齊鳳慧，孫宏冉，詹亞光，2＊

（1 東北林業(yè)大學 生命科學學院，哈爾濱150040；2 東北林業(yè)大學 林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱150040）

隨著DNA 測序技術的快速發(fā)展和公共數(shù)據(jù)庫開放，為SSR（simple sequence repeat，SSR）標記開發(fā)提供了新途徑。在公共數(shù)據(jù)庫中可快速獲得各種動植物、不同組織、不同發(fā)育階段的基因表達序列標簽（expressed sequence tags，EST），這些EST 序列不僅在新基因挖掘中發(fā)揮了重要作用，而且為SSR標記的開發(fā)提供了一個巨大、有價值的來源［1－2］。

SSR 是微衛(wèi)星標記，又稱簡單重復序列，是由1～6個核苷酸為重復單位組成串聯(lián)重復序列，SSR含量豐富且遍布整個基因組。而EST－SSR 標記是建立在表達序列標簽上的一種新型的分子標記技術，并與功能基因直接相關［3］。EST－SSR 除了具有基因組SSR 的優(yōu)點外，它反映的是轉錄區(qū)的差異，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關［4］。而且由于EST－SSR 來源于表達的基因組區(qū)域［5］，可直接反映相關基因的多樣性，同時它在不同物種間有良好的通用性［6］，從一種物種開發(fā)的SSR 標記可用于其他物種的研究。目前，EST－SSR 除了在農(nóng)作物小麥（Triticumaestivum）［7］、苜蓿（Medicagosativa）［8］、葡萄（Vitisvinifera）［9］、水 稻（Oryzasativa）［10］等中應用外，在樹木中也得到廣泛應用，如杏（Prunus armeniaca）［11］、獼猴桃（Actinidiachinensis）［12］、云杉（Piceaasperata）［13］、火 炬 松（Pinustaeda）［14］、白樺（Betulaplatyphylla）［15］、楊 樹（Populus）［16］、茶樹（Camelliasinensis）［17］、桉樹（Eucalyptus）［18］、橡膠樹（Heveabrasiliensis）［19］等物種。

水曲柳（FraxinusmandshuricaRupr．）以材質優(yōu)良而著稱，是珍貴的用材樹種，可制各種家具、樂器、體育器具、車船、機械及特種建筑材料。其稀有珍貴的特性不僅在物種多樣性、生態(tài)多樣性的研究上具有重要意義，而且在維持生態(tài)功能上以及生產(chǎn)實踐中所表現(xiàn)的經(jīng)濟價值也是不可替代的。國務院于1999年8月4日批準的《國家重點保護野生植物名錄》（第一批）將水曲柳列為二級保護植物［20－21］。

水曲柳雌雄異株，幼苗期無法辨別雌雄，只有生長到10～12年開花后才能辨別雌雄［22］，這給育苗、造林以及種子園的建立帶來極大不便。目前對于水曲柳雌雄差異的研究比較少，而在其它植物中的研究表明雌雄株之間的基因表達存在一定差異，因此，為從基因方面揭示水曲柳雌雄差異，我們利用ESTSSR 技術對水曲柳雌雄株進行分析，初步建立水曲柳雌雄株的鑒別方法，為水曲柳育種及種子園的建立提供技術支持。

1 材料和方法

1．1 材 料

1．1．1 實驗材料 研究材料主要來自黑龍江省尚志市葦河林業(yè)局青山林木種子園（1989建成），選擇雌雄株各100棵，取其葉片，－80℃保存。

1．1．2 EST序列來源 實驗中水曲柳EST 序列來源：（1）來自NCBI（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）dbEST 數(shù) 據(jù) 庫（http：／／www．ncbi．nih．gov／bdEST／index．heml）中白臘屬（Fraxinus）的EST 序列；（2）本實驗室在華大基因測得的水曲柳轉錄組。

1．2 方 法

1．2．1 水曲柳SSRs位點的搜索 將獲得的EST序列進行冗余性查找（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／vecScreen），去除EST序列中的載體序列。然后對于NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST 序列利用在線軟件SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）（http：／／www．gram ene．org／db／markers／ssrtool）進行搜索，搜索條件為3次重復以上，選取二、三、四、五、六核苷酸5種類型的SSRs；對于轉錄組序列，搜索條件是5次重復以上，選取二、三、四、五、六核苷酸5種類型的SSRs進行分析。根據(jù)公式：SSR 頻率＝SSR 數(shù)量÷序列總數(shù)計算SSR 頻率。

1．2．2 SSRs引物的設計 利用primer 5．0軟件設計引物。來自NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST 序列，共得到105對EST－SSR 引物；來自水曲柳轉錄組中的序列，共設計1 678對引物，隨機合成127對。引物由上海生工生物工程有限公司合成，共合成232對。

1．2．3 水曲柳DNA的提取、檢測及DNA樣品池建立 用改良的CTAB 法分別提取成年水曲柳雌雄各100株葉片DNA。分別用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA 質量及濃度，根據(jù)檢測結果，用ddH2O 將DNA 濃度調整為同一濃度。隨機選擇雌雄DNA 各50個，各取1μL 分別混合成水曲柳雌雄DNA 樣品池。

1．2．4 水曲柳SSR擴增及引物篩選 以水曲柳雌雄DNA 樣品池為模板，對合成的232對SSR 引物進行篩選。參考不同引物的Tm 值，采用梯度PCR儀進行擴增，退火溫度篩選時在（Tm－5℃）～（Tm－3℃）之間設置3個溫度梯度，SSR 擴增體系（20 μL）為：10×buffer 2．0μL；dNTPs 1．6μL；DNA 模板（20μg／μL）2．0μL；rTaq0．2μL；引 物1（10 μmol／L）1μL；引物2（10μmol／L）1μL；ddH2O 12．2μL［23］。擴增產(chǎn)物用12%的聚丙烯酰胺凝膠檢測，參照韓永亮［24］的電泳和銀染方法。

2 結果與分析

2．1 水曲柳SSRs出現(xiàn)頻率、類型及分布比例

從來自白蠟屬EST 和水曲柳轉錄組中的5 423條和179 502條序列中，分別查找到9 488個和3557個SSR 位點，共13 045個。SSR 出現(xiàn)的頻率分別是174．96%和1．98%，平均0．32kb和13．87 kb出現(xiàn)一個SSR，長度≥10bp的SSR 出現(xiàn)頻率分別是3．41%和1．98%。白蠟屬EST 中SSR 出現(xiàn)頻率比水曲柳轉錄組序列中出現(xiàn)的頻率高（表1）。

表2顯示，全部的EST－SSR 包括2～6個核苷酸重復單元，其中二核苷酸重復所占比例最大約68．83%（8 979 次）；其次是三核苷酸占總SSR 的28．69%（3 743次）；五核苷酸的重復出現(xiàn)的比較少只有46個，占總SSR 的0．35%；通過對兩個數(shù)據(jù)庫SSR 位點的比較發(fā)現(xiàn)白蠟屬EST 數(shù)據(jù)庫SSR 中二核苷酸和四核苷酸所占的比例比水曲柳轉錄組的高，分別多14．82%和0．25%；而水曲柳轉錄組SSR的三、五和六核苷酸所占的比例比白蠟屬EST 數(shù)據(jù)庫的高，分別多13．7%、0．29%和1．07%（表2）。

2．2 水曲柳EST－SSR中重復基元的分布特征

2．2．1 白蠟屬中EST－SSR 的特性 在來源于白蠟屬EST－SSR序列中，共觀察到131種重復基元（考慮堿基互補的前提下）。其中二核苷酸重復基元有4種，三、四、五和六核苷酸重復基元分別有18、44、20和45種。二核苷酸基元（AG／CT）n出現(xiàn)的最多（3 458次），占二核苷酸重復的50．01%，其次分別是（AC／GT）n（24．47%）和（AT／AT）n（24．23%），（CG／CG）n出現(xiàn)的較少（89次）（1．29%）。三核苷酸基元中（AAG／TTC）n出現(xiàn)最多（491次），占三核苷酸重復的20．73%，（ACC／GGT）n 和（AGG／CCT）n出現(xiàn)的頻率也較高，分別占三核苷酸重復的9．29%（220次）和6．46%（153次）。四核苷酸基元中（AAAT／TTTA）n出現(xiàn)的最多，占四核苷酸基元的16．15%（21 次），其次是（AAAG／TTTC）n 和（AATA／TATT）n，分別占四核苷酸重復的12．31%（16次）和7．69%（10次）。五核苷酸重復基元出現(xiàn)的頻率比較低只有26個。搜索結果得到50個六核苷酸基元，出現(xiàn)最多的是（AAAAAT／ATTTTT）n（4次）。

表1 SSR 出現(xiàn)頻率Table 1 Frequency of SSR

總之，白蠟屬EST－SSR 以二核苷酸為主導，（AG／CT）n出現(xiàn)的最多，占總SSR 的36．45%；其次分別是（AC／GT）n（17．83%）和（AT／AT）n（17．65%），而三、四、五和六核苷酸在總SSR 中所占比例都很小。

2．2．2 水曲柳轉錄組中EST－SSR 的特性 在來源于水曲柳轉錄組的SSR 序列中，共觀察到102種重復基元（考慮堿基互補的前提下）（圖1）。其中二核苷酸重復基元有4種，三、四、五和六核苷酸重復基元分別有10、13、18和57種。二核苷酸基元（AG／CT）n出現(xiàn)最多（1 554 次），占二核苷酸重復的75．25%，其次分別是（AC／GT）n（16．71%）和（AT／AT）n（7．51%），（CG／CG）n出現(xiàn)較少（11 次）（0．53%）。三核苷酸基元中（AAG／CTT）n出現(xiàn)最多（412 次），占三核苷 酸 重 復 的29．96%，（ACC／GGT）n和（AGC／CTG）n出現(xiàn)的頻率也較高，分別占三核苷酸重復的19．71%（271 次）和11．64%（160次）。四、五和六核苷酸出現(xiàn)的都比較少，但是六核苷酸類型豐富。

表2 水曲柳SSRs類型及分布比例Table 2 Repeat types and percentage of SSRs of F．mandshurica

通過以上分析可知，兩種序列來源中EST－SSR的特性相同，出現(xiàn)的SSR 位點較多、類型豐富，都是以二核苷酸為主導，三、四、五和六核苷酸在總SSR中所占比例都很小。二核苷酸基元（AG／CT）n 出現(xiàn)的最多（5 012次），占總SSR 的38．42%，其次分別是（AC／GT）n（2 037 次）和（AT／AT）n（1 830次）。三核苷酸基元中，（AAG／CTT）n 出現(xiàn)最多（903 次），占 總SSR 的6．92%。四核苷酸中（AAAT／ATTT）n出現(xiàn)的最多，占總SSR的0．23%。五核苷酸（AAAAG／TTTTC）n 出現(xiàn)的最多，占總SSR 的0．09%。六核苷酸出現(xiàn)的次數(shù)不多，但類型豐富（圖1）。

2．3 水曲柳EST－SSR引物篩選及應用

2．3．1 水曲柳DNA 提取與檢測 采用CTAB 法提取水曲柳葉片中的DNA，用RnaseA 消化后在1．0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測其完整性，從圖2中可看出DNA 條帶清晰，點樣孔也較干凈，沒有大分子物質的干擾。之后用紫外分光光度計檢測其濃度，各樣品A260／A280均約等于1．8，符合實驗要求。

2．3．2 EST－SSR 引物第一輪篩選 分別以水曲柳雌、雄DNA 樣品池為模板，對設計的232對SSR 引物進行PCR 擴增，結果顯示208（89．66%）對引物獲得有效擴增，其中158 對（68．10%）引物在雌雄DNA 中無差異，有20對引物擴增的片段不在目的片段范圍內；74對（31．90%）引物在雌雄DNA 中有差異，有27對引物擴增的片段符合預定大小的目的條帶。在2種來源的引物中，來自白蠟屬的引物有47對在水曲柳雌雄DNA 中有差異，其中有23對的雌雄差異片段符合預定大小的目的條帶，有20對雌雄差異片段小于目的片段長度（表3）；來自水曲柳轉錄組的127 對引物中，有27 對在水曲柳雌雄DNA 中有差異，其中有4對引物的雌雄差異片段符合預定大小的目的條帶，有7對引物的雌雄差異條帶小于目的片段，有16對引物的雌雄差異片段大于目的條帶（表4）。在雌雄有差異片段的74對引物中有30對引物能在雌樹的DNA 中擴增出片段，不能在雄樹DNA 中擴增出段；有44對引物在雌樹的DNA 中不能擴增出片段，在雄樹DNA 中能擴增出片段。在圖3，A 中箭頭所示，21號引物（3、4泳道）和20號引物（9、10泳道）在雌雄DNA中均能擴增出預定大小的目的條帶，23號引物（7、8泳道）在雌雄中擴增出條帶小于目的片段。在圖3，B中箭頭所示，73號引物（1、2、3、4泳道）和74號引物（7、8泳道）在雌樹DNA 中擴增出符合預定大小的目的條帶，而在雄樹DNA 中沒有擴增出條帶；75號引物（9、10、11、12泳道）在雌樹DNA 中擴增出比目的片段長度小的條帶，而在雄樹中沒有擴增出條帶。

圖1 水曲柳SSR 分布特性圖1 Distribution characteristics of SSR in F．mandshurica

圖2 DNA 提取結果Fig．2 DNA electrophosis

表3 白蠟屬EST－SSRs引物篩選結果Table 3 Results of EST－SSRs primer screening in Fraxinus

2．3．3 EST－SSR 引物第二輪篩選 將第一輪篩選中雌雄有差異的所有引物都用于第二輪篩選，每個引物分別以雌雄各15個單株DNA 為模板，擴增結果顯示來自水曲柳轉錄組中的19和56號引物在水曲柳雌雄各15個單株中均有差異。圖4，A 是來自白蠟屬EST 的44和26號引物，可以看出在雌雄間沒有明顯差異，圖4，B 是來自轉錄組56號引物部分結果，在40～80bp處雄樹DNA 中均擴增出小于目的條帶的多態(tài)性片段，而雌樹DNA 中均沒有這樣的多態(tài)性條帶。圖4，C 是19號引物部分擴增結果，如箭頭所示，在雌樹DNA 中擴增出符合預定大小的目的條帶，而雄樹DNA 中沒有擴增出同樣大小的條帶。

2．3．4 EST－SSR 在水曲柳中的應用 將第二輪篩選得到的19號和56號引物應用于200棵成年水曲柳的雌雄差異分析中，56號引物在100株雌樹中有18株在80bp處擴增出片段，82株沒有擴增出片段（圖5，A），差異率是82．00%；在100株雄樹中有3株在80bp處沒有片段，97 株有片段，而且均出現(xiàn)多態(tài)性擴增片段（圖5，B），差異率是97．00%。因此，56號引物在200株水曲柳成年雌雄樹中雌雄差異率是89．50%。

19號引物在100株雌樹中有38株在300～500 bp之間擴增出片段，如圖6箭頭所示，62株沒有擴增出片段，差異率是38．00%；在100株雄樹中有91株在300～400bp之間沒有擴增出片段，9株擴增出片段，差異率是91．00%，19號引物在200株水曲柳成年樹中雌雄差異率是64．50%。

表4 轉錄組EST－SSRs引物篩選結果Table 4 Results of EST－SSRs primer screening in transcriptome

圖3 部分引物篩選結果Fig．3 Primers screening for EST－SSR analysis

圖4 第二輪部分引物篩選結果Fig．4 Results of primer screening in the second round

3 討 論

圖5 56號引物雌雄鑒別部分圖Fig．5 Results of primer 56

圖6 19號引物雌雄鑒別部分圖Fig．6 Results of primer 19

SSR 不僅分布于整個基因組中，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，也廣泛存在于EST 序列中。EST 序列開發(fā)的EST－SSR標記與傳統(tǒng)的基因組SSR 標記相比有很多優(yōu)點，如：EST－SSR 標記在物種間具有高通用性，通常都代表著某種基因功能，還可反映出轉錄區(qū)的差異，而且開發(fā)過程簡單、成本低［25］。目前，EST－SSR 已在農(nóng)作物和木本植物中廣泛應用。Silfverberg－Dilworth等［26］利用148個蘋 果SSR 引物（包含31個EST－SSR）和8個已知的蘋果、梨和歐洲花楸SSR 標記構建了復合遺傳圖譜，這些SSR標記給原參考圖譜新增了168個位點。通常ESTSSR 側翼序列在物種之間高度保守，因此可以在一個物種中開發(fā)EST－SSR 應用于與它親緣的物種中。Vendramin等［27］從桃（P．persica）的中果皮中開發(fā)了21對EST－SSR 引物，用22個桃DNA 篩選出18對引物均能有效擴增出條帶，同時用這18對引物在李屬（Prunus）的6 個其它植物中均擴增出了預期條帶，說明EST－SSR 在李屬近緣種植物之間具有高效的通用性。本研究在105 對白蠟屬EST－SSR引物和127對水曲柳轉錄組SSR 引 物中，分別有81和127對引物能有效擴增，說明EST－SSR 在近緣或遠緣物種之間均有較好的通用性。

要將EST－SSR 應用于植物中，關鍵的第一步就是要進行對EST 序列中SSR 位點的分析及引物設計。劉澤濤等［28］用SSRSCAN 軟件對小麥穗部的3264條EST 序列進行SSR 位點查找，得到108條含有SSR 標記的序列，設計64對引物篩選得到41對能在小麥品種中擴增出條帶，36對引物能擴增出多態(tài)性條帶。Chabane等［29］設計了48對大麥的EST－SSR 引物，并從中篩選出15 對引物在大麥中能有效擴增。在EST－SSR 研究中，李響等［30］對臘梅轉錄組進行SSR 位點分析并設計了100對ESTSSR 引物，篩選出17對引物在臘梅中能有效擴增。本研究共合成了232對引物，篩選到208對引物在水曲柳中能有效擴增，其中有74對引物在水曲柳雌雄DNA 中存在差異，占所有引物的31．90%。

隨著植物基因組學與功能基因組學的不斷發(fā)展和研究的深入，大規(guī)模植物基因的測序產(chǎn)生了大量的EST 序列，并上傳到核酸公共數(shù)據(jù)庫中，因此，要進一步利用EST 序列信息，其中之一就是要對EST－SSR 的引物進行開發(fā)。李德軍等［31］對來自NCBI和馬來西亞橡膠樹EST 數(shù)據(jù)庫的EST 序列進行分析，共鑒定到566個SSR 位點，平均3．96kb出現(xiàn)一個SSR 位點。在火炬松和云杉EST 序列中平均49．8kb出現(xiàn)1個SSR 位點，在楊樹EST 序列中平均每3．88kb出現(xiàn)1個SSR 位點［16］。在一些物種中，二核苷酸和三核苷酸重復序列占主要類型，如橡膠樹中二核苷酸重復占主要類型，其次是三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復，二核苷酸中GA／CT 的數(shù)目最多，其次是TC／AG、AT／TA、CTT／GAA、TTC／AAG 和TCT／AGA［31］。甘蔗EST 中三核苷酸重復占90%［32］；蝴蝶蘭EST 中二核苷酸重復占67．10%［33］；白樺EST 中二核苷酸重復占81．12%［15］。本研究中水曲柳轉錄組中的SSR 出現(xiàn)的頻率較低為1．98%，在白蠟屬EST 中每0．32kb出現(xiàn)一個SSR 位點，出現(xiàn)的頻率較高。水曲柳中也是二核苷酸重復序列占主導，最高為72．87%，二核苷酸（AG／CT）n出現(xiàn)的頻率最多為38．42%。水曲柳中的三核苷酸（AAG／CTT）n 與楊樹（9．3%）、杏（28．76%）［34］、油菜（35．71）［35］等報道一致。

水曲柳雌雄葉片的EST－SSR 標記的開發(fā)及應用對水曲柳育種及種子園建立具有重要的現(xiàn)實意義，一方面，對兩種來源的標記均具有較高的有效擴增效率，表明利用近緣植物的分子標記對水曲柳進行研究是一種有效可行的方法；另一方面，導致水曲柳有性繁殖和種子園建立的難點關鍵是幼年水曲柳很難分辨雌雄，而目前關于水曲柳雌雄鑒別的研究基本空白。構建更加全面的水曲柳雌雄ESR－SSR標記并利用其來進行雌雄差異基因的定位，將是下一步的工作重點。

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