吳紹華，張世鑫，2，楊署光，田維敏＊

（1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地－海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南儋州571737；2 海南大學 園藝園林學院，海口570228）

橡膠作為世界四大工業(yè)原材料之一，是一種重要的戰(zhàn)略物資。目前，99%以上的天然橡膠來源于巴西橡膠樹（Heveabrasiliensis）。巴西橡膠樹原產(chǎn)于高溫、高濕、靜風的巴西亞馬遜河流域，是典型的熱帶雨林樹種。中國種植橡膠樹的區(qū)域主要位于N 18°～24°的熱帶北緣地區(qū)（主要是海南、云南和廣東）。橡膠樹是一種異花授粉高度雜合的多年生木本經(jīng)濟作物，傳統(tǒng)的雜交育種周期長，從人工授粉苗開始到選出一個供生產(chǎn)上大規(guī)模推廣種植的品種一般需要30年時間。為了縮短育種年限，提高選種效率，減少土地、人力、物力的消耗，發(fā)展對雜交后代的早期篩選技術及從分子水平上改良橡膠樹品質是行之有效的方法。由于對橡膠樹產(chǎn)量調控分子機理缺乏足夠的了解，在分子標記輔助育種及轉基因改良橡膠樹品質上難以取得突破，限制了橡膠樹產(chǎn)量育種的進程。因此，天然橡膠生物合成調控分子機理的研究就顯得迫切而重要。早在2000年，郝秉中等［1］研究證明茉莉酸類物質（jasmonates，JA）是調節(jié)巴西橡膠樹乳管分化的關鍵信號分子。外施JA可顯著上調橡膠生物合成關鍵酶的基因表達，并能提高膠乳的干膠含量［2］。據(jù)此，推測天然橡膠的生物合成可能受茉莉酸信號途徑的調節(jié)。但到目前為止，對于JA 如何調控天然橡膠生物合成的機理了解的較少。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)途徑是真核生物中保守的信號途徑，由促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、促分裂原活化蛋白激酶的激酶（MAPK kinase，MAPKK／MKK）、促分裂原活化蛋白激酶的激酶之激酶（MAPK kinase kinase，MAPKKK）3個組分組成［3］，由MAPKKK－MAPKK－MAPK 依次磷酸化傳遞信號［4－5］。有研究表明，MAPK 級聯(lián)途徑與JA 信號途徑具有交互作用，在植物發(fā)育及防御應答中起著重要的作用［6－11］。因此，本研究從巴西橡膠樹乳管細胞中克隆了MAPK 級聯(lián)途徑組分中的MKK 家族成員HbMKK4 的全長cDNA，并分析了其在橡膠樹不同組織中的表達特性及其在割膠及茉莉酸甲酯和乙烯利處理下的表達特點，以期了解其在橡膠生物合成中的功能，為進一步研究MAPK 級聯(lián)途徑如何通過JA 信號途徑調控橡膠的生物合成打下良好的基礎。

1 材料和方法

1．1 材料與處理

實驗材料為種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院實驗場的‘熱研7－33－97（CATAS 7－33－97）’橡膠樹實生苗、一年生萌條和割齡為3年的開割樹。‘熱研7－33－97’實生苗用于分析基因表達的組織特異性，選生長狀態(tài)相近的根、樹皮、膠乳、葉片，液氮凍存用于RNA 提取。割膠處理采用割齡為3年的開割樹，選樹圍一致，割線離地高度一致的‘熱研7－33－97’開割樹進行割膠處理、割線為1／2樹圍螺旋割線，第一刀采集的膠乳作為對照，然后分別在第一刀割膠處理后的0．5h、2h、6h、12h、14h、1d、2d和3d割第二刀，采集的膠乳作為處理樣品，每時間點采集5棵樹，5棵樹的cDNA 等量混合用于基因表達分析。乙烯利（ethephon，ET）及茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）處理采用的是1年生萌條，選大小及生理狀態(tài)相近、葉篷穩(wěn)定的‘熱研7－33－97’的萌條為材料，用0．07% MeJA 涂抹第三伸長單位的節(jié)間樹皮，作為處理組，對照為用于溶解0．07% MeJA的水劑；另外，用含0．5% ET 的溶液涂抹第三伸長單位節(jié)間樹皮，作為乙烯利處理組，對照為用于溶解0．5%ET 的水劑。分別于處理后的1h、2h、4h、8 h、1d、2d、3d和5d用刀片割開樹皮，每時間點處理9根萌條，將混合膠乳采集于RNA 提取液中。

1．2 方 法

1．2．1 總RNA 提取與cDNA 合成 橡膠樹的根、樹皮、葉片、膠乳RNA 的提取均參照天根公司RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒的操作說明進行，柱上消化RNA 樣品中殘留的微量DNA。cDNA 第一鏈合成參照Ferments公司反轉錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）的說明書進行。

1．2．2HbMKK4基因的RACE 擴增和全長cDNA擴增 從巴西橡膠樹膠乳轉錄組數(shù)據(jù)庫中得到一段MKK 的Unigene序列，根據(jù)該序列設計RACE 引物，采 用Clontech 公司的試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit進行序列的RACE擴增。其中5′－RACE 引物為5－GSP1（5′－TAAGTTCCGTTTCCTGGTCTTGTTTC－3′）和5－GSP2（5′－ATGACTCCGATGCGATAAGATTTGA－3′）；3′－RACE引物為3－GSP1（5′－CTTGGGGGTGAGCATATTGGAGTTCT－3′）和3－GSP2（5′－ATCAAGGAATAGTGGAGGCCAAAGAG－3′）。以RACE 測序片段與Unigene序列拼接的序列設計全長cDNA的擴增引物FL－CDNA－F（5′－CGCTTTTCTCTCACCTGCAAAG－3′）和FL－CDNA－R（5′－TGTTGAAACCAGGAGCATGAAC－3′）。全長cDNA 擴增體系：Takara PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，F(xiàn)L－CDNA－F（10μmol·L－1）2．5μL，F(xiàn)L－CDNA－R（10μmol·L－1）2．5μL，cDNA 模板1μL，滅菌水補足50μL。擴增程序為：95℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。0．8%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴增產(chǎn)物，天根膠回收試劑盒純化目的條帶，克隆到全式金公司的pEASY－Blunt Simple Cloning Vector載體上，送Invitrogen公司測序。

1．2．3 生物信息學分析 利用NCBI網(wǎng)站ORF Finder 軟件（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html）進行開放閱讀框（ORF）預測，同時翻譯成蛋白序列。DNAMAN 軟件對基因的編碼氨基酸進行比對分析。用ProtParam 軟件（http：／／au．expasy．org／tools／protparam．html／）在線分析該蛋白的分子量與等電點。SOPMA 在線軟件預測蛋白的二級結構。NetPhos 2．0Server在線預測氨基酸的磷酸化位點。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載不同植物的MKK 蛋白序列，利用軟件MEGA 4．0采用Neighbor－Joining（NJ）模型，并進行1 000次Bootstrap統(tǒng)計學檢驗構建包括HbMKK4 蛋白序列在內(nèi)的植物MKK 蛋白系統(tǒng)進化樹。

1．2．4 實時熒光定量PCR 分析 采用Bio－Rad公司的CFX 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)進行基因的相對定量表達分析。取1μg RNA，逆轉錄合成cDNA第一鏈，稀釋10倍后作為實時定量PCR 分析的模板。HbMKK4熒光定量引物為MKK4－F（5′－TGTTGCTGTTGTTATTGTTGGTG－3′）和 MKK4－R（5′－ACCCCATTCCCCATTTCTTTCT－3′）。內(nèi) 參基因引物為Actin－F（5′－GATTCCGTTGCCCAGAAGTC－3′）和Actin－R（5′－CACCACTCAGCACAATGTTACC－3′）。20μL熒光定量反應體系中，包含1μL cDNA 模板，10μL Takara 2×SYBR Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）和每條引物10μmol·L－1各0．6μL（引物終濃度為0．3μmol·L－1）。PCR 反應程序 為：95℃預變性30s；95℃變 性10 s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。利用CFX manager 3．0軟件自動進行基線和Cq值分析。以HbActin作為內(nèi)參基因，采用2－△△Cq算法分析相對表達量。

采用t測驗對處理與對照樣品的相對定量結果進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2．1 HbMKK 4基因全長cDNA 的克隆及生物信息學分析

本研究通過5′－RACE 擴增，獲得了305bp 非編碼區(qū)序列（untranslated region，UTR），通過3′－RACE獲得長336bp 序列（圖1），將兩端序列與Unigene序列進行拼接，并設計全長cDNA 引物，對拼接序列進行RT－PCR 和測序驗證。結果顯示HbMKK4基因（GenBank 登錄號KP262501）全長cDNA 序列1 580bp，其中5′－UTR 長305bp，3′－UTR 長216bp，ORF編碼框1 059bp，編碼352個氨基酸（圖2）。

圖1 HbMKK 4基因RACE及全長cDNA（FL－cDNA）電泳結果Fig．1 The agarose gel electrophoresis of HbMKK 4 RACE and full－length cDNA（FL－cDNA）

圖2 橡膠樹HbMKK 4基因序列和推導氨基酸序列Fig．2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HbMKK 4

圖3 HbMKK4推導的氨基酸序列與其他植物MKK 蛋白序列比對Fig．3 The deduced amino acid sequences of HbMKK4compared with other plant MKKs

保守結構域分析表明，該基因編碼的蛋白含有S＿TKc結構域（Serine／Thresnine protein kinases，catalytic domine），具有激酶活性位點、ATP結合位點和底物結合位點，屬于PKC超家族。在線軟件磷酸化位點預測結果顯示，該蛋白共有14個磷酸化位點，其中9個絲氨酸（Ser－S）位點，4個蘇氨酸（Thr－T）位點，1 個酪氨酸（Tyr－Y）位點（圖3）。Prot－Param 軟件預測結果顯示，該基因編碼蛋白分子式為C1700H2718N508O509S13，分子量為38．83kD，理論等電點為9．36，不穩(wěn)定系數(shù)為50．94，屬于不穩(wěn)定類蛋白。在線軟件預測結果顯示，該氨基酸序列由30．11%α－螺旋、13．64%延伸鏈、4．26%β－轉角和51．99%無規(guī)則卷曲組成。另外，該蛋白無導肽、無跨膜結構域、屬于親水性蛋白。

2．2 HbMKK 4 推導的氨基酸序列比對及進化樹構建

根據(jù)橡膠樹HbMKK4 推導氨基酸序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫中部分MKK 蛋白氨基酸序列進行比對。結果顯示，該基因編碼氨基酸序列與其他物種MKK 氨基酸序列具有較高相似性，其中與麻瘋樹（Jatrophacurcas）假定蛋白JCGZ＿19828（KDP－27705．1）、毛果楊（Populustrichocarpa）PtMKK4（XP＿006379405．1）和蓖麻（Ricinuscommunis）Rc－MKK（XP＿002523019．1）的相似性分別為82．83%、73．63%和72．47%（圖3）。聚類結果顯示，橡膠樹HbMKK4氨基酸序列與麻瘋樹假定蛋白JCGZ＿19828（KDP27705．1）聚為一類，親緣關系最近（圖4）。

2．3 HbMKK 4基因表達分析

圖4 HbMKK4與其它物種MKK 蛋白的進化分析Fig．4 Phylogenetic relationships between HbMKK4and other plant MKKs

圖5 HbMKK 4基因的組織特異性表達分析Fig．5 Transcription pattern analysis of HbMKK 4 in different tissues from Hevea brasiliensis

圖6 不同處理對膠乳HbMKK4基因表達的影響Fig．6 Expression patterns of HbMKK4under the different treatment

采用實時熒光定量PCR 技術，以HbActin基因為內(nèi)參，檢測了HbMKK4基因表達的組織特異性（圖5），及其在割膠、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯利（ET）處理下膠乳中的表達模式（圖6）。結果顯示，HbMKK4在橡膠樹的根、樹皮、膠乳及葉片中均有表達，其中在根中的表達最高，樹皮及膠乳中的表達相近，淡綠期及成熟期葉片相對古銅期及變色期表達有所上升（圖5）。

割膠顯著上調膠乳中HbMKK4 基因的表達，基因相對表達量在割膠后2h達到最高，是對照的2倍多，達極顯著水平，在割膠處理6h～3d，基因相對表達量逐漸下調至對照水平。茉莉酸甲酯顯著上調HbMKK4基因的表達，MeJA 處理1h后，基因相對表達量顯著上調，在8h后達到最高，表達量是對照1．5倍多，1d后，表達量逐漸下調至對照水平。另外，ET 處理也能上調HbMKK4基因的表達，但是上調的幅度比割膠、MeJA 處理要小。ET 處理4 h后，基因相對表達量達到最高，僅是對照的1．3倍。而且，ET 處理2d后，基因表達顯著下調，相對表達量是對照的0．7倍（圖6）。

3 討 論

植物MAPK 級聯(lián)途徑在植物的逆境脅迫及發(fā)育中起著重要的調控作用。研究發(fā)現(xiàn)，植物的MKK4主要參與植物的防衛(wèi)反應及滲透脅迫。如擬 南 芥 中 MEKK1－MKK4／MKK5－MPK3／MPK6級聯(lián)途徑通過磷酸化激活轉錄因子WRKY22、WRKY29 和FRK1（flg22－induced receptor kinase 1）的活性，參與擬南芥對細菌和真菌病原物的先天免 疫［12］。最近證實EDR1 通過負調控MKK4／MKK5－MPK3／MPK6級聯(lián)途徑參與植物的先天免疫［13］。另外，擬南芥MKK4通過調控MPK3活性參與滲透脅迫響應［14］。

橡膠樹樹干樹皮中的乳管是橡膠樹合成和儲存天然橡膠的場所，也是橡膠樹的一種防衛(wèi)結構，其內(nèi)含物膠乳是一種重要的防御應答誘導的次生代謝產(chǎn)物［1］，含有大量的防衛(wèi)相關蛋白［15－17］。JA 是調節(jié)植物次生代謝的關鍵信號分子，植物防衛(wèi)反應可以誘導體內(nèi)JA 的積累，JA 通過調控次生代謝生物合成相關基因的表達，促進次生代謝產(chǎn)物的合成［18－20］。郝秉中等［1］發(fā)現(xiàn)外施JA 及其前體亞麻酸能夠誘導橡膠樹的次生乳管分化，同時發(fā)現(xiàn)機械損傷可以誘導乳管分化，其效應可被外施JA 生物合成的抑制劑阻斷，表明機械傷害引起內(nèi)源JA 的合成和積累，進而誘導乳管分化［21］。外施JA 也可顯著上調橡膠生物合成關鍵酶的基因表達，并能提高膠乳的干膠含量［2］。因此，推測天然橡膠的生物合成可能受JA信號途徑的調節(jié)。

蛋白激酶或蛋白磷酸化抑制劑的藥理學研究證實蛋白的磷酸化及去磷酸化在JA 信號途徑中起著重要的作用［22］。而且，MAPK 級聯(lián)途徑與JA 信號途徑具有交互作用，在植物發(fā)育及防御應答中起著重要的作用［6－11］。Takahashi 等［8］揭 示 MKK3－MPK6組分在擬南芥茉莉酸信號中起著關鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)，受JA 誘導的MPK6活性在突變體mkk3－1植株中被抑制，而在35S－MKK3 植株中被增強，表明受JA 誘導的MPK6活性依賴于MKK3。同時，MAPK 級聯(lián)途徑也參與乙烯的應答。擬南芥中MKK4／5－MPK3／6 通過調控乙烯合成限速酶ACS2／6參與乙烯的合成［23－24］。Yoo等［25］研究證實MKK9－MPK3／6也參與乙烯的應答反應。

本研究從乳管細胞中克隆了HbMKK4基因的全長cDNA，并分析了其在割膠、MeJA、ET 處理下的基因表達模式，發(fā)現(xiàn)HbMKK4基因的表達受割膠、MeJA、ET 誘導。目前，割膠是天然橡膠生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)之一，而且能夠促進乳管分化［26］，也促進天然橡膠生物合成［27］。乙烯利是一種人工合成的乙烯釋放劑，被廣泛應用于橡膠樹的刺激采膠，大幅度提高了天然橡膠的產(chǎn)量。研究證實，乙烯利刺激增產(chǎn)主要是通過延長乳管的排膠時間和提高乳管細胞的基礎代謝來實現(xiàn)的［28－29］。因 此，HbMKK4 基因可能通過茉莉酸信號途徑在橡膠樹乳管防衛(wèi)及橡膠的生物合成中起著重要的作用，但是具體作用機制還有待于進一步的鑒定。

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