聶利珍，于肖夏，李國婧，鞠天華，孫瑞芬，崔闊澍，于 卓＊

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，呼和浩特010019；2 赤峰天澤生物科技有限公司，內(nèi)蒙古赤峰025457；3 內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院 生物技術(shù)研究中心，呼和浩特010031）

馬鈴薯（Solanumtuberosum）是一種糧、菜及工業(yè)原料等多種用途的經(jīng)濟作物，是世界上僅次于小麥、水稻、玉米的四大糧食作物之一。內(nèi)蒙古是中國馬鈴薯的種薯和商品薯重要產(chǎn)地之一［1］，但干旱缺水一直是馬鈴薯生產(chǎn)的主要限制因子，特別是內(nèi)蒙古中西部地區(qū)幾乎連年干旱，使得馬鈴薯產(chǎn)量低下，嚴重影響著當?shù)剞r(nóng)民的經(jīng)濟收入。因此培育抗旱、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的馬鈴薯新品種實屬必要。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)開展農(nóng)作物育種是農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展方向和必然趨勢［2］。國外Yeo等［3］從酵母中克隆出海藻糖－6－磷酸合成酶基因（TPSI），通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，獲得的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯抗旱能力明顯提高。國內(nèi)姜麗麗等［4］將來自耐旱物種厚葉旋蒴苣苔（Boeacrassifolfia）的藍銅蛋白類似基因BcBCPI導入馬鈴薯，經(jīng)干旱處理后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的抗旱能力顯著提高；張寧［5］從菠菜中克隆甜菜堿醛脫氫酶（BADH）基因，轉(zhuǎn)化馬鈴薯獲得了轉(zhuǎn)基因植株，對其進行干旱和NaCl脅迫處理研究顯示，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗旱耐鹽能力均顯著提高。

CDPKs（calcium－dependent protein kinases，也稱CPKs）是一類依賴鈣離子而不依賴鈣調(diào)素的蛋白激酶，其廣泛存在于植物、藻類和部分原生生物中［6－8］。在植物體內(nèi)CDPKs是主要的初級鈣離子感受器之一，并受生物和非生物脅迫誘導激活，在植物參與非生物脅迫反應、光周期調(diào)節(jié)和激素信號轉(zhuǎn)導中具有非常重要的作用［9］。CDPKs首先在豌豆中發(fā)現(xiàn)［10］，它與細胞Ca2＋信號傳遞有密切關(guān)系，是植物中研究較多、了解較清楚的一類蛋白激酶。Sheen等［11］利用效應基因和報告基因共表達的方法，研究發(fā)現(xiàn)在玉米原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)化AtCDPK1和AtCDPK1a能激活受干旱和高鹽脅迫誘導的啟動子，去除AtCDPK1激酶區(qū)的突變體對干旱和鹽脅迫以及ABA 刺激沒有反應；過表達AtCDPK1 的擬南芥在低溫、高鹽和ABA 脅迫下，其耐受能力明顯比野生型強［12］；擬南芥T－DNA 插入突變體cdpk1對干旱脅迫比野生型擬南芥敏感，過表達AtCDPK1擬南芥可提高其對干旱脅迫的耐受能力［13］。從冰葉日中（Mesembryanrhemumcrystallinum）花中分離得到的McCPK1能響應鹽害和脫水的脅迫作用［14］。AtCPK23敲除突變體提高了對干旱和鹽脅迫的耐受性，而過表達AtCPK23 的擬南芥對干旱和鹽脅迫更敏感［15］。這些結(jié)果都證實CDPKs參與了逆境信息的傳遞。

本試驗擬從擬南芥中克隆抗旱基因AtCD-PK1，構(gòu)建植物表達載體pCHF3－CDPK，并利用農(nóng)桿菌介導法將AtCDPK1基因?qū)肽壳皟?nèi)蒙古地區(qū)種植較多的抗旱性較弱的馬鈴薯品種‘費烏瑞它’（Favorita）基因組，通過PCR 檢測AtCDPK1基因在馬鈴薯的基因組中的整合情況，并用RT－PCR 檢測AtCDPK1在馬鈴薯中的表達情況，旨在為選育抗旱性強的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材 料

轉(zhuǎn)基因受體材料為馬鈴薯品種‘費烏瑞它’（Favorita），由本課題提供。野生型擬南芥（Arabidopsisthaliana）Columbia 生 態(tài) 型（Col－0）種 子 及pCHF3植物表達載體由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學李國婧教授饋贈。農(nóng)桿菌LBA4404由本課題組保存。

1．2 馬鈴薯無菌苗的擴繁和試管薯誘導

將馬鈴薯無菌苗在無菌條件下剪成1．5cm 小段，每節(jié)莖段帶1～2個腋芽，接種于MS培養(yǎng)基，在光強2 000勒克斯（lx）、光照時間16h／d、溫度（22±2）℃條件下進行擴繁培養(yǎng)。無菌苗生長約14d時，在無菌條件下加入微型薯誘導培養(yǎng)基（MS液體培養(yǎng)基＋8%蔗糖＋4．0 mg／L 6－BA＋0．02 mg／L NAA＋500mg／L CCC），使其在黑暗條件下生長，大約30d左右長出微型薯。

1．3 AtCDPK 1基因克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中At1g18890基因序列，利用Primer 3和VectorNTI 11．0軟件，設(shè)計帶有KpnⅠ與XbaⅠ雙酶切位點的特異性引物CDPK1－P5（GAACCCGGGATGGGTAACTGTAACGCCTG）和CDPK1－P3（GCCTCTAGATTAAACAGGAACAGTTTGTC）；以野生型擬南芥基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，擴增片段總長度為2 269bp，反應程序為：98℃預變性3min，98℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環(huán)，72℃延伸5min。對PCR 產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳，利用DNA 純化回收試劑盒（TaKaRa）膠回收。回收產(chǎn)物進行加核苷酸A 反應，DNA 片段利用T4DNA 連接酶（NEB）與pMD18－T Vector（TaKaRa）連接。用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1－T1，經(jīng)藍白斑篩選、PCR 和酶切鑒定，鑒定正確后送上海生工有限公司測序，測序正確的保種備用。

1．4 植物表達載體的構(gòu)建

經(jīng)測序正確的含有AtCDPK1 基因的T－CDPK1重組載體，用KpnⅠ與XbaⅠ雙酶切，回收目的基因片段。再將植物表達載體pCHF3用KpnⅠ（NEB）與XbaⅠ（NEB）雙酶切，回收大片段。將二者回收的目的片段進行連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1－T1，PCR 和酶切鑒定重組載體，陽性克隆提取質(zhì)粒，采用凍融法導入農(nóng)桿菌LBA4404，經(jīng)PCR 鑒定正確后保種，構(gòu)建成植物表達載體pCHF3－CDPK1。

1．5 農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化馬鈴薯

1．5．1 重組菌株的培養(yǎng)與活化 從－80℃冰箱取出保存的含有pCHF3－CDPK1載體的菌種，在相應抗生素平板上劃線。挑取農(nóng)桿菌單菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基（抗生素Rif 30mg／L，Spect 100 mg／L，Str 25mg／L）中，28℃條件下震蕩培養(yǎng)16～20h，取1mL接種到50mL LB 液體培養(yǎng)基中（加抗生素同上），繼續(xù)震蕩培養(yǎng)到OD600為0．5～0．8。將其轉(zhuǎn)至50mL離心管，5 000r／min離心10min，棄上清，菌體用MS培養(yǎng)基重懸。

1．5．2 馬鈴薯轉(zhuǎn)化方法 選擇直徑在2cm 左右的微型薯，去掉芽眼和薯皮，切成2 mm 厚的薯片，放入農(nóng)桿菌重懸液中浸泡10min，期間不斷搖動菌液使其充分接觸，取出后用無菌濾紙吸去薯片表面菌液，轉(zhuǎn)入篩選出的分化培養(yǎng)基（MS＋2 mg／L ZT＋0．5mg／L 6－BA＋1 mg／L IAA＋0．2 mg／L GA3）上，于28℃黑暗下共培養(yǎng)2d，使農(nóng)桿菌的T－DNA有效轉(zhuǎn)移。共培養(yǎng)后將薯片轉(zhuǎn)移到附加50 mg／L Kan＋300 mg／L Cef的分化培養(yǎng)基上，在（22±2）℃、2 000lx連續(xù)光照條件下誘導芽分化。每隔15 d更換1次培養(yǎng)基，并淘汰褐化和死亡的薯片。待抗性芽長至1．0～1．5cm 時，切下轉(zhuǎn)入附加50 mg／L Kan 和200 mg／L Cef的MS 培養(yǎng)基上，在（22±2）℃、2 000lx連續(xù)光照下誘導生根，獲得完整抗性植株。

1．6 馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株的分子檢測

剪取生根培養(yǎng)基上生長至10cm 左右的馬鈴薯幼苗葉片提取DNA，以CDPK－RT－F／R 為引物，以含有該基因的質(zhì)粒為陽性對照，非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯‘費烏瑞它’無菌苗的基因組DNA 為陰性對照，對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR 鑒定。采用TRIzol（Invitroge）試劑提取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量，選出條帶完整且清晰的RNA，去除DNA 后，采用cDNA 合成試劑盒（天根）進行轉(zhuǎn)基因植株的RT－PCR 檢測。RT－PCR的 引 物CDPK－RT－F（CCTGTGTAAGGCCAGACTCAA）和CDPK－RT－R（ATAATAACTCCGGCACTCCAC），擴增片段跨AtCDPK1基因1個內(nèi)含子，擴增cDNA 片段長度為742bp，擴增基因組DNA 的片段為875bp。馬鈴薯內(nèi)參基因引物為EF－1α－F（CTCAAGAAGGTAGGATACAAC）和EF－1α－R（GAAGAGCTTCGTGGTGCAT）。

2 結(jié)果與分析

2．1 AtCDPK 1基因的克隆

圖1 AtCDPK1基因克隆及陽性克隆的鑒定Fig．1 Cloning of AtCDPK1and identification of plasmids recombinant

以擬南芥基因組DNA 為模板，用特異引物CDPK1－P5／P3進行擴增期。結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物大小與預期片段一致，長度為2 269bp（圖1，A）。將目的產(chǎn)物回收后進行加核苷酸A 反應，獲得回收片段末端帶有堿基A，利于目的片段與T 載體連接，將純化回收的目的片段連接到pMD18－T 克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1－T1，從轉(zhuǎn)化的平板上挑取白色克隆進行菌落PCR，經(jīng)檢測擴增出大小約為875bp的條帶（圖1，B）。對陽性克隆進行菌液培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA，然后做PCR 和酶切鑒定，酶切后獲得長度為2 269bp 的條帶（圖1，C）。對質(zhì)粒進行PCR 鑒定表明，引物CDPK1－P5／P3 和CDPK－RTF／R 分別擴增出2 269bp和875bp的條帶（圖1，C）。陽性克隆測序結(jié)果利用DNAStar軟件分析，其DNA 序列與已知基因序列（At1g18890）完全相同（圖2）。這表明擬南芥AtCDPK1基因全長克隆成功。

2．2 植物表達載體的構(gòu)建與鑒定

重組載體T－CDPK1 和植物表達載體pCHF3分別用KpnⅠ與XbaⅠ雙酶切（圖3，A），回收目的片段后用T4DNA 連接酶（NEB）將目的基因片段與植物表達載體片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1－T1，然后進行菌落PCR 鑒定，隨機挑選6個單菌落進行PCR，結(jié)果顯示，每一個單菌落都能擴增出1條875bp的條帶（圖3，B）。隨機選PCR 鑒定正確的2 個菌落提取質(zhì)粒進行相應位點的雙酶切，結(jié)果顯示，2個質(zhì)粒都獲得一條約2 269bp的條帶（圖3，C）。PCR 產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的目的條帶與預期結(jié)果一致，這表明植物表達載體pCHF3－CDPK1是CaMV 35S 啟動子驅(qū)動AtCDPK1 基因的植物表達載體（圖3，D）。將構(gòu)建好的植物表達載體采用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株中用于轉(zhuǎn)化馬鈴薯。

2．3 AtCDPK 1基因農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化馬鈴薯

AtCDPK1基因農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化馬鈴薯，結(jié)果（圖4）表明，無菌苗經(jīng)過暗培養(yǎng)后，形成微型薯（圖4，A），微型薯去皮和芽眼后切成2mm 左右的薄片，薯片經(jīng)共培養(yǎng)和誘導培養(yǎng)后長出再生芽（圖4，B），將芽進行生根培養(yǎng)后長成完整植株（圖4，C、D）。

2．4 轉(zhuǎn)化馬鈴薯的PCR檢測

對獲得的50株抗性再生植株進行PCR 檢測，提取抗性植株葉片的基因組DNA，利用AtCDPK1基因特異引物CDPK－RT－F／R 進行PCR。檢測結(jié)果顯示，在檢測的50個植株中有36株呈陽性，這些陽性轉(zhuǎn)基因植株能擴增出約875bp的目的條帶，部分檢測的電泳結(jié)果見圖5，非轉(zhuǎn)基因植株沒有相應的條帶，這表明AtCDPK1基因可能被成功導入馬鈴薯基因組中。

2．5 AtCDPK 1在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達

為驗證PCR 鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中AtCDPK1基因轉(zhuǎn)錄水平，隨機挑選9個T0代轉(zhuǎn)基因株系，利用AtCDPK1的特異引物CDPK－RT－F／R，以馬鈴薯的看家基因StEF－1α作為內(nèi)參基因，進行RT－PCR 鑒定，檢測AtCDPK1在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達。從圖6 可以看出，AtCDPK1 基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中都有一定量的表達，且各個株系的表達量也不同。其中1、2、3和10表達量較高，6和12表達量較低，4、5和13表達量中等。這表明AtCDPK1基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中得到了正常表達。

圖2 AtCDPK 1基因測序的DNA 序列Fig．2 AtCDPK 1DNA sequencing

圖3 構(gòu)建植物表達載體pCHF3－CDPK1Fig．3 Construction of AtCDPK1expression vector

圖4 形成抗性再生植株Fig．4 Resistant regenerated plants

圖5 再生植株的PCR 檢測Fig．5 PCR detection of regenerated plants

圖6 T0 代轉(zhuǎn)基因馬鈴薯AtCDPK1表達RT－PCR分析Fig．6 RT－PCR analysis of AtCDPK1expression in transgenic plants of S．tuberosum

3 討 論

全球面臨水資源日益短缺的境況，由干旱造成的農(nóng)作物減產(chǎn)并因此帶來的經(jīng)濟損失逐漸加劇。與傳統(tǒng)的抗逆育種工作相比，基因工程育種以其特有的優(yōu)勢，如不受種屬間的限制、周期短、效率高等特點，正得到越來越廣泛的關(guān)注。干旱等非生物脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育［16］，而植物在生長過程中有很多基因參與了植物響應逆境脅迫的過程［17－18］，其中也包括CDPKs［19－20］。CDPKs是一類依賴鈣離子而不依賴鈣調(diào)素的蛋白激酶，它的酶活性是由Ca2＋直接激活，不需要外源的CaM 激活。CDPKs與細胞Ca2＋信號進一步傳遞有密切關(guān)系，是植物中與逆境信號傳遞關(guān)系最密切的蛋白之一。其種類也較多，目前已知的擬南芥基因組至少能編碼34種不同亞型的CDPKs［21－22］。有研究［23－25］表明CDPKs介導了非生物脅迫的信號傳遞，在不同植物中都觀察到非生物逆境可誘導不同CDPKs轉(zhuǎn)錄活性和激酶活性的升高。我們前期研究［26］表明，AtCDPK1基因受干旱、高鹽等逆境脅迫誘導表達，并在擬南芥抗非生物脅迫介導的信號轉(zhuǎn)導中具有正向調(diào)節(jié)作用。因此，推測擬南芥對干旱等非生物脅迫的抗性與AtCDPK1的表達有一定的正相關(guān)性。本試驗以野生型擬南芥為供體材料克隆了AtCDPK1基因，并以抗旱性弱的馬鈴薯品種‘費烏瑞它’為基因受體材料進行了遺傳轉(zhuǎn)化研究，在獲得的轉(zhuǎn)基因植株中AtCDPK1基因能正常轉(zhuǎn)錄表達，這在RNA 水平上證實了目的基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中正常表達，但轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對干旱等逆境脅迫的抗性如何還有待進一步研究驗證。

馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化外植體常用葉片、莖段和薯塊。本試驗選用了脫毒試管微型薯薯片，觀察發(fā)現(xiàn)因其不經(jīng)過愈傷組織分化可直接由胚性細胞誘導產(chǎn)生再生植株，使得農(nóng)桿菌侵染后易于轉(zhuǎn)化。另外，脫毒試管微型薯薯片的污染率低，操作過程相對簡單，可明顯縮短植株再生時間，是馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化研究的首選外植體材料。研究發(fā)現(xiàn)AtCDPK1基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的各株系中表達量有所不同，這可能是由于不同株系轉(zhuǎn)入基因的拷貝數(shù)不同，也可能是實驗操作誤差造成，此有待于利用Southern 雜交和qRT－PCR 進一步驗證。

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