蘇小四,孟祥菲,張文靜,石旭飛,何海洋

1.吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，長(zhǎng)春 130021 2.吉林大學(xué)水資源與環(huán)境研究所，長(zhǎng)春 130021 3.沈陽(yáng)地質(zhì)礦產(chǎn)研究所/中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局沈陽(yáng)地質(zhì)調(diào)查中心，沈陽(yáng) 110034

?

人工回灌過(guò)程中地下水微生物群落變化

蘇小四1,2,孟祥菲1,2,張文靜1,2,石旭飛3,何海洋3

1.吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，長(zhǎng)春 130021 2.吉林大學(xué)水資源與環(huán)境研究所，長(zhǎng)春 130021 3.沈陽(yáng)地質(zhì)礦產(chǎn)研究所/中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局沈陽(yáng)地質(zhì)調(diào)查中心，沈陽(yáng) 110034

人工回灌過(guò)程中，回灌水的注入使目的含水層地下水環(huán)境發(fā)生變化，微生物條件也會(huì)隨之改變，從而影響地下水環(huán)境質(zhì)量及水文地球化學(xué)作用。以上海市某人工回灌試驗(yàn)場(chǎng)為例，在分析人工回灌過(guò)程中水化學(xué)演化特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用DGGE技術(shù)對(duì)場(chǎng)地回灌過(guò)程中地下水中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，為評(píng)價(jià)人工回灌對(duì)地下水水質(zhì)安全的影響提供科學(xué)的理論依據(jù)。結(jié)果表明：人工回灌作用使目的含水層地下水中的Eh值及DO質(zhì)量濃度升高，分別由64.0 mV、1.12 mg/L升至534.4 mV、1.44 mg/L；同一位置處微生物群落結(jié)構(gòu)與原始地下水狀態(tài)的相似性隨時(shí)間降低；同一時(shí)刻距離回灌井越遠(yuǎn)的監(jiān)測(cè)井的微生物群落結(jié)構(gòu)越接近于原始地下水狀態(tài)。隨著回灌的進(jìn)行，目的含水層地下水中優(yōu)勢(shì)菌屬(種)共有7種，其中Rubrivivaxgelatinosus和CandidatusAccumulibacterphosphatiscladeIIAstr.的反硝化能力以及Rhodoferaxferrireducens對(duì)Fe3+的還原能力，對(duì)地下水水化學(xué)組分產(chǎn)生影響。

DGGE；人工回灌；地下水；微生物群落

0 引言

地面沉降在世界各地非常普遍，在城市尤為顯著[1]。上海是我國(guó)發(fā)生地面沉降最早、影響最大的城市[2]，地面沉降已使上海區(qū)域地貌形態(tài)發(fā)生顯著變化，威脅著上海城市安全,并制約著上海經(jīng)濟(jì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展[3]。人工回灌是防止和控制地面沉降的重要手段，同時(shí)在增加地下水資源量、防止海水入侵及儲(chǔ)能等方面得到廣泛的應(yīng)用[4-7]。然而，由于采用的回灌水源與地下水之間存在明顯的環(huán)境系統(tǒng)條件和水質(zhì)差異[4]，回灌水的注入會(huì)使原有含水層地下水環(huán)境發(fā)生改變，而含水層中原有微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨著環(huán)境的改變而發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致微生物作用下的地下水水化學(xué)組分可能會(huì)發(fā)生不同程度的變化。人工回灌后地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)變化對(duì)地下水的水質(zhì)安全存在著潛在的重要影響。

路瑩等[8]對(duì)地下水人工回灌過(guò)程中微生物堵塞的預(yù)測(cè)中提到，回灌水源中有機(jī)碳、氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度是形成微生物堵塞的關(guān)鍵因素，同時(shí)地下環(huán)境的溫度、pH及氧化還原條件也是影響微生物活動(dòng)的因素。姜桂華等[9]研究表明，天然狀態(tài)下微生物活動(dòng)相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)回灌水注入后，入滲介質(zhì)中的微生物可能在回灌水刺激下迅速繁殖，其生物體或代謝產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致微生物堵塞，造成滲透介質(zhì)導(dǎo)水能力降低。然而，目前針對(duì)人工回灌過(guò)程中地下水中微生物群落變化的具體情況的研究相對(duì)較少。

變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)法是Muyzer等[10-11]于1993年首次應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的，這一方法克服了傳統(tǒng)微生物的分離、培養(yǎng)和鑒定等工作無(wú)法客觀反映環(huán)境微生物實(shí)際情況的局限性。目前，DGGE技術(shù)已廣泛應(yīng)用于地表水、地下水以及土壤介質(zhì)中微生物群落多樣性和種群差異性等方面的分析。DGGE技術(shù)能夠提供群落中優(yōu)勢(shì)種類信息和同時(shí)分析多個(gè)樣品，具有操作方便快捷、結(jié)果可靠性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，適合于調(diào)查種群的時(shí)空變化[12-17]。

筆者以上海市某人工回灌試驗(yàn)場(chǎng)為研究場(chǎng)地，結(jié)合場(chǎng)地地質(zhì)、水文地質(zhì)條件，采用DGGE技術(shù)，考察人工回灌前后場(chǎng)地地下水中的微生物群落結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)鑒定人工回灌前后地下水中優(yōu)勢(shì)菌屬(種)，分析微生物群落結(jié)構(gòu)變化對(duì)地下水水文地球化學(xué)作用的潛在影響，以期為評(píng)價(jià)人工回灌對(duì)地下水水質(zhì)安全的影響提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 回灌場(chǎng)地概況

研究區(qū)位于上海市某人工回灌試驗(yàn)場(chǎng)地，場(chǎng)地面積約75 000 m2，采用定流量連續(xù)回灌，回灌目的層位為第IV承壓含水層。該含水層在試驗(yàn)場(chǎng)區(qū)發(fā)育較厚(約為46 m)，產(chǎn)狀近水平，巖性為含礫中粗砂夾細(xì)砂，含水層富水性較好，與上覆第III承壓含水層和下伏的第V承壓含水層間分布有較為穩(wěn)定的黏性土隔水層，水力聯(lián)系較弱[18-20]。回灌場(chǎng)地共布設(shè)有1口回灌井、10口監(jiān)測(cè)井(J1--J10)，平面上各監(jiān)測(cè)井均以回灌井為中心，沿近南北和近東西2個(gè)方向排列，并且回灌井與監(jiān)測(cè)井間距離按自然對(duì)數(shù)等間距原則布置。本次微生物試驗(yàn)取樣點(diǎn)主要集中在近南北方向的7口監(jiān)測(cè)井(J4--J10)，其距離回灌井最遠(yuǎn)為475 m，距西側(cè)中心河為10～15 m，監(jiān)測(cè)井布置近似垂直于第Ⅳ承壓含水層地下水等水位線(圖1)。監(jiān)測(cè)井與回灌井成井位置保持一致，即監(jiān)測(cè)井的濾水管埋設(shè)位置與回灌井一致。

圖1 回灌場(chǎng)地概況圖[18]Fig. 1 Sketch map of artificial recharge field[18]

1.1.2 樣品的采集與制備

采集回灌前和回灌過(guò)程中不同時(shí)間的地下水以及回灌水源進(jìn)行分析，共采集樣品16件。其中包括回灌過(guò)程中的地下水樣品14件、回灌前地下水樣品1件以及回灌水源樣品1件(各樣品采集井位及回灌時(shí)間如表1所示)。

表1 各微生物樣品采集井位和回灌時(shí)間

采集水樣時(shí)，首先利用清潔無(wú)菌塑料桶采集地下水2.5 L；然后用無(wú)菌金屬鑷子將混合纖維素膜(0.22 μm孔徑)夾至抽濾瓶口處，并將平底漏斗安裝好；再將塑料桶中的地下水倒入平底漏斗后開(kāi)始抽濾，使水樣中的微生物截留在混合纖維素膜上；抽濾結(jié)束后將平底漏斗拆下，戴上無(wú)菌手套取下混合纖維素膜，將混合纖維素膜兩次對(duì)折后裝入經(jīng)過(guò)滅菌的離心管中，貼上標(biāo)簽放入冰箱中冷藏保存待測(cè)。

1.1.3 試劑與儀器

1)藥品試劑

試劑盒：土壤總DNA提取試劑盒(power soil DNA isolation kit，MoBio)、UNIQ-10柱式PAGE膠DNA回收試劑盒(生工生物工程，上海)。

主要生化試劑： DNA引物(GC-338F和518R)、核苷酸溶液(dNTP mixture)、高溫聚合酶(Taq DNA polymerase)、標(biāo)準(zhǔn)分子量馬克(DNA marker)、無(wú)水乙醇、MgCl2、超純水、瓊脂糖H(Agarose H)、6×Loading Buffer、10×PCR Buffer、1×TAE Buffer、溴化乙錠(EB)、碳酰胺、去離子甲酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺(TEMED)、乙酸、異丙醇等。以上藥品試劑均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

2)儀器設(shè)備

主要實(shí)驗(yàn)儀器：HI98130型便攜式測(cè)試筆(意大利 哈納)、HITACHI Z-2000原子吸收光譜儀(日本 日立)、DIONEX ICS-90離子色譜儀(美國(guó) 戴安)、SW-CJ-1D 超凈工作臺(tái)(中國(guó) 蘇州凈化)、VDRTEX-5 渦旋儀(中國(guó) 海門)、SIGMA3-18K 臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó) SIGMA)、Mx3000P Stratagene實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(美國(guó) 安捷倫 Stratagene 公司)、DYY-8C電泳儀(中國(guó) 北京市六一儀器廠)、MiniBIS 凝膠成像系統(tǒng)(以色列 DNR 成像系統(tǒng)有限公司)、Dcode System 變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad 公司)等。

1.2 方法

1.2.1 水質(zhì)分析方法

1.2.2 基因組DNA的提取

使用DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。分別將待測(cè)的混合纖維素膜取出，剪碎置于PowerBead Tube中，按試劑盒中提供的操作步驟提取樣品中的DNA，記錄并于-20 ℃保存。

將提取后的DNA用1%瓊脂糖膠電泳檢查，其具體方法如下：0.5 g瓊脂糖與50 mL 1×TAE Buffer混合加熱至瓊脂糖完全熔化，待混合液冷卻至50 ℃左右時(shí)加入5 μL EB搖勻，倒入插梳子的凝膠板中；瓊脂糖完全凝固(約30 min)后，將10 μL 提取的DNA產(chǎn)物及2 μL 6×Loading Buffer混勻后注入加樣孔，在109 V、92 mA條件下電泳50 min；電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.3 基因組DNA的PCR擴(kuò)增

將提取得到的DNA作為聚合酶反應(yīng)(PCR)的模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采用16S rDNA V3區(qū)通用引物，上游引物GC-338F(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)，下游引物518R(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)。

采用50.0 μL的PCR體系，其組成為： 模板DNA1.0 μL、10×PCR Buffer 5.0 μL、MgCl24.0 μL、dNTPs 2.0 μL、上下游兩種引物各1 .0 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，再加適量的超純水補(bǔ)足50.0 μL。設(shè)定PCR的一個(gè)循環(huán)為95 ℃預(yù)變性4 min、94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，之后于72 ℃延伸10 min。將得到的PCR的產(chǎn)物按1.2.1中的方法進(jìn)行電泳檢查，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果[21-22]。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳

采用Bio-Rad公司的變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)(dcode system)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。凝膠為8%的聚丙烯酰胺，變性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～60%(其中100%的變性劑為7 mol/L的碳酰胺和40%的去離子甲酰胺的混合物)，其中變性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)從凝膠的上方到下方依次遞增[23-24]。待凝膠完全凝固后，放入裝有電泳緩沖液(1×TAE)的電泳槽中，取30 μL PCR產(chǎn)物及10 μL 6×Loading Buffer混合后，用注射器取30 μL混合液至每個(gè)加樣孔中。整個(gè)電泳系統(tǒng)于120 V電壓和60 ℃恒溫狀態(tài)下運(yùn)行400 min。電泳結(jié)束后，將凝膠在含有EB的TAE緩沖液中染色60 min，并在凝膠成像系統(tǒng)中獲取其指紋圖譜。

1.2.5 切膠回收及測(cè)序

用超純水對(duì)凝膠進(jìn)行漂洗，在紫外光照射下，選擇凝膠上10條比較亮的條帶進(jìn)行切割。將含目的DNA片段的凝膠切下，放入1.5 mL離心管中，稱質(zhì)量。采用UNIQ-10柱式PAGE膠DNA回收試劑盒(生工生物工程，上海)進(jìn)行回收，所得到的DNA溶液置于-20 °C保存。按照1.2.2中的方法對(duì)回收的溶液進(jìn)行基因組DNA的PCR擴(kuò)增，將10個(gè)條帶最終的PCR產(chǎn)物送至專業(yè)測(cè)序公司(生工生物工程，上海)進(jìn)行測(cè)序，返回得到了其中8個(gè)條帶的16S rDNA的V3區(qū)序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工回灌過(guò)程中地下水環(huán)境變化分析

S1--S16樣品的測(cè)試結(jié)果如表2所示，隨著人工回灌的進(jìn)行，地下水中TDS質(zhì)量濃度(ρ(TDS))降低，水化學(xué)類型由Cl·HCO3-Na型向HCO3-Ca·Mg和HCO3-Ca·Na型轉(zhuǎn)變。由此可見(jiàn)，人工回灌作用會(huì)對(duì)目的含水層的地下水水質(zhì)產(chǎn)生影響。由于本次研究的人工回灌目的含水層為埋深約164 m的承壓含水層，屬于還原環(huán)境，Eh值和ρ(DO)均較低(分別為64.0 mV和1.12 mg/L)，而回灌水的Eh值和ρ(DO)較高(分別為562.0 mV和8.01 mg/L)，隨著回灌的進(jìn)行，目的含水層地下水的Eh值和ρ(DO)呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢(shì)。以J4井為例(圖2)，Eh、ρ(DO)隨回灌時(shí)間波動(dòng)上升，至回灌360 h時(shí)分別達(dá)到534.4 mV和1.44 mg/L?；毓嗨淖⑷肫茐牧说叵滤嫉倪€原條件，并會(huì)促進(jìn)目的含水層地下水中好氧微生物的生長(zhǎng)與繁殖，對(duì)厭氧微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用，從而使地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。

圖2 J4井ρ(DO)、Eh隨回灌時(shí)間變化曲線Fig.2 ρ(DO) and Eh value of J4 changed over time

取樣井位樣品編號(hào)溫度/℃pH電導(dǎo)率/(μS/cm)Eh/mVρ(DO)/(mg/L)ρ(TDS)/(mg/L)水化學(xué)類型J4S123.07.441590526.40.87936.22Cl·HCO3-NaS224.17.58987525.11.08488.33HCO3·Cl-NaS323.17.80868542.11.40495.26HCO3·Cl-NaS424.17.81357534.41.44222.72HCO3-Ca·MgJ5S523.87.59869525.10.87793.10Cl·HCO3-NaS623.17.65868542.11.43532.83HCO3·Cl-NaS722.47.52663520.41.43400.65HCO3·Cl-Na·CaS822.17.73384574.51.18227.41HCO3-Ca·NaJ6S921.77.481497501.21.75865.22Cl·HCO3-NaS1022.17.41975551.81.20530.70HCO3·Cl-NaS1122.37.53778508.31.40441.46HCO3·Cl-Na·CaS1222.17.60741582.32.91396.01HCO3·Cl-Na·CaJ7S1328.07.55320564.73.17644.84HCO3·Cl-Na回灌井S1428.17.69311520.43.84186.05HCO3-Ca回灌水源S1510.27.44473562.08.01356.00HCO3·Cl-Ca·Na回灌前地下水S1623.47.51169164.01.12840.00Cl·HCO3-Na

2.2 總DNA提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

通過(guò)樣品微生物提取的總DNA在凝膠成像系統(tǒng)下拍照結(jié)果可知，各樣品均得到一條較為清晰的電泳條帶，說(shuō)明其基因組DNA提取較為有效。但是研究發(fā)現(xiàn)各樣品中的條帶亮度不盡相同，說(shuō)明各樣品基因組DNA的提取量有所不同。在相同實(shí)驗(yàn)條件和提取產(chǎn)率下，不同的基因組DNA提取量表明各樣品中的微生物總量不同，說(shuō)明人工回灌使目的含水層地下水中的微生物總量發(fā)生了變化。

對(duì)以上DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，除了空白樣外，其余各樣品均擴(kuò)增出一條鮮明的DNA條帶，且條帶較亮。與Marker比較可知，擴(kuò)增后各樣品微生物的基因片段大小約為250 bp，是16S rDNA V3區(qū)特異性片段，擴(kuò)增產(chǎn)物可作為DGGE樣品進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 各樣品16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA of different samples

2.3 DGGE圖譜的建立及聚類分析

利用Quantity one圖譜分析軟件對(duì)DGGE圖譜(圖4)進(jìn)行分析，得到各條帶分布及強(qiáng)度的示意圖如圖5所示。從圖5中可以看出：大多數(shù)地下水樣品所對(duì)應(yīng)泳道中的條帶數(shù)目較多，表明回灌目的含水層地下水中微生物種群豐富；不同泳道間的條帶存在著一定的差異，體現(xiàn)在條帶數(shù)量、條帶位置和條帶亮度等方面，表明人工回灌過(guò)程使目的含水層地下水中的微生物的數(shù)量以及群落多樣性發(fā)生了變化[25]。

圖4 各樣品中微生物的DGGE圖譜Fig.4 DGGE profile of different microorganism samples

圖5 各樣品中微生物DGGE圖譜的條帶示意圖Fig.5 DGGE sketch map of different microorganism samples samples

根據(jù)Quantity one生成的相似矩陣(表3)，采用UPGMA法對(duì)DGGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，建立場(chǎng)地微生物群落的系統(tǒng)樹(shù)(圖6)。

圖6 各樣品微生物種群相似性的UPGMA聚類分析Fig.6 Cluster analysis (UPGMA) of the similarity of different

由聚類分析可知，16個(gè)樣品共分為兩大族群，族群間相似性為23%。其中：S15與S14族群內(nèi)相似性為45%，二者分別為回灌水和回灌井樣品；其余為原始地下水和各監(jiān)測(cè)井地下水樣品，在相似性39%以上的水平上相似。后者中的S1與S16的相似性最高，為67%，其中S16表征回灌目的含水層地下水的原始狀態(tài)，S1則是J4在回灌10 h后所取的地下水樣品，即距回灌井最近且回灌時(shí)間最短的樣品。這二者的相似度高說(shuō)明，回灌初始目的含水層地下水中的微生物群落結(jié)構(gòu)雖然已發(fā)生變化，但是由于回灌時(shí)間較短，J4位置的微生物群落結(jié)構(gòu)仍與原始地下水的具有較高的相似性。

圖7 J4井相似系數(shù)隨回灌時(shí)間變化曲線Fig.7 Similarity coefficient of J4 changed over time

以J4為例，研究每口井在不同回灌時(shí)間相對(duì)S16的相似系數(shù)的變化趨勢(shì)，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，隨著人工回灌的進(jìn)行，J4目的含水層地下水中微生物相對(duì)S16的相似系數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，即同一位置處地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)隨回灌時(shí)間的延長(zhǎng)與原始地下水狀態(tài)的相似性降低。由此說(shuō)明，人工回灌作用使目的含水層地下水中微生物生存環(huán)境發(fā)生了改變，原始狀態(tài)下的一些微生物無(wú)法適應(yīng)新的環(huán)境而逐漸被抑制、淘汰，同時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生某些新的微生物，故其與原始地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性降低。同時(shí)由圖7可知，J4井各時(shí)間點(diǎn)的相似系數(shù)在前48 h內(nèi)減小速率快，隨后減緩。分析其原因則是隨著人工回灌時(shí)間的延長(zhǎng)，地下水中回灌水的比例逐漸增高，待一定時(shí)間后地下水幾乎全部被回灌水所代替，微生物生存環(huán)境變化的程度及速率均減小，因此J4地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)相對(duì)原始地下水的相似性變化減緩。

不同監(jiān)測(cè)井在同一回灌時(shí)刻(以360 h為例)相對(duì)S16的相似系數(shù)空間變化規(guī)律如圖8所示。由圖8可以看出，在人工回灌進(jìn)行了一定時(shí)間后，隨著與回灌井距離的增加，其相似系數(shù)也呈上升的趨勢(shì)，即同一時(shí)刻，距離回灌井越遠(yuǎn)的井目的含水層地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)越接近于原始地下水狀態(tài)。這是因?yàn)樵谙嗤幕毓鄷r(shí)刻，距離回灌井越遠(yuǎn)的井，其目的含水層地下水接受回灌水混合作用的時(shí)間相對(duì)越短，微生物生存環(huán)境變化越微弱，微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性改變?cè)叫?，所以?huì)顯示出比距離較近的監(jiān)測(cè)井更為接近原始地下水的的微生物群落結(jié)構(gòu)特征。

2.4 優(yōu)勢(shì)菌屬(種)的鑒定及作用分析

利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST 進(jìn)行序列同源性比對(duì)，結(jié)果如表4所示。

表3 各樣品微生物種群相似系數(shù)

表4 DGGE切膠回收基因片段序列的比對(duì)結(jié)果

圖8 360 h時(shí)各井相似系數(shù)隨距離變化曲線Fig.8 Similarity coefficient of 360 h changed with distance

一般微生物16S rDNA序列同源性小于95%，可認(rèn)為屬于不同屬；同源性小于98%，可認(rèn)為屬于不同種[26]。本次人工回灌過(guò)程中，目標(biāo)含水層地下水中優(yōu)勢(shì)菌屬(種)共有7種，包括Acinetobactersp.，Rhodoferaxferrireducens，CandidatusAccumulibacterphosphatiscladeIIAstr.，Rubrivivaxgelatinosus，Riemerellaanatipestifer，Sphingobiumsp.和CandidatusSaccharimonasaalborgensis。

由表4可知，f和h條帶與GenBank中已有菌種同源性為98%，三者屬同一種，即Sphingobiumsp.，它對(duì)芳香族化合物能起到有效的降解作用[27]，在場(chǎng)地地下水樣品中分布廣泛。Acinetobactersp.在各地下水樣品中幾乎均有分布，在回灌水樣品中也有清晰的條帶，說(shuō)明該菌屬在場(chǎng)地的地下水系統(tǒng)和研究區(qū)的自來(lái)水中占有一定優(yōu)勢(shì)[28]。Riemerellaanatipestifer在S6和S8樣品中有清晰的條帶，CandidatusSaccharimonasaalborgensis在S10、S11和S12樣品中有清晰的條帶，說(shuō)明二者分別集中分布于J5、J6監(jiān)測(cè)井位置處的地下水中。

Rhodoferaxferrireducens是一種兼性厭氧菌，它在土壤和沉積物的碳以及金屬循環(huán)中起著重要的作用。它可在地下低溫環(huán)境中生存，并利用Fe3+作為電子受體對(duì)有機(jī)物進(jìn)行氧化，實(shí)現(xiàn)土壤及沉積物中Fe3+的還原[30]。該菌屬在回灌水樣品中條帶清晰度較差，在地下水樣品中分布較廣，尤其在S1和S5中較為清晰，說(shuō)明J4和J5監(jiān)測(cè)井回灌最初該菌屬較為富集，隨后其光密度強(qiáng)度減弱。林學(xué)鈺等[18]在人工回灌對(duì)地下水水質(zhì)影響的室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，回灌后Fe質(zhì)量濃度明顯升高并超過(guò)回灌水中的質(zhì)量濃度值，說(shuō)明地下水中的Fe質(zhì)量濃度受到了回灌過(guò)程中混合作用和含水層礦物組分溶出的影響。石旭飛[31]在不同微生物條件下的人工回灌室內(nèi)模擬試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，模擬地下水溶液中，未滅菌溶液總Fe和Fe2+達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量濃度高于滅菌后的質(zhì)量濃度，即微生物的存在有助于介質(zhì)中含F(xiàn)e礦物的溶出。通過(guò)筆者對(duì)微生物菌屬(種)的鑒定及分析研究也可驗(yàn)證，目的含水層地下水中微生物的存在會(huì)對(duì)水中Fe的質(zhì)量濃度變化產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

1)人工回灌過(guò)程中，目的含水層地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)變化研究和微生物種類的分布及作用研究，可通過(guò)PCR-DGGE及相應(yīng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

2)隨著人工回灌的進(jìn)行，地下水中TDS質(zhì)量濃度降低，水化學(xué)類型由Cl·HCO3-Na型向HCO3-Ca·Mg和HCO3-Ca·Na型轉(zhuǎn)變，人工回灌對(duì)目的含水層的地下水水質(zhì)產(chǎn)生影響。同時(shí)，地下水的Eh值和DO質(zhì)量濃度隨著回灌的進(jìn)行而逐漸增加，地下水環(huán)境發(fā)生改變，從而使地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。

3)隨著人工回灌的進(jìn)行，同一監(jiān)測(cè)井處目的含水層地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)與原始地下水狀態(tài)的相似性降低；同一時(shí)刻，距離回灌井越遠(yuǎn)的監(jiān)測(cè)井目的含水層地下水中微生物群落結(jié)構(gòu)越接近于原始地下水狀態(tài)。人工回灌作用使目的含水層地下水中微生物生存環(huán)境發(fā)生了改變，回灌時(shí)間越長(zhǎng)改變?cè)酱?；距離回灌井越遠(yuǎn)，受回灌水混合作用的時(shí)間相對(duì)越短，微生物生存環(huán)境變化越微弱。

4)人工回灌過(guò)程中，目的含水層地下水中微生物種類較多，優(yōu)勢(shì)菌屬(種)包括Acinetobactersp，Rhodoferaxferrireducens，CandidatusAccumulibacterphosphatiscladeIIAstr. ，Rubrivivaxgelatinosus，Riemerellaanatipestifer，Sphingobiumsp和CandidatusSaccharimonasaalborgensis。其中：CandidatusAccumulibacterphosphatiscladeIIAstr. 和Rubrivivaxgelatinosus的反硝化能力會(huì)對(duì)回灌目的含水層地下水中三氮的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響；Rhodoferaxferrireducens還原地下水中的Fe3+，結(jié)合回灌過(guò)程中混合作用和含水層礦物組分溶出作用，使地下水中Fe的質(zhì)量濃度發(fā)生變化。

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Change of the Groundwater Microbial Community During Artificial Recharge Process

Su Xiaosi1,2, Meng Xiangfei1,2, Zhang Wenjing1,2, Shi Xufei3, He Haiyang3

1.CollegeofEnvironmentandResources,JilinUniversity,Changchun130021，China2.InstituteofWaterResourcesandEnvironment,JilinUniversity,Changchun130021，China3.ShenyangInstituteofGeologyandMineralResources/ShenyangCenterofGeologicalSurvey,ChinaGeologicalSurvey,Shenyang110034,China

The injection of the recharge water changes the groundwater environment and the microenvironment of the objective aquifer, and influences the groundwater environment quality and the hydrogeochemical process during the artificial recharging process. We used the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technology to study the change of the groundwater microbial community based on the analysis of the hydrochemistry characteristic and provideda scientific basis for evaluating the effect of groundwater quality by the artificial recharge. The results show that the artificial recharge makes theEhand DO value of the objective aquifer groundwater increase from 64.0 mV and 1.12 mg/L to 534.4 mV and 1.44 mg/L, the microbial community similarity between the groundwater of the monitoring well and the original groundwater decreases over time but increases with distance. Seven types of microorganisms are identified in the groundwater samples of the objective aquifer, the denitrification ofRubrivivaxgelatinosusandCandidatusAccumulibacterphosphatiscladeIIAstr.and the Fe (III) reduction ofRhodoferaxferrireducensinfluence the chemical composition of the groundwater.

DGGE; artificial recharge; groundwater; microbial community

10.13278/j.cnki.jjuese.201502206.

2014-04-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41103045)

蘇小四(1971--)，男，教授，博士，主要從事同位素水文地球化學(xué)和水資源評(píng)價(jià)研究，E-mail:suxiaosi@126.com

張文靜(1980--)，女，副教授，博士，主要從事地下水污染模擬與防治研究，E-mail:zhangwenjing80@126.com。

10.13278/j.cnki.jjuese.201502206

P641.8

A

蘇小四,孟祥菲,張文靜,等.人工回灌過(guò)程中地下水微生物群落變化.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):地球科學(xué)版,2015,45(2):573-583.

Su Xiaosi, Meng Xiangfei, Zhang Wenjing，et al.Change of the Groundwater Microbial Community During Artificial Recharge Process.Journal of Jilin University:Earth Science Edition,2015,45(2):573-583.doi:10.13278/j.cnki.jjuese.201502206.