(gè)插入缺失突變基因。結(jié)合臨床診斷結(jié)果，首先選取8個(gè)插入缺失突變基因中的ATXN2基因進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

2.2.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 對(duì)46位家系成員進(jìn)行了突變基因ATXN2的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家系中的6例患者Ⅱ-8、Ⅲ-5、Ⅲ-7、Ⅲ-21、Ⅳ-8、Ⅳ-10及7例致病等位基因攜帶者Ⅲ-13、Ⅳ-1、Ⅳ-6、Ⅳ-19、Ⅴ-1、Ⅴ-3、Ⅴ-5的PCR產(chǎn)物電泳圖出現(xiàn)明顯的2條大小不等的條帶，而家系中其他成員未出現(xiàn)該現(xiàn)象。這是因?yàn)槔碚撋厢槍?duì)這一位點(diǎn)而言，每個(gè)個(gè)體PCR產(chǎn)物都是兩個(gè)條帶(一對(duì)等位基因)，正常人兩條等位基因的CAG重復(fù)次數(shù)相同或者差距較小，在電泳圖上無(wú)法區(qū)分，但是患者和攜帶者的PCR產(chǎn)物的正常等位基因明顯比異常等位基因小，在電泳圖上可分辨出來(lái)。對(duì)PCR擴(kuò)增后的條帶切膠回收DNA，送至生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.2.3 比對(duì)計(jì)數(shù)CAG重復(fù)序列擴(kuò)增次數(shù) 回收后的DNA片段采取ATXN2雙向測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果計(jì)數(shù)致病基因ATXN2的CAG(反向?yàn)镃TG)三核苷酸重復(fù)次數(shù)(圖3、4)，結(jié)果顯示患者及致病等位基因攜帶者異常等位基因的CAG重復(fù)次數(shù)為40～48次，明顯超出正常范圍(表1、2)，剩余家系成員ATXN2兩條等位基因的CAG重復(fù)次數(shù)均在19～25次，屬于正常范圍。

表1 患者CAG重復(fù)次數(shù)Tab. 1 The CAG repeats of patients

表2 異常等位基因攜帶者CAG重復(fù)次數(shù)Tab. 2 The CAG repeats of pathogenic allele carriers

圖3 正常對(duì)照Ⅱ-10 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Fig. 3 Sequencing result of the PCR products of normal control Ⅱ-10

圖4 患者Ⅱ-8 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Fig. 4 Sequencing result of the PCR products of patient Ⅱ-8

3 討 論

SCAs是一大類具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)展性退行性病變，以小腦共濟(jì)失調(diào)，構(gòu)音障礙，眼球震顫，認(rèn)知障礙，錐體系及錐體外系、脊髓及外周神經(jīng)系統(tǒng)受累為特征[6]，其主要病理改變是神經(jīng)元變性脫失和神經(jīng)纖維的沃勒變性[7]。目前已有30多種SCAs亞型的致病基因被定位，其中SCA1、SCA2、SCA3/MJD、SCA6、SCA7、SCA17及齒狀核-紅核-蒼白球路易體萎縮(dentatorubralpallidoluy-sian atrophy，DRPLA)這7種亞型是由于致病基因編碼區(qū)內(nèi)的CAG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增使其編碼的多聚谷氨酰胺鏈異常擴(kuò)展而引起的[8]。有研究表明，SCAs中的CAG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)核包涵體形成，有可能是引發(fā)SCAs疾病的原因[9]。

SCA2是在古巴最早被發(fā)現(xiàn)并描述的，且在古巴的發(fā)病率較高[10]，在中國(guó)則較少見(jiàn)[11]。SCA2患者多在30～40歲發(fā)病[12]，病程進(jìn)展緩慢，臨床表現(xiàn)以小腦共濟(jì)失調(diào)、構(gòu)音障礙、眼肌麻痹、慢眼動(dòng)、腱反射減弱、早期周圍神經(jīng)病變等癥狀為主，常伴智力障礙，頭部MRI檢查顯示不同程度的橄欖-腦橋-小腦萎縮[13]。SCA2患者的病理?yè)p傷主要存在于小腦皮質(zhì)的浦肯野細(xì)胞和腦干神經(jīng)元，還存在于大腦皮質(zhì)的額葉和枕葉以及肌肉組織[7]。

ATXN2是SCA2的致病基因，最先被德國(guó)的Gispert與Twells在1993年定位于12q23-24.1[14]，由Pulst 等[15]在1996年成功克隆。ATXN2基因編碼Ataxin-2蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為140×103，含1312個(gè)氨基酸殘基，第1外顯子編碼區(qū)CAG三核苷酸異常重復(fù)擴(kuò)展導(dǎo)致編碼蛋白中的多聚谷氨酰胺鏈延長(zhǎng)而致病[16]。正常ATXN2等位基因CAG三核苷酸重復(fù)次數(shù)為13～31次，而異常等位基因重復(fù)次數(shù)大于34次，多數(shù)在36～59次之間，且序列中沒(méi)有CAA插入[15]，中間重復(fù)范圍為32～34次[17]。

本研究的家系先證者以軀干共濟(jì)失調(diào)起病，隨后出現(xiàn)姿勢(shì)性震顫，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)正常，感覺(jué)神經(jīng)的雙側(cè)尺神經(jīng)和一側(cè)腓神經(jīng)未測(cè)出，雙側(cè)聽(tīng)覺(jué)-腦干徑路波幅下降，雙側(cè)視覺(jué)徑路波幅下降，有顱腦神經(jīng)損傷，無(wú)明顯慢眼動(dòng)，無(wú)明顯周圍神經(jīng)病變，小腦系癥狀有構(gòu)音障礙、眼肌麻痹、軀干共濟(jì)失調(diào)、姿勢(shì)性震顫等，錐體外系癥狀有鉛管樣肌張力增高、靜止性震顫等。該先證者的癥狀基本符合SCA2的表現(xiàn)，但其家系成員均無(wú)智力障礙?；蛟\斷方面，患者與正常人CAG三核苷酸重復(fù)均被CAA打斷，CAA 與CAG一樣編碼谷氨酰胺，但有報(bào)道CAA插入可能會(huì)減輕患者的癥狀[18]，這在本研究中有所體現(xiàn)，CAG重復(fù)中CAA插入越多的患者癥狀相對(duì)越輕。除此之外，有報(bào)道稱患者CAG重復(fù)次數(shù)越多，則發(fā)病年齡越小，病情越嚴(yán)重[19]，這在本家系成員中沒(méi)有體現(xiàn)，亦未顯出現(xiàn)其他報(bào)道中的遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象。

本研究所搜集到的家系具有以下特點(diǎn)：①家系龐大，血液樣本采集較全；②所有患者均無(wú)智力障礙，表現(xiàn)為智力正常；③SCA2在該家系的不同成員中具有臨床和遺傳異質(zhì)性；④家系中7例SCA2癥狀前患者異常等位基因CAG重復(fù)次數(shù)為40～48次，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出正常人CAG重復(fù)13～31次的范圍，可以做出7例為致病等位基因攜帶者的診斷。本研究除了對(duì)ATXN2進(jìn)行PCR檢測(cè)驗(yàn)證外，還對(duì)外顯子測(cè)序所獲的84個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)和其他7個(gè)插入缺失突變基因進(jìn)行了PCR檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)這些突變基因均與該家系疾病無(wú)關(guān)，說(shuō)明對(duì)于SCA2，ATXN2基因內(nèi)CAG三核苷酸異常擴(kuò)展是發(fā)病的主要原因。

本研究對(duì)于該家系的遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行了明確診斷，確診為脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅱ型，具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。首先，為家系成員提供了翔實(shí)的資料，明確了家系成員攜帶致病基因的情況，為他們的醫(yī)療保健提供了參考。其次，如此龐大的SCA2家系在中國(guó)乃至世界范圍內(nèi)都比較少見(jiàn)，該家系成員的臨床體征、核磁共振影像、肌電圖檢查等資料豐富了SCA2的研究。再次，該家系成員的臨床體征結(jié)合基因診斷結(jié)果，再一次證實(shí)了SCAs分型不能僅僅依靠臨床診斷，因?yàn)镾CAs具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性，且各亞型之間有重疊癥狀，必須結(jié)合基因診斷。

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Molecular genetics of a Chinese family with spinocerebellar ataxia

WU Dan-dan1, LIU Xiao-xuan2, LIU Jian-yuan3, LIU Yong1, TAO Xiang-ping2, YANG Shu-guang1*, FAN Dong-sheng2*, LIU Shao-jun1*1Department of Neurobiology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, China
2Department of Neurology,Third Hospital Peking University, Beijing 100191, China
3Department of General Surgery, First People's Hospital of Jiayuguan, Jiayuguan, Gansu 735100, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author. YANG Shu-guang, E-mail: lionamms@hotmail.com; FAN Dong-sheng, E-mail: dsfan@sina.com; LIU Shaojun, E-mail: liusj@bmi.ac.cn

. YANG Shu-guang, E-mail: lionamms@hotmail.com; FAN Dong-sheng, E-mail: dsfan@sina.com; LIU Shaojun, E-mail: liusj@bmi.ac.cn
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81370051, 81471155)

ObjectiveTo study the genotype of the members of a Chinese family with spinocerebellar ataxia (SCA).MethodsThe peripheral blood samples of 6 patients and 40 asymptomatic people belonged to the family were collected. Referring to the clinical manifestations of the proband and second-generation sequencing results, the CAG trinucleotide repeats of the pathogenic gene ATXN2 were amplified by polymerase chain reaction (PCR). The repeated times of the trinucleotide in normally and abnormally amplified alleles were defined by agarose gel electrophoresis and PCR products sequencing.ResultsAutosomal dominant heredity was the cause of the SCA in this family. Six out of 46 in the fourth-generation were SCA2 patients, 7 were the carriers of pathogenic allele. The repeated times of CAG trinucleotide were within the normal range in one of the two alleles of ATXN2, but they were in abnormal range in the another one. The repeated times of CAG trinucleotide were 40-46 in abnormal alleles of patients.ConclusionAutosomal dominant heredity SCA2 has been diagnosed in this family caused by the dynamic nutation of CAG trinucleotide repeats, and 7 pathogenic allele carriers in this family were confirmed by genetic diagnosis.

spinocerebellar ataxias; trinucleotide repeats; dynamic mutation; genetic diagnosis

R744.7

A

0577-7402(2015)08-0638-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.07

2015-01-20；

2015-06-28)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

國(guó)家自然科學(xué)基金(81370051，81471155)

吳丹丹，碩士研究生。主要從事家族性神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病的研究

100850 北京 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(吳丹丹、劉勇、楊樹(shù)廣、劉少君)；100191北京 北京大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)科(劉小璇、陶襄萍、樊東升)；735100 甘肅嘉峪關(guān) 嘉峪關(guān)市第一人民醫(yī)院普外科(劉建元)

楊樹(shù)廣，E-mail：lionamms@hotmail.com；樊東升，E-mail：dsfan@sina.com；劉少君，E-mail：liusj@bmi.ac.cn