徐冰心，劉志國(guó)，司少艷，李成林，婁曉同，楊鶴鳴，李建忠，王建營(yíng)，崔彥

火箭煤油對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的抑制作用觀察

徐冰心，劉志國(guó)，司少艷，李成林，婁曉同，楊鶴鳴，李建忠，王建營(yíng)，崔彥

目的觀察皮膚涂抹火箭煤油(RK)對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的抑制作用。方法建立皮膚遲發(fā)超敏反應(yīng)(DTH)模型，觀察皮膚火箭煤油的涂抹劑量與其細(xì)胞免疫功能抑制作用之間的關(guān)系。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組ICR雌性小鼠背部涂抹丙酮，火箭煤油組涂抹特定劑量及一定次數(shù)的火箭煤油(低劑量：0.5ml/kg；中劑量：1ml/kg；高劑量：2ml/kg)，每組6只。通過(guò)測(cè)定耳腫脹度判定火箭煤油的免疫抑制作用。陽(yáng)性對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組采用1%二硝基氟苯(DNFB)致敏。①不同劑量RK染毒1次：分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、火箭煤油低劑量組、火箭煤油中劑量組、火箭煤油高劑量組；②同一劑量RK不同染毒次數(shù)(1次/d，天數(shù)不同)：分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量RK 1次染毒組、低劑量RK 2次染毒組、低劑量RK 3次染毒組、低劑量RK 4次染毒組、低劑量RK 5次染毒組；③不同劑量RK 5次染毒(1次/d，連續(xù)5d)：分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量RK 5次染毒組、中劑量RK 5次染毒組、高劑量RK 5次染毒組。采用體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)等方法觀察皮膚涂抹RK的細(xì)胞免疫抑制持續(xù)時(shí)間，MTT法觀察刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+和CD8+)和脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期。結(jié)果RK 1次染毒能降低DNFB致敏引起的ICR小鼠耳腫脹、脾臟系數(shù)升高及胸腺指數(shù)降低(P<0.05)，RK對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫抑制作用隨劑量與染毒次數(shù)的增加而增加。RK 1次染毒可以降低ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖且持續(xù)至染毒后20d仍有顯著差異(P<0.05)，染毒后第10天CD4+/CD8+比值顯著降低。結(jié)論皮膚染毒RK對(duì)小鼠細(xì)胞免疫具有明顯的抑制效應(yīng)。

火箭煤油；細(xì)胞免疫抑制；超敏反應(yīng)，遲發(fā)型；淋巴細(xì)胞

火箭煤油(rocket kerosene，RK)又稱航天煤油，是一種高密度、低凝點(diǎn)、高品質(zhì)的高熱穩(wěn)定性大型火箭發(fā)動(dòng)機(jī)用煤油，適用于新型大推力運(yùn)載火箭煤油發(fā)動(dòng)機(jī)，將作為中國(guó)新一代大推力運(yùn)載火箭的主體推進(jìn)劑投入到航天發(fā)射中?；鸺河偷奶紨?shù)分布為C9～C15，目前鑒定出的組分包括烷烴(16.68%)、單環(huán)環(huán)烷烴(16.13%)、雙環(huán)環(huán)烷烴(51.51%)、三環(huán)環(huán)烷烴(1.00%)、烯烴(0.08%)、芳烴(0.86%)和含氧化合物(1.44%)7大類[1]。煤油可對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚等產(chǎn)生一定的損害作用[2-3]，但火箭煤油的毒性研究以及人體接觸和發(fā)病的資料鮮見(jiàn)報(bào)道。皮膚接觸中毒是職業(yè)作業(yè)過(guò)程中一種最常見(jiàn)且無(wú)法避免的傷害，一方面防護(hù)用品破損時(shí)火箭煤油有可能直接沾染，另一方面當(dāng)蒸汽壓下降時(shí)，火箭煤油可由氣態(tài)轉(zhuǎn)化成液態(tài)，導(dǎo)致暴露在空氣中的皮膚被沾染。皮膚接觸火箭煤油致敏性較弱，具有輕中度刺激性[4-5]，但目前尚未見(jiàn)其對(duì)免疫功能影響的研究。本研究觀察小鼠皮膚染毒火箭煤油對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響，旨在為評(píng)價(jià)皮膚接觸火箭煤油的免疫抑制作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 火箭煤油(航天一院101研究所，20110805)；二硝基氟苯(DNFB，北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司)；抗小鼠CD3-PerCP、CD4-FITC 和CD8-PE抗體(美國(guó)eBioscience公司)；碘化丙啶(PI，美國(guó)Sigma公司)；RNase(美國(guó)Sigma公司)。流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國(guó)Becton Dickinson公司)，全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀(KX21，日本SYSMEX公司)，酶聯(lián)免疫光譜分析儀(BIO-RAD680美國(guó)伯樂(lè)公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-15AC，日本三洋公司)，離心機(jī)(PrimoR，德國(guó)Heraeus公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 ICR小鼠150只，體重18～22g，雌性，購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2006-0008，動(dòng)物室通風(fēng)條件較好，溫度20～25℃，濕度40%～70%，光照12h明暗交替。遲發(fā)超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)實(shí)驗(yàn)按照小鼠體重進(jìn)行隨機(jī)分組，每組6只。第一系列實(shí)驗(yàn)為不同劑量火箭煤油皮膚1次染毒：分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組(0.5ml/kg)、中劑量組(1ml/kg)、高劑量組(2ml/kg)組；第二系列實(shí)驗(yàn)為同一劑量火箭煤油不同次數(shù)染毒(不同天數(shù)，1次/d，各組末次染毒同天完成)：分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量×1次組、低劑量×2次組、低劑量×3次組、低劑量×4次組、低劑量×5次組；第三系列實(shí)驗(yàn)為不同劑量火箭煤油多次染毒(1次/d，共5d)：分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組×5次組、中劑量組×5次組、高劑量組×5次組。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組涂抹丙酮，各劑量實(shí)驗(yàn)組涂抹相應(yīng)劑量的火箭煤油。小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和外周血淋巴細(xì)胞亞群實(shí)驗(yàn)按照小鼠體重進(jìn)行隨機(jī)分組，每組24只，分為陰性對(duì)照組和火箭煤油組，火箭煤油組采用中劑量(1ml/kg)火箭煤油1次染毒，分別于染毒后5、10、20、30d進(jìn)行檢測(cè)，每組每時(shí)間點(diǎn)6只動(dòng)物。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠皮膚染毒模型的建立 小鼠背部用電推去毛，范圍約3cm×3cm，用外科膠布粘掉殘留碎毛，定量涂抹受試物。

1.3.2 DNFB所致DTH實(shí)驗(yàn)[6]按照分組方法涂抹火箭煤油，對(duì)照組涂抹丙酮。末次涂抹3h后除陰性對(duì)照組外將50μl新鮮配制的1% DNFB溶液(丙酮:麻油=1:1)均勻涂抹于鼠背上。第2天DNFB強(qiáng)化1次。DTH的產(chǎn)生與測(cè)定：致敏后第5天，將1% DNFB溶液20μl均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進(jìn)行攻擊，攻擊后24h可見(jiàn)右耳明顯腫脹，頸椎脫臼處死小鼠，稱體重，剪下左右耳廓，用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重。同時(shí)取小鼠胸腺及脾臟稱重。腫脹度=右耳片重量－左耳片重量。腫脹率=(右耳片重量－左耳片重量)/左耳片重量×100%。脾指數(shù)=脾重(mg)/小鼠體重(g)×10。胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/小鼠體重(g)×10。

1.3.3 脾淋巴細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)[7]各組小鼠處死后無(wú)菌取脾臟，加入RPMI 1640培養(yǎng)液中研磨，過(guò)200目細(xì)胞網(wǎng)，離心，棄上清，加入1ml Tris-NH4Cl溶液裂解紅細(xì)胞5min，PBS洗2次，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ ml，將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板(100μl/孔)，每孔加入100μg/ml刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)溶液5μl(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示ConA最適作用濃度為5μg/ml)，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。另設(shè)空白對(duì)照組(每孔加100μl細(xì)胞懸液和100μl RPMI 1640培養(yǎng)液)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加MTT溶液20μl，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h，吸棄上清，加DMSO 200μl，充分振蕩均勻，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)吸光度(A)值。脾淋巴細(xì)胞增殖A值=樣本孔平均A值－空白孔平均A值。

1.3.4 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 小鼠摘眼球取血，置于EDTA抗凝采血管中，取50μl抗凝血，按照試劑說(shuō)明書(shū)加入適量CD3-PerCP、CD4-FITC和CD8-PE抗體，室溫避光放置30min，加入稀釋溶血素(1:10)溶血10min，1000r/min離心5min，PBS洗滌1次，加PBS 400μl重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。FSC/SSC淋巴細(xì)胞設(shè)R1門(mén)，CD3-PerCP/SSCT淋巴細(xì)胞設(shè)R2門(mén)，分析R1且R2門(mén)內(nèi)CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞占CD3+細(xì)胞的百分比，計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.3.5 外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) 取20μl抗凝血，加500μl細(xì)胞稀釋液稀釋，采用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀進(jìn)行分析。

1.3.6 脾臟淋巴細(xì)胞周期的分析 取1×106個(gè)脾淋巴細(xì)胞，加300μl PBS重懸，加700μl預(yù)冷無(wú)水乙醇，混合均勻，置－20℃冰箱內(nèi)固定48h以上，加2ml PBS，1000r/min離心5min，棄上清，加入100μl RNAase(100μg/ml)室溫放置10min后，加入PI溶液300μl(終濃度50μg/ml)，－4℃染色10min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。FSC/SSC散點(diǎn)圖對(duì)淋巴細(xì)胞設(shè)門(mén)，F(xiàn)L2-W/FL2-A散點(diǎn)圖去除粘連細(xì)胞，F(xiàn)L2-A直方圖區(qū)分G0/G1和G2/M期細(xì)胞，低速獲取細(xì)胞，Modifit軟件分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量火箭煤油一次染毒對(duì)DNFB所致DTH的影響 與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠耳腫脹度、腫脹率和脾指數(shù)顯著增加(P<0.05)，胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，中劑量組(1ml/kg)和高劑量組(2ml/kg)小鼠耳腫脹度和腫脹率顯著降低，胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)，且隨染毒劑量增加，變化趨勢(shì)更為明顯(表1)。

表1 不同劑量火箭煤油皮膚一次染毒對(duì)遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響(±s，n=6)Tab. 1 Suppression of delayed type hypersensitivity by different dosages of RK through one time dermal exposure (±s,n=6)

表1 不同劑量火箭煤油皮膚一次染毒對(duì)遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響(±s，n=6)Tab. 1 Suppression of delayed type hypersensitivity by different dosages of RK through one time dermal exposure (±s,n=6)

NC. Negative control; PC. Positive control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group; (2)P<0.05 compared with PC group

Group Swelling degree (g) Swelling rate (%) Spleen index (g/g) Thymus index (g/g) NC 0.58±0.31 3.24±1.45 0.441±0.030 0.330±0.274 PC 31.45±1.57(1) 186.45±9.49(1) 0.625±0.049(1) 0.239±0.030(1)RK 0.5ml/kg×1 29.8±7.01 162.77±32.48 0.613±0.048 0.267±0.033 RK 1ml/kg×1 25.7±3.4(2) 158.69±21.71(2) 0.613±0.034 0.289±0.012(2)RK 2ml/kg×1 20.28±2.1(2) 108.65±16.08(2) 0.617±0.013 0.290±0.007(2)

2.2 同一劑量火箭煤油不同次數(shù)染毒對(duì)DNFB所致DTH的影響 與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠耳腫脹度、腫脹率和脾指數(shù)顯著增加，胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低劑量×4次組小鼠脾指數(shù)顯著降低(P<0.05)，低劑量×5次組小鼠耳腫脹度、腫脹率和脾指數(shù)顯著降低，胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)，且隨染毒次數(shù)增加，變化趨勢(shì)更為明顯(表2)。

2.3 不同劑量火箭煤油多次染毒對(duì)DNFB所致DTH的影響 與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠耳腫脹度、腫脹率和脾指數(shù)顯著增加，胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低、中、高劑量×5次組小鼠耳腫脹度、腫脹率、脾指數(shù)均顯著降低，胸腺指數(shù)均顯著升高(P<0.05)，且隨染毒劑量增加，變化趨勢(shì)更為明顯(表3)。

2.4 火箭煤油皮膚染毒對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響 與陰性對(duì)照組比較，火箭煤油組染毒后10d小鼠CD4+/CD8+比值顯著降低(P<0.05)，而其余各時(shí)間點(diǎn)兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

2.5 火箭煤油皮膚染毒對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 與陰性對(duì)照組比較，火箭煤油組染毒后第5、10、20天脾淋巴細(xì)胞增殖A值顯著降低(P<0.05)，染毒后第30天兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.6 火箭煤油皮膚染毒對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞周期的影響 與陰性對(duì)照組比較，火箭煤油組小鼠脾淋巴

表2 同一劑量火箭煤油皮膚不同次數(shù)染毒對(duì)遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響(±s，n=6)Tab. 2 Suppression of delayed type hypersensitivity by same dosage of RK through different times of dermal exposure (±s,n=6)

表2 同一劑量火箭煤油皮膚不同次數(shù)染毒對(duì)遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響(±s，n=6)Tab. 2 Suppression of delayed type hypersensitivity by same dosage of RK through different times of dermal exposure (±s,n=6)

NC. Negative control; PC. Positive control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group; (2)P<0.05 compared with PC group

Group Swelling degree (g) Swelling rate (%) Spleen index (g/g) Thymus index (g/g) NC 0.80±0.29 5.73±2.39 0.407±0.0581 0.331±0.034 PC 22.93±4.90(1) 159.18±38.79(1) 0.762±0.086(1) 0.295±0.022(1)RK 0.5ml/kg×1 21.47±4.17 156.47±29.53 0.735±0.072 0.296±0.034 RK 0.5ml/kg×2 21.08±6.59 141.27±34.79 0.774±0.180 0.331±0.067 RK 0.5ml/kg×3 20.36±5.98 142.51±35.53 0.850±0.145 0.307±0.017 RK 0.5ml/kg×4 18.78±6.63 133.95±47.61 0.650±0.106(2) 0.352±0.040 RK 0.5ml/kg×5 13.38±2.06(2) 98.60±18.96(2) 0.554±0.439(2) 0.356±0.032(2)

表3 不同劑量火箭煤油多次染毒對(duì)遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響(±s，n=6)Tab.3 Suppression of delayed type hypersensitivity by different dosages of RK through different times of dermal exposure (±s,n=6)

表3 不同劑量火箭煤油多次染毒對(duì)遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響(±s，n=6)Tab.3 Suppression of delayed type hypersensitivity by different dosages of RK through different times of dermal exposure (±s,n=6)

NC. Negative control; PC. Positive control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group; (2)P<0.05 compared with PC group

?

圖1 火箭煤油皮膚染毒對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響(±s，n=6)Fig. 1 Effect of RK on T lymphocyte subsets of mice (±s,n=6)NC. Negative control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group

圖2 火箭煤油皮膚染毒對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s，n=6)Fig. 2 Effect of RK on spleen lymphocyte proliferation of mice (±s,n=6)NC. Negative control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group

細(xì)胞在染毒后第10天和第20天G0/G1期細(xì)胞百分比顯著下降，S期細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.05)，在染毒后第30天G0/G1期和S期細(xì)胞百分比與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。染毒后第10天火箭煤油組小鼠脾淋巴細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.7 火箭煤油皮膚染毒對(duì)小鼠外周血WBC和淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響 與陰性對(duì)照組比較，火箭煤油組小鼠染毒后第5、10、20天外周血WBC數(shù)顯著上升，染毒后第10、20天外周血淋巴細(xì)胞數(shù)顯著上升(P<0.05)，而染毒后各時(shí)間點(diǎn)淋巴細(xì)胞百分比兩組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

3 討 論

與傳統(tǒng)的火箭推進(jìn)劑四氧化二氮或偏二甲基肼比較，火箭煤油被認(rèn)為是一種綠色推進(jìn)劑，其安全性明顯增強(qiáng)，毒性明顯降低，但是職業(yè)接觸火箭煤油還是存在對(duì)人體產(chǎn)生危害的可能性。有文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期接觸煤油的工人白細(xì)胞數(shù)量明顯降低，淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加[2]，提示火箭煤油可能對(duì)免疫系統(tǒng)有一定影響。因此本研究采用多種方法評(píng)價(jià)火箭煤油對(duì)細(xì)胞免疫功能的抑制作用。

DTH是由CD4+Th1細(xì)胞介導(dǎo)的以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和組織細(xì)胞損傷為主要特征的細(xì)胞免疫反應(yīng)[7]，其中T細(xì)胞在移植物排斥、移植物抗宿主病、自身免疫和腫瘤免疫等方面起著關(guān)鍵作用，是機(jī)體細(xì)胞免疫功能的體現(xiàn)[8-9]。DTH動(dòng)物模型最常采用的是小鼠T細(xì)胞依賴的遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型。DNFB是一種免疫原性比較穩(wěn)定的半抗原，將其溶液涂抹皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合形成完全抗原，可刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞，4～7d后將其再次涂抹于皮膚，可使局部產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，并在抗原攻擊后24～48h到達(dá)高峰，于此時(shí)測(cè)定局部腫脹可反映遲發(fā)型皮膚超敏反應(yīng)的強(qiáng)度[6]。DTH動(dòng)物模型是檢測(cè)細(xì)胞免疫抑制最為常用的方法，通過(guò)觀察化合物作用后DTH模型小鼠耳腫脹的減輕程度，可判定該化合物在體內(nèi)對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，DTH模型小鼠背部皮膚1次染毒(1ml/kg火箭煤油)可見(jiàn)明顯免疫抑制作用(20g小鼠體表面積為0.0044m2)，經(jīng)換算，即成人皮膚接觸85ml火箭煤油1次即可產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用(70kg作業(yè)人員體表面積為1.87m2)，該劑量是作業(yè)人員日常工作中皮膚很可能接觸到的劑量；接觸火箭煤油所引起的免疫抑制效應(yīng)不僅與劑量有關(guān)，還與接觸次數(shù)有關(guān)，小鼠1次接觸0.5ml/kg火箭煤油1d，未觀察到明顯的免疫抑制效應(yīng)，但是連續(xù)5d，每天1次接觸火箭煤油，可產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用[9]，提示即使低劑量的火箭煤油也應(yīng)避免反復(fù)多次皮膚接觸。

圖3 火箭煤油皮膚染毒對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞周期的影響(n=6)Fig. 3 Effect of RK on cell cycle of spleen lymphocyte of mice (n=6)A. Proportion of cells in G0/G1phase; B. Proportion of cells in S phase; C. Proportion of cells in G2/M phase. NC. Negative control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group

圖4 火箭煤油皮膚染毒對(duì)外周血WBC和淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響(n=6)Fig. 4 Effect of RK on the number of WBC and LYM in peripheral blood of mice (n=6)A. Number of white blood cell; B. Number of lymphocyte; C. Percentage of lymphocyte. NC. Negative control; RK. Rocket kerosene. (1)P<0.05 compared with NC group

成熟的淋巴細(xì)胞經(jīng)刺激劑誘導(dǎo)發(fā)生增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程的一個(gè)重要階段。因此，檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖水平是細(xì)胞免疫研究和免疫功能檢測(cè)的一種常用方法。ConA作為多克隆刺激劑可選擇性地刺激小鼠T細(xì)胞增殖，可用于了解機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。與陰性對(duì)照組比較，小鼠背部皮膚1次染毒1ml/kg火箭煤油后第5、10、20天脾淋巴細(xì)胞增殖顯著下降，染毒后第30天仍可見(jiàn)脾淋巴細(xì)胞增殖有降低趨勢(shì)，提示小鼠1次染毒1ml/kg火箭煤油后第5天細(xì)胞免疫功能即有下降，染毒后20d仍顯著下降，染毒后30d仍有降低趨勢(shì)，表明小鼠1次染毒火箭煤油即可產(chǎn)生較長(zhǎng)時(shí)間的免疫抑制作用。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)的主要成分，外周血T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定可反映機(jī)體免疫狀態(tài)，CD4+/CD8+比值可評(píng)估機(jī)體免疫功能。與陰性對(duì)照組比較小鼠在染毒后第10天CD4+/CD8+比值顯著下降，提示染毒后第10天細(xì)胞免疫水平低下[11]。

火箭煤油染毒小鼠T細(xì)胞免疫功能下降的同時(shí)，染毒后第10天和第20天脾淋巴細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比顯著下降，S期細(xì)胞百分比顯著上升，表明與正常組小鼠比較，火箭煤油染毒后脾淋巴細(xì)胞周期分布發(fā)生了變化。正常小鼠的脾細(xì)胞周期主要是相對(duì)靜止的G0/G1期，S期細(xì)胞比例較低，而火箭煤油染毒后小鼠脾淋巴細(xì)胞的S期比例顯著增加，S期為DNA合成期，反映了細(xì)胞的增殖狀態(tài)，故該結(jié)果提示火箭煤油染毒后脾淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[12]，這與染毒后第5、10、20天小鼠外周血WBC和淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增多的結(jié)果一致，推測(cè)可能與染毒后淋巴細(xì)胞免疫功能低下所引起的代償性增生有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究在整體動(dòng)物和細(xì)胞水平對(duì)火箭煤油的免疫抑制作用進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有一定的免疫毒性。鑒于皮膚接觸火箭煤油可引起較強(qiáng)的細(xì)胞免疫抑制作用，并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，作業(yè)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格做好皮膚防護(hù)，避免皮膚沾染，其具體的免疫抑制作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Cell-mediated immune suppression effect of rocket kerosene through dermal exposure in mice

XU Bing-xin1, LIU Zhi-guo1, SI Shao-yan1, LI Cheng-lin2, LOU Xiao-tong1, YANG He-ming2, LI Jian-zhong1, WANG Jian-ying3*, CUI Yan2*1Special Medicine and Experimental Research Center,2Department of General Surgery, 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China
3Epidemic Prevention Team, General Equipment Department of PLA, Beijing 100101
*< class="emphasis_italic">Corresponding authors. WANG Jian-ying, E-mail: jiafm@sina.com; CUI Yan, E-mail: dryancui@163.com

s. WANG Jian-ying, E-mail: jiafm@sina.com; CUI Yan, E-mail: dryancui@163.com
This work was supported by the Science and Technique Foundation of Logistic Department of General Equipment Department of PLA (CZZ11C004)

ObjectiveTo study the effect of cell-mediated immune suppression effect of rocket kerosene (RK) through dermal application in mice.MethodsSkin delayed type hypersensitivity (DTH) was used to observe the relation of the RK amount the skin exposed and the cellular immune inhibitory function. Different amount of the undiluted fuel was smeared directly onto the dorsal skin of mice. Mice in negative and positive control groups were treated with acetone. After the last exposure, all the mice except those in negative control group were allergized by evenly smearing with 1% dinitrofluorobenzene (DNFB) solution on their dorsum. Five days after allergy, 1% DNFB solution was smeared onto right ear of all mice to stimulate the allergic reaction. Twenty-four hours after attack, the auricle swelling, spleen index and thymus index in corresponding mice were determined. In the first series of experiments, different dosages of RK were applied once, and the ICR mice were randomly divided into negative control group, positive control group and experimental group (0.5ml/kg.BW×1, 1ml/kg.BW×1 and 2ml/kg.BW×1 group). In the second series of experiments, the certain and same dosage of RK was applied for different times, and the ICR mice were randomly divided into negative control group, positive control group and experimental group (0.5ml/kg.BW×1, 0.5mL/kg.BW×2, 0.5ml/kg.BW×3, 0.5ml/kg.BW×4 and 0.5mL/kg.BW×5 group). In the third series of experiments, the different dosages of RK were applied morethan once, and the ICR mice were randomly divided into negative control group, positive control group and experimental group (0.5ml/kg.BW×5, 1ml/kg.BW×5 and 2ml/kg.BW×5 group). Lymphocyte proliferation experimentin vitrowas conducted to observe the persistent time of the cell-mediated immune suppression in mice by RK dermal exposure. The lymphocyte proliferation induced by concanavalin A (Con A) was analyzed by MTT assay, and T lymphocyte subsets (CD3+, CD4+and CD8+) in peripheral blood and spleen lymphocyte cell cycle were analyzed by flow cytometry.ResultsRK dermal exposure (1ml/kg.BW×1) alleviated the ear edema, suppressed the spleen index elevation and thymus index reduction caused by DNFB sensitization in ICR mice, and the suppression effect increased with exposed dosage and time increasing. RK dermal exposure (1ml/kg.BW×1) suppressed ConA-induced spleen lymphocyte proliferation, and the effect persisted for 20d (P<0.05). The CD4+/CD8+ratio in peripheral blood was lower in RK group than in negative control group (P<0.05).ConclusionDermal exposure of RK may have cell-mediated immunotoxicity.

rocket kerosene; cell-mediated immune suppression; hypersensitivity, delayed; lymphocytes

R858.3

A

0577-7402(2015)08-0671-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.14

2015-05-30；

2015-06-29)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

解放軍總裝備部后勤科研項(xiàng)目(CZZ11C004)

徐冰心，藥學(xué)博士。主要從事航天意外傷及防護(hù)方面的研究

100101 北京 解放軍306醫(yī)院特種醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心(徐冰心、劉志國(guó)、司少艷、婁曉同、李建忠)，普通外科(李成林、楊鶴鳴、崔彥)；100101 北京 總裝備部防疫大隊(duì)(王建營(yíng))

王建營(yíng)，E-mail：jiafm@sina.com；崔彥，E-mail：dryancui@163.com