王 蕾，張 娟，魏麗娟，劉林德

（1 魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025；2 魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025）

香豆素是一類廣泛存在于高等植物中的次生代謝產(chǎn)物，特別是在傘形科、蕓香科、豆科、菊科、瑞香科和木犀科中含量較高［1－2］。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，香豆素類化合物是一種具有苯丙α－吡喃酮核的順式鄰羥基肉桂酸內(nèi)酯。最近大量的科學(xué)研究顯示，香豆素及其衍生物在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)發(fā)揮著重要作用［3－5］。在真菌或者微生物侵染的植物中香豆素會(huì)大量積累，這表明香豆素可能與植物抗逆的防御性反應(yīng)存在著聯(lián)系［4］；許多傳統(tǒng)中草藥，如前胡、蛇床子、祖師麻、花椒、秦皮、枳實(shí)等，其活性成分就是香豆素及其衍生物［6－8］，它們?cè)谙住⒖咕?、抑制血栓形成、抗凝血?jiǎng)?、抗腫瘤、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)和降低血壓等方面臨床療效顯著［9－10］；在工業(yè)方面，香豆素因其特殊味道被用于制造香水、香皂和調(diào)味劑［11］。

香豆素在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)的重要性使得越來(lái)越多的研究聚焦于香豆素的合成和提取，但由于工業(yè)合成的復(fù)雜性和高成本，香豆素在植物中的合成開(kāi)始受到人們的關(guān)注。香豆素結(jié)構(gòu)種類繁多，植物體內(nèi)許多酶參與了其合成，其生物合成途徑是植物苯丙氨酸代謝途徑的一個(gè)分支，其中阿魏酰輔酶A 6′位的羥基化至關(guān)重要。最近的研究發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞色素單加氧酶P450是呋喃香豆素生物合成的關(guān)鍵酶，其作用機(jī)理是催化傘形花內(nèi)酯6位或者8位異戊烯化后的羥基化［12－14］。在擬南芥香豆素生物合成途徑中，對(duì)香豆酸－3′－羥化酶催化對(duì)－香豆酰－CoA 3′位羥基化，進(jìn)而生成咖啡酰輔酶A；接著咖啡酰輔酶A 氧甲基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)修飾3′位置上氧甲基化產(chǎn)生阿魏酰輔酶A，然后一個(gè)依賴于Fe（Ⅱ）和2－酮戊二酸的雙加氧酶催化阿魏酰輔酶A 6′位的羥基化，因此該酶被命名為F6′H；上述反應(yīng)產(chǎn)物6－羥基阿魏酰輔酶A 最終通過(guò)順式／反式異構(gòu)化和內(nèi)酯化生成香豆素［15］。

本研究從大豆中克隆了1 個(gè)擬南芥AtF6′H1基因的同源基因，通過(guò)酶學(xué)特性分析其催化活性，并分析在擬南芥Atf6′h1突變體中過(guò)量表達(dá)對(duì)植株中香豆素的含量的影響。探討不同植物中F6′H同源基因可能存在的作用或調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1．1 植物材料和生長(zhǎng)條件

大豆‘黑農(nóng)35號(hào)’種子2012年5月初播種于盆中，置于光照培養(yǎng)箱（28±1）℃，16h光照（5：00～21：00），8h 暗培養(yǎng)，在結(jié)莢期分別取同一植株的根、莖、葉和莢果液氮速凍后存于－80℃待用。

擬南芥（Col 0、突變體和轉(zhuǎn)基因）種子常規(guī)表面消毒后播種于MS固體培養(yǎng)基上，4℃處理2～3d后置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)［（21±1）℃，濕度為75%，光照時(shí)間同上所述］。幼苗約高為1～2cm 時(shí)，在無(wú)菌條件下分別移植于終濃度為100μmol／L 2，4－D、水楊酸和激動(dòng)素的MS固體培養(yǎng)基中，然后依次在處理0h、12h、24h、48h時(shí)分別取地上部分和根部材料，液氮速凍。

1．2 方 法

1．2．1 大豆GmF6′H1基因克隆及其EST 序列分析 在大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）中找到一個(gè)擬南芥AtF6′H1（At3g13610）和AtF6′H2（At1g55290）［15］的同源序列，根據(jù)該序列信息，在開(kāi)放閱讀框兩端分別設(shè)計(jì)GmF6′H1正向引物GmF6′H1－F（atgtcttccactcccaccaatctc）和反向引物GmF6′H1－R（tcatatcatggcaaattcaatag）。

取大豆新鮮葉片約1g，提取總RNA。大豆總RNA 提取采用Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit試劑盒（Qiagen，Cat．No．74903），具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。cDNA 第一鏈合成采用寶生物公司PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（寶生物，DRR047S）試劑盒并參考其使用說(shuō)明進(jìn)行操作，以合成的第一鏈cDNA 為模板，以GmF6′H1－F和GmF6′H1－R 為引物，利用普洛麥格公司的GoTaq? DNA 聚合酶（普洛麥格，M3005）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增所得PCR 產(chǎn)物與pGM－T 載體（天根公司，VT302）連接后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，鑒定正確后送公司測(cè)序（華大公司）。序列的比對(duì)和同源比較利用Vector NTI軟件（Invitrogen）進(jìn)行分析。

1．2．2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析 分別提取液氮速凍收集的大豆各種材料總RNA，DNase I處理以消除基因組DNA 污染。第一鏈cDNA 合成見(jiàn)1．2．1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析采用天根公司SYBRGreen using RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒（TIANGEN，China，F(xiàn)P202）。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，58℃退火15s，68℃延伸40s；35個(gè)循環(huán)。通過(guò)比較循環(huán)閾值法進(jìn)行初始轉(zhuǎn)錄物濃度估算［16］，大豆Ubiquitin基因（D28123）作為內(nèi)標(biāo)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所用的引物如下：大豆Ubiquitin（D28123）利用Ubiquitin－F（tctgacaccattgacaatgtg）和 Ubiquitin－R（cttctggatgttgtagtcagc）；大豆GmF6′H1利用GmF6′H1－F 和GmF6′H1－R。

1．2．3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建和重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 利用帶有特殊限制性酶切位點(diǎn)的引物GmF6′H1－BamHⅠF（aaggatccatgtcttccactcccaccaatc）和GmF6′H1－XhoⅠR（aactcgagtcatatcatggcaaattcaatag）擴(kuò)增GmF6′H1基因編碼區(qū)。用BamHⅠ、XhoⅠ對(duì)GmF6′H1基因PCR 產(chǎn)物和表達(dá)載體pET32a分別進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段。利用T4DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR 和酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序，確保重組表達(dá)載體的正確性，最終獲得正確的重組表達(dá)載體pET32a－GmF6′H1。

利用CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將pET32a－GmF6′H1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌TransBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。利用菌落PCR 對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，鑒定正確的單菌落進(jìn)一步誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。帶有pET32a－GmF6′H1質(zhì)粒的大腸桿菌BL21單菌落接種于含有100ng／mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。然后將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液以1∶100的比例接種于50 mL含有100ng／mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600達(dá)0．3 左右。此時(shí)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入20℃搖床中培養(yǎng)1h后加入終濃度為0．5mmol／L IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)完成的菌液4 000g、4℃離心10min收集菌體細(xì)胞，然后用冰冷的裂解緩沖液［50mmol／L Tris－Cl，pH 8．0，0．25mmol／L NaCl，1 mmol／L DTT，1 mmol／L EDTA，0．25 mmol／L PMSF（使用前加入）］重懸，超聲波破碎后，4℃離心10 min，上清上樣于Ni－Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（康為世紀(jì)，CW0894）層析柱，沖洗3遍后，用溶解緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白。純化的蛋白質(zhì)的濃度利用生工生物公司的Modified Bradford Protein Assay Kit（生工生物，SK3041）試劑盒進(jìn)行測(cè)定，取少量蛋白質(zhì)用于聚丙酰胺凝膠電泳檢測(cè)，純化的目的蛋白立即用于酶活性鑒定。

1．2．4 GmF6′H1的酶活性分析 GmF6′H1的酶活性分析參照Kai等［15］的文獻(xiàn)。100μL 酶反應(yīng)體系中包含1．2μg蛋白，100mmol／L Tris／HCl，pH 6．5，1．0 mg／mL BSA，0．5 mmol／L FeSO4，5 mmol／L 2－酮 戊二酸鈉，5 mmol／L 抗壞血酸鈉，1 mmol／L阿魏酰輔酶A，30℃反應(yīng)1 min。反應(yīng)完成后，加入20μL 3mol／L NaOH 放置于37℃10 min以終止反應(yīng)，然后加入20μL 醋酸。反應(yīng)混合物15 000g 離心10 min，上清進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）分析。HPLC分析的條件為C18柱，流動(dòng)相為25%（體積比）的甲醇（含有0．1%的甲酸），流速為每分鐘1．0 mL，溫度為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為348 nm。酶的活性鑒定所用的試劑均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，阿魏酰輔酶A 來(lái)自于余曉丹博士的饋贈(zèng)。

1．2．5 植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建 擬南芥Atf6′h1的突變體（SALK＿129938）購(gòu)置于美國(guó)Salk研究所基因組分析實(shí)驗(yàn)室（Ohio State University，Columbus，OH，USA）。依據(jù)T－DNA 插入鑒定的原理（http：／／signal．salk．edu／tdnaprimers．2．html），在線設(shè)計(jì)3條引物L(fēng)Bb1．3（ATTTTGCCGATTTCGGAAC）、LP（GGTCGGGATTCTAATCTCAGC）和RP（AGAAGATGGTGAGGAGGCTTC）以篩選鑒定突變體純合系。

載體p1300－35S－GmF6′H1用于在擬南芥突變體Atf6′h1中過(guò)量表達(dá)GmF6′H1。利用PCR 從已測(cè)序正確的T－GmF6′H1 擴(kuò)增GmF6′H1 編碼區(qū)，擴(kuò)增引物帶有特異的限制性酶切位點(diǎn)BamHⅠ和SalⅠ，PCR 片段分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的質(zhì)粒pCambia1300進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR 和酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒利用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101以備植物轉(zhuǎn)化侵染。

1．2．6 植物轉(zhuǎn)化 擬南芥轉(zhuǎn)化方法參照Bent［17］的方法。擬南芥Atf6′h1突變體種子4℃春化2～3d后播種于用B5 營(yíng)養(yǎng)液浸泡過(guò)的含有蛭石的種植盆，隨后于23℃培養(yǎng)。待植物開(kāi)花后，剪去其主枝頂端，促側(cè)枝發(fā)展。在剪枝后的4～6d內(nèi)，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。將植株倒置于含p1300－35S－GmF6′H1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化緩沖液的玻璃瓶中，維持30s，取出種植盆，在暗處保濕側(cè)放24h，然后將種植盆直立，按正常的方法培育植株至結(jié)實(shí)，收獲成熟種子。

轉(zhuǎn)基因植株的純合系篩選參照文獻(xiàn)［18］進(jìn)行，轉(zhuǎn) 基因植 株DNA提取采用CTAB法［18］。PCR 鑒定時(shí)分別利用潮霉素和GmF6′H1 的特異引物檢測(cè)，反應(yīng)體系為DNA 模板1μL，10×PCR 緩沖液2 μL，2．5mmol／L dNTP 0．4μL，10μmol／L 的正反向引物各1μL，rTaq1U，ddH2O 補(bǔ)齊到20μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s；72℃延伸1．5min；35個(gè)循環(huán)后，72℃總延伸10min。

1．2．7 香豆素的定量分析 擬南芥植株中香豆素含量的測(cè)定方法見(jiàn)文獻(xiàn)［19］，植物材料液氮研磨后懸浮在冰冷的甲醇中22h，甲醇溶液中含有4－羥甲香豆素作為內(nèi)標(biāo)。提取液15 000g離心10min，上清用于HPLC分析，分析條件見(jiàn)1．2．4。

2 結(jié)果與分析

2．1 大豆GmF 6′H 1的克隆

用擬南芥AtF6′H1（At3g13610）和AtF6′H2（At1g55290）［5，15］的基因序列BLAST搜索大豆的EST 據(jù)庫(kù)（Gene Index），檢測(cè)到一個(gè)EST 片段（TC440182）與擬南芥AtF6′H1和AtF6′H2一致性高達(dá)60%，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它一致性更高的EST 序列。序列分析顯示TC440182具有完整的開(kāi)放閱讀框，把該基因命名為GmF6′H1。利用該序列BLAST 搜索大豆基因組文庫(kù)（NCBI，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／），在染色體18和8上均發(fā)現(xiàn)了GmF6′H1基因片段，這表明GmF6′H1基因具有2個(gè)基因拷貝，由于大豆是四倍體的雙子葉植物，因此一個(gè)基因在基因組中很可能存在著多個(gè)拷貝。基因組序列和cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GmF6′H1和AtF6′H1以及AtF6′H2 具有相同的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。氨基酸序列比對(duì)顯示（圖1），GmF6′H1和AtF6′H1以及AtF6′H2分別具有54%和53%一致性。根據(jù)得到的序列信息設(shè)計(jì)特異引物，利用RT－PCR 擴(kuò)增GmF6′H1全長(zhǎng)cDNA 序列，PCR 擴(kuò)增片段，連接pGEM－T 載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽(yáng)性克隆鑒定正確后送公司測(cè)序。該基因序列已經(jīng)上傳NCBI（KJ463390）。多次測(cè)序結(jié)果顯示，該基因與NCBI基因組文庫(kù)中的相應(yīng)序列有一個(gè)氨基酸的差異，這有可能是基因來(lái)源的大豆品種不同造成的。

大豆GmF6′H1氨基酸序列分析顯示，該蛋白具有一個(gè)2OG－Fe（Ⅱ）氧化酶超級(jí)家族的保守區(qū)域。在其N－末端有一個(gè)非血紅素雙脫氧酶區(qū)域，該區(qū)域也是依賴于2－酮戊二酸和Fe（Ⅱ）雙氧化酶活性的蛋白保守區(qū)段。該蛋白還具有一個(gè)2OGD 超級(jí)家族保守的Fe（Ⅱ）結(jié)合區(qū)域H225－X－D227－Xn－H283，AtF6′H1也有該區(qū)域。另外，在GmF6′H1中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)結(jié)合C5 羧基基團(tuán)的保守區(qū)域（R293－X－S295）。利用Swiss－Model工作站，根據(jù)推斷的氨基酸序列，預(yù)測(cè)了GmF6′H1、AtF6′H1和AtF6′H2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，這3個(gè)蛋白具有非常相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)［20］，這也暗示了GmF6′H1可能和AtF6′H1以及AtF6′H2具有相同的酶學(xué)特性，GmF6′H1可能是大豆香豆素合成途徑中的關(guān)鍵酶。

圖1 大豆與擬南芥F6′H 氨基酸序列同源性分析Fig．1 Amino acid alignment of GmF6′H1with AtF6′H1and AtF6′H2fromArabidopsis

2．2 GmF 6′H 1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式分析

以大豆Ubiquitin基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)定量PCR 研究了GmF6′H1 在各個(gè)組織器官中的表達(dá)模式，結(jié)果（圖2）表明，GmF6′H1在大豆的根中表達(dá)量最高，這暗示著大豆根中的香豆素含量最高。對(duì)擬南芥的研究也發(fā)現(xiàn)，香豆素類物質(zhì)東莨菪素及其吡喃葡萄糖苷東莨菪苷在野生型的根中含量最高，是地上部分的180倍，這間接印證了香豆素類物質(zhì)東莨菪素及其衍生物主要在植物的根系中發(fā)揮重要作用，可能與植物的抗逆反應(yīng)機(jī)制有一定的關(guān)系，相關(guān)的研究也發(fā)現(xiàn)，真菌和微生物侵染的植物根系會(huì)有香豆素類物質(zhì)的大量積累［21－22］。在大豆的其它組織器官中，GmF6′H1基因的表達(dá)量也相對(duì)較高，而在擬南芥中AtF6′H1和AtF6′H2主要在根部表達(dá)，在地上部分的表達(dá)量極低，幾乎檢測(cè)不到，但是2，4－D 的處理能夠誘導(dǎo)AtF6′H2 在地上部分的表達(dá)。這暗示著不同植物F6′H 的作用和調(diào)控機(jī)制存在差異，它們可能有不同的底物特異性，這需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行印證。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)研究了不同處理對(duì)大豆GmF6′H1轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響。分別用2，4－D、水楊酸和激動(dòng)素處理了播種10d左右的大豆幼苗，取材時(shí)間為處理0、12、24 和48h。取材時(shí)分地上部分和根部，液氮速凍。然后分別提取各部分、各時(shí)間段材料的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。結(jié)果顯示，2，4－D 的處理對(duì)大豆GmF6′H1的表達(dá)影響很小。但是水楊酸和激動(dòng)素的處理均顯著提高了該基因的表達(dá)水平，然而隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，GmF6′H1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平穩(wěn)定下降，最后接近處理前的水平（圖3）。這暗示了GmF6′H1基因在大豆生物抗逆中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)也說(shuō)明了植物對(duì)逆境的適應(yīng)性，當(dāng)逆境脅迫達(dá)到一定時(shí)間后，植物會(huì)通過(guò)調(diào)控自身基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)逆境，繼續(xù)保持穩(wěn)定的生長(zhǎng)。

圖2 大豆不同器官中GmF 6′H 1PCR 分析Fig．2 Expression pattern of GmF 6′H 1in different organs of soybean revealed by real－time PCR

2．3 GmF6′H1酶活性鑒定

帶有組氨酸標(biāo)簽的GmF6′H1在大腸桿菌中表達(dá)后，利用Ni－NTA 瓊脂糖層析柱純化重組蛋白，GmF6′H1在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)和純化的蛋白見(jiàn)圖4。然后通過(guò)測(cè)定該蛋白是否能夠催化底物的鄰位羥基化來(lái)驗(yàn)證其酶學(xué)特性。以不加蛋白的反應(yīng)混合物為陰性對(duì)照，當(dāng)以阿魏酰輔酶A 為底物時(shí)，一個(gè)鄰位羥基化的產(chǎn)物通過(guò)經(jīng)反式／順式異構(gòu)化和內(nèi)酯化的自發(fā)過(guò)程生成了東莨菪素。HPLC檢測(cè)到一個(gè)產(chǎn)物的吸收峰，該吸收峰的紫外吸收光譜與東莨菪素相似（圖5）。這些結(jié)果表明，大豆GmF6′H1能夠催化阿魏酰輔酶A鄰位的羥基化，屬于依賴于Fe（Ⅱ）和2－酮戊二酸依賴的雙加氧酶。

圖3 水楊酸（A）和激動(dòng)素（B）處理后地上部和根中GmF 6′H 1表達(dá)Fig．3 Expression pattern of GmF 6′H 1under the treatments of alicylic acid（A）and kinetin（B）

圖4 GmF6′H1蛋白表達(dá)和純化的SDS－PAGE檢測(cè)Fig．4 SDS－PAGE analysis of the expression of GmF6′H1

2．4 GmF6′H1參與植物香豆素合成的功能分析

為了更好地理解GmF6′H1的功能，在擬南芥Atf6′h1突變體中過(guò)量表達(dá)了大豆的GmF6′H1，以便觀察該蛋白是否能把擬南芥的突變體恢復(fù)成野生型。在35S啟動(dòng)子下的GmF6′H1通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入擬南芥Atf6′h1突變體植株。共獲得5個(gè)獨(dú)立的RT－PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)基因系，轉(zhuǎn)基因擬南芥與Atf6′h1突變體植株外在表型沒(méi)有觀察到明顯的差異（圖6）。依據(jù)文獻(xiàn)［19］提供的方法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株根系的香豆素含量，同時(shí)提取擬南芥野生型和擬南芥Atf6′h1 突變體根系香豆素作為對(duì)照。HPLC分析結(jié)果（圖7）顯示，GmF6′H1過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系根中香豆素的含量相比較擬南芥突變體本身有所提高，與野生型擬南芥中香豆素含量接近。這表明GmF6′H1與AtF6′H1有相似功能，均在香豆素生物合成的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。擬南芥野生型和突變體含量比較與已發(fā)表的結(jié)論相似［15］。

圖5 大豆GmF6′H1酶活性鑒定的HPLC分析Fig．5 HPLC profiles of extracts from different reaction systems

圖6 擬南芥突變體與轉(zhuǎn)基因株系表型Fig．6 The phenotype comparison among Arabidopsis

圖7 各材料根系中香豆素的含量比較Fig．7 Coumarin content in roots from different plants

3 討 論

盡管目前很多研究顯示香豆素及其衍生物在植物對(duì)病原菌的抗逆過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但是其機(jī)制并不清楚，很多植物香豆素合成的關(guān)鍵酶尚未知曉，而香豆素本身的醫(yī)療作用已經(jīng)使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注它。為了更深入地理解香豆素在植物中的作用，本研究獲得了1個(gè)大豆的香豆素合成關(guān)鍵基因GmF6′H1，并通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)研究了其酶學(xué)生化特性，同時(shí)利用基因的表達(dá)模式分析和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)探索了其在植物中的生物學(xué)功能。

在過(guò)去的幾十年里，大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越來(lái)越受到人們的關(guān)注，其次生代謝的研究已經(jīng)非常深入，然而在大豆植物化學(xué)物質(zhì)中，異黃酮是目前討論最多的“健康促進(jìn)因子”，而香豆素卻并沒(méi)有引起足夠的重視。由于香豆素在植物抗逆反應(yīng)中也發(fā)揮著一定的作用，因此探索植物香豆素合成的關(guān)鍵酶顯得至關(guān)重要。同異黃酮相似，香豆素也是一組苯酚類次生代謝物，并且其生物合成途徑也是苯丙氨酸代謝途徑的一個(gè)分支。苯丙氨酸生物合成途徑起始于L－苯丙氨酸，該氨基酸經(jīng)苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸－4－羥化酶、4－香豆酸：輔酶A 連接酶、香豆酸－3′－羥化酶、咖啡酰輔酶A 氧甲基轉(zhuǎn)移酶被催化生成阿魏酰輔酶A。接著阿魏酰輔酶A 經(jīng)過(guò)鄰位的羥基化，以及反式／順式異構(gòu)化和內(nèi)酯化的過(guò)程，最終生成香豆素類物質(zhì)東良菪素，其中后兩步的過(guò)程是自發(fā)的，不需要酶的催化，因此鄰位羥基化是植物中香豆素合成的關(guān)鍵步驟［15］。目前僅在擬南芥中報(bào)道發(fā)現(xiàn)了一個(gè)催化鄰位羥基化的香豆素生物合成關(guān)鍵酶AtF6′H1。該酶是一個(gè)依賴于Fe（Ⅱ）和2－酮戊二酸的雙加氧酶，能夠催化阿魏酰輔酶A 的6′位羥基化生成東良菪素［15］。在大豆中，利用同源克隆的方法獲得了1個(gè)擬南芥的同源基因GmF6′H1。氨基酸序列比對(duì)的分析結(jié)果顯示，該酶與擬南芥AtF6′H1、AtF6′H2 的一致性很高。分別利用GmF6′H1、AtF6′H1和AtF6′H2氨基酸序列進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，GmF6′H1 和擬南芥AtF6′H1、AtF6′H2 具有相似的空間結(jié)構(gòu)和作用位點(diǎn)。而且GmF6′H1的酶學(xué)特性分析也顯示，該蛋白能夠以阿魏酰輔酶A 為底物催化其6′位羥基化生成東良菪素，這表明大豆GmF6′H1也是香豆素生物合成關(guān)鍵酶。與此同時(shí)，在擬南芥Atf6′h1突變體中過(guò)量表達(dá)GmF6′H1明顯提高了轉(zhuǎn)基因植株根系中的香豆素含量，與擬南芥野生型根中的香豆素含量接近，進(jìn)一步印證了大豆GmF6′H1的功能。將來(lái)，利用過(guò)量表達(dá)和RNA 抑制的方法，在大豆中研究GmF6′H1的功能可能會(huì)更深入地揭示其更多的生物功能。

基因表達(dá)模式的分析結(jié)果顯示，與擬南芥AtF6′H1相比，GmF6′H1存在著獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式。GmF6′H1 在大豆的根、莖、葉、莢果中均有表達(dá)，而擬南芥AtF6′H1主要在根中表達(dá)，在地上部分其表達(dá)量極低，這說(shuō)明大豆中香豆素在根和地上部分都發(fā)揮著重要作用，或者是GmF6′H1在地上部分以其他物質(zhì)為底物催化化合物生成。在根中，香豆素可能和異黃酮一樣，作為一種植物根系分泌的一種信號(hào)物質(zhì)，吸引相應(yīng)的微生物與根系形成共生關(guān)系，促進(jìn)植物的營(yíng)養(yǎng)吸收，或者作為一種化學(xué)物質(zhì)抑制微生物在根系的生長(zhǎng)，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)香豆素類化合物不僅能夠觸殺一些農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)［23］，而且對(duì)一些植物病原真菌有顯著的抑制作用［24］。在地上部分，香豆素可能以其特殊的味道增強(qiáng)了植物的抗菌、抗蟲(chóng)性，而且有研究也發(fā)現(xiàn)香豆素能夠抵抗紫外線的照射，并且紫外線照射能夠提高香豆素的抑菌性［4］。當(dāng)用抗逆信號(hào)分子水楊酸和激動(dòng)素處理大豆的幼苗時(shí)，GmF6′H1 在地上部分和根中都被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)表達(dá)，而2，4－D 對(duì)該基因的表達(dá)沒(méi)有明顯的作用，這表明GmF6′H1在大豆正常生長(zhǎng)和抗逆過(guò)程中可能都發(fā)揮著重要作用，由于大豆本身的香豆素種類就很繁雜，因此與擬南芥AtF6′H1相比，大豆GmF6′H1可能有更廣的底物范圍，也可能是不同植物中的香豆素合成酶存在不同的調(diào)控機(jī)制。由于目前報(bào)道的以輔酶A 為底物的雙加氧酶并不多見(jiàn)，因此對(duì)大豆GmF6′H1的反應(yīng)機(jī)制和底物特異性進(jìn)行進(jìn)一步的深入探討將會(huì)為今后的研究提供更多的借鑒。

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