蘇 杰，郭榮起，姜樹原，邸 娜，李國婧，王瑞剛＊

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術(shù)學院，內(nèi)蒙古土右旗014109；2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，呼和浩特010018；3 內(nèi)蒙古呼倫貝爾市農(nóng)業(yè)科學研究所，內(nèi)蒙古牙克石162650；4 包頭醫(yī)學院中心實驗室，內(nèi)蒙古包頭014040；5 河套學院，內(nèi)蒙古臨河015000）

液泡H＋－ATPase（V－ATPase），最早發(fā)現(xiàn)于液泡，存在于真核細胞各種分泌系統(tǒng)膜上［1］，是一種由13個亞基組成的寡聚酶，分V1和V02個結(jié)構(gòu)域。V1域突出膜外，由A～H 共8個亞基構(gòu)成。V0域鑲嵌于膜內(nèi)，由a、c、c″、e和d共5個亞基組成［2］。

在對V－ATPase各亞基的研究中，c亞基倍受關(guān)注，它與酵母的Vma3p和F－ATPase的c亞基同源［1］。它的分子量約為16kD，是形成膜V0域的主要組件；同時，它是質(zhì)子轉(zhuǎn)運的通道，與H＋轉(zhuǎn)運有關(guān)［3－4］。此 外，c亞 基 對V1－V0的 裝 配 也 是 必 不 可少的。缺少c亞基時，酵母突變體能夠合成V1域，但不能被組裝到膜上。此外，c亞基是細胞通訊中間隙聯(lián)結(jié)的部分，是神經(jīng)遞質(zhì)釋放介導體的組分，也是某種罕見的病毒癌基因產(chǎn)物的靶蛋白［3］。這些結(jié)果表明c亞基在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）V－ATPase 的c亞基 屬 于 多 基 因 家 族（VHA－c），由VHA－c1（At4g34720）、VHA－c2 （At1g19910）、VHA－c3（At4g38920）、VHA－c4 （At1g75630）和VHA－c5（At2g16510）共5個同源基因編碼，它們編碼的脂質(zhì)蛋白分子量約為16kD［2，4］。研究表明，光照、外源激素和營養(yǎng)等非生物脅迫與擬南芥V－ATPase c亞基基因表達調(diào)節(jié)有關(guān)。邸娜［5］證實VHA－c 基因?qū)ν庠醇に?、高鹽、滲透脅迫及水分脅迫有響應(yīng)。Padmanaban等［6］的研究表明，VHA－c 基因?qū)毎麛U增起重要作用，尤其對根冠作用更加明顯。郭榮起［7］研究發(fā)現(xiàn)VHA－c1 沉默純合體的根和下胚軸長度短于對照。于秀敏等［8］的研究也揭示VHA－c2、VHA－c3和VHA－c5均可被4 ℃低溫和光照促進表達。這些結(jié)果都證明了擬南芥V－ATPase c亞基在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中可能具有重要作用。

為了更深入地了解擬南芥VHA－c 基因的功能，本實驗構(gòu)建了VHA－c1基因的過表達載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，并對VHA－c1基因的過表達純合體進行了暗培養(yǎng)、ABA 處理和糖處理，為進一步探明VHA－c 基因在植物非生物脅迫方面的抗性機制提供了初步的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材 料

擬南芥野生型Columbia生態(tài)型（Col－0）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學植物分子生物學實驗室提供。培養(yǎng)條件：22 ℃，16h光照／8h黑暗，相對濕度約60%。

1．2 方 法

1．2．1 VHA－c1 基因過表達載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 采用CTAB 法［9］提取擬南芥基因組DNA。然后以擬南芥基因組DNA 為模板，擴增VHA－c1目的片段，PCR 引物的設(shè)計為。為了方便構(gòu)建VHA－c1基因的表達載體，在2條引物的5′－端分別引入了KpnⅠ和SalⅠ的酶切位點。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性1 min；然后98 ℃變 性10s，58 ℃退 火30s，72 ℃延 伸2 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸6min。

將PCR 產(chǎn)物純化和凝膠回收，再連接到pGMT 載體（天根公司）進行測序。測序證明序列正確后，利用KpnⅠ和SalⅠ酶切pGM－T－c1載體獲得目的片段，與利用相同酶切的pCHF3 載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得目標過表達載體pCHF3－c1。將過表達質(zhì)粒載體pCHF3－c1 用電擊法［10］轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101細胞中，取50μL 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含25μg／mL Gent和100μg／mL Spect固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36～48h，篩選陽性克隆。

1．2．2 擬南芥的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因純合體的獲得 擬南芥的轉(zhuǎn)化采用浸花法［11］，轉(zhuǎn)化后將植株在正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)3～4周，收取成熟種子。將種子播種于含30μg／mL Kan的1／2 MS選擇培養(yǎng)基中，22℃培養(yǎng)，10～12d后挑選陽性植株，待其成熟后分單株收取種子（T1代）；T1代種子按單株種于含30 μg／mL Kan的選擇培養(yǎng)基上，選擇有3∶1性狀分離的株系，將綠苗移至蛭石上培養(yǎng)，單株收取種子（T2代）；T2代種子按單株在含30μg／mL Kan的培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，不再分離的即為純合體株系，用于本次實驗的各項分析。

1．2．3 VHA－c1 轉(zhuǎn)基因植物半定量RT－PCR 鑒定 提取野生型和過表達轉(zhuǎn)基因純合體擬南芥的總RNA［12］，參照TakaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。再以cDNA 為模板，對actin（At3g12110）和VHA－c1基因進行PCR 擴增，actin引物為actin－RT－F（5′－ATGGCAGATGGTGAAG－ACATTCAG－3′）和actin－RT－R（5′－GAAGCACTTCCTGTGGACTATTGA－3′），VHA－c1引物為c1－RT－F（5′－GATTTAAGATCTCAGATACAAAACTCCGAC－3′）和c1－RT－R（5′－TCCTACAATAAGCCCGTAAAGAGCAAGCGC－3′）。半定量RT－PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；然后，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，25個循環(huán)；最后72 ℃延伸5min［6］。將PCR 產(chǎn)物于1．5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析（Syngene公司凝膠成像儀）。

1．2．4 VHA－c1 轉(zhuǎn)基因純合體的暗培養(yǎng) 轉(zhuǎn)基因純合體和野生型擬南芥種子同時種在1／2MS［13］培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)5d后，統(tǒng)計根的長度［6］。

1．2．5 不同濃度ABA 處理VHA－c1轉(zhuǎn)基因純合體（1）轉(zhuǎn)基因純合體和野生型擬南芥種子同時種在1／2 MS培養(yǎng)基中，4℃春化3d，22℃、16h光照／8h黑暗條件下培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)移至含有不同濃度ABA（0、4、8和12μmol／L）的1／8MS的方平板上，豎直放置，16h 光照／8h 黑暗培養(yǎng)4d，統(tǒng)計主根的長度。（2）轉(zhuǎn)基因純合體和野生型擬南芥種子同時種在含有不同濃度ABA（0、0．5、1和2μmol／L）的1／2 MS培養(yǎng)基中，4 ℃春化3d，再于22 ℃、16h光照／8h黑暗條件下培養(yǎng)2d，統(tǒng)計萌發(fā)率［14］。

1．2．6 不同濃度糖處理VHA－c1轉(zhuǎn)基因純合體 轉(zhuǎn)基因純合體和野生型擬南芥種子同時種在含有0、4%、5%和6%蔗糖或葡萄糖的1／2 MS 培養(yǎng)基中，4 ℃春化3d，再于22 ℃、16h光照／8h黑暗條件下培養(yǎng)3d，統(tǒng)計其萌發(fā)率［15－16］。

2 結(jié)果與分析

2．1 VHA－c1基因過表達載體構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

以擬南芥基因組DNA 為模板，擴增VHA－c1基因的目的片段，擴增產(chǎn)物的片段為1 060bp（圖1），PCR 產(chǎn)物與pGM－T 載體連接后，命名重組質(zhì)粒為pGM－T－c1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取白色單菌落，進行PCR 擴增及酶切鑒定，送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。驗證目的片段正確后，將陽性質(zhì)粒pGM－T－c1和表達載體pCHF3用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切。連接酶切產(chǎn)物獲得重組質(zhì)粒pCHF3－c1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取陽性克隆的質(zhì)粒，進行KpnⅠ和SalⅠ的雙酶切電泳。電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。由此可見，過表達VHA－c1 基因的重組質(zhì)粒pCHF3－c1構(gòu)建成功。用電擊法將重組質(zhì)粒pCHF3－c1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑選培養(yǎng)在含Spect和Gent兩種抗生素的LB固體培養(yǎng)基上的單克隆，進行菌落PCR 檢測呈陽性，證明重組質(zhì)粒pCHF3－c1已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

2．2 擬南芥VHA－c1轉(zhuǎn)基因植株的篩選

重組質(zhì)粒pCHF3－c1經(jīng)農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入野生型擬南芥。經(jīng)篩選獲得T1代轉(zhuǎn)基因株系22個，經(jīng)進一步篩選，最終獲得7個T2代轉(zhuǎn)基因純系（過表達純合株系），這7個株系分別為c1－3－8、c1－9－1、c1－13－3、c1－14－6、c1－16－4、c1－20－9、c1－26－13。

提取野生型（WT）擬南芥和VHA－c1過表達純合體總RNA，用半定量RT－PCR 進行檢測（圖3）。將WT 的VHA－c1轉(zhuǎn)錄水平定為100%，過表達純合 體 中c1－13－3 和c1－14－6 的mRNA 表 達 水 平 較強；c1－3－8、c1－9－1、c1－16－4、c1－26－13的mRNA 表達水平居中；c1－20－9 的mRNA 表達水平較弱。

圖1 VHA－c1目的片段的PCR 擴增M．DL2000；下同F(xiàn)ig．1 PCR amplification of VHA－c1gene M．DL2000；The same as below

圖2 重組質(zhì)粒pCHF3－c1的酶切鑒定Fig．2 Identification of the recombinant pCHF3－c1 plasmid digested with KpnⅠand SalⅠ

圖3 VHA－c1轉(zhuǎn)基因純合體mRNA 表達水平WT．野生型（對照）；1～7分別是轉(zhuǎn)基因株系c1－3－8、c1－9－1、c1－13－3、c1－14－6、c1－16－4、c1－20－9、c1－26－13Fig．3 The transcript level of VHA－c1gene in the overexpression transgenic plants WT．Wild type（control）；1－7．Transgenic plants c1－3－8，c1－9－1，c1－13－3，c1－14－6，c1－16－4，c1－20－9and c1－26－13，respectively

2．3 VHA－c1轉(zhuǎn)基因純合體的根變短

在 正 常 光 照 培 養(yǎng) 下（16h 光 照／8h 黑 暗），VHA－c1過表達純合體與野生型擬南芥未見明顯差異。根據(jù)Padmanaban 等［6］研 究 方 法，將VHA－c1過表達純合體和對照種子，暗培養(yǎng)5d后測量根長度（圖4）。結(jié)果（圖6）顯示，6個株系的平均根長比對照分別短12%、6%、12%、15%、3%和7%，且c1－14－6與對照之間根長的差異達到顯著水平，c1－16－4與對照之間根長的差異達到極顯著水平。這些結(jié)果表明，在黑暗條件下，VHA－c1基因過量表達抑制了根的生長。

2．4 ABA 處理下VHA－c1轉(zhuǎn)基因純合體主根伸長和種子萌發(fā)的變化

2．4．1 VHA－c1 轉(zhuǎn)基因純合體主根伸長和子葉的變化 不同濃度ABA 處理后，4個株系的VHA－c1轉(zhuǎn)基因純合體主根相對伸長量大于對照；隨著ABA濃度的增加，過表達純合體和對照植株主根生長被抑制的程度均增加，同時子葉的黃化程度增加，且VHA－c1轉(zhuǎn)基因株系子葉的展開程度要高于對照（圖5，以c1－3－8為例）。在4μmol／L ABA 濃度下，4個株系主根的相對伸長量平均比對照分別增加9%、13% 、13%和24%；在8μmol／L ABA 濃度下，分別增加17%、12% 、8%和6%；在12μmol／L ABA 濃度下，分別增加8%、6% 、4%和1%。部分ABA 濃度處理下主根的伸長量與對照之間的差異達顯著或極顯著水平（圖7）。

2．4．2 VHA－c1 轉(zhuǎn)基因純合體種子萌發(fā)率的變化不同濃度ABA 處理VHA－c1 轉(zhuǎn)基因純合體，結(jié)果顯示，當ABA 濃度大于2．0μmol／L 時，所有種子的萌發(fā)幾乎全部被抑制；當濃度介于0～2．0μmol／L時，所有VHA－c1過表達純合體和野生型種子的萌發(fā)都受到抑制，且隨著ABA 濃度的增大，種子萌發(fā)率 均 下 降。 在 不 同 ABA 濃 度 下，所 有VHA－c1轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率均大于野生型；0．5 μmol／L ABA時，7 個株系的萌發(fā)率比野生型增加30%、28%、32%、22%、30%、15% 和20%；1．0 μmol／L ABA，萌發(fā)率增加量分別為76%、79%、40%、43%、50%、69%和55%；在2．0μmol／L ABA濃度下，萌發(fā)率增加量分別為58%、12%、55%、48%、48%、24%和23%，大部分株系與WT 之間的差異達到顯著或極顯著水平（圖8）。以上結(jié)果表明，VHA－c1基因的過表達降低了根、子葉和種子對ABA 的敏感性。

圖4 在暗培養(yǎng)條件下2個VHA－c1轉(zhuǎn)基因純合體根的表型Fig．4 The root phenotype of two VHA－c1transgenic homozygous lines grown in dark

圖6 暗培養(yǎng)條件下VHA－c1不同轉(zhuǎn)基因純合體株系的根長比較c1的1～6分別為c1－3－8、c1－9－1、c1－14－6、c1－16－4、c1－20－9、c1－26－13；＊和＊＊分別表示轉(zhuǎn)基因株系與野生型間在0．05和0．01水平存在顯著性差異；下同F(xiàn)ig．6 Comparison of the root length of different VHA－c1 transgenic homozygous lines grown in dark 1－6correspond to six transgenic homozygous lines c1－3－8，c1－9－1，c1－14－6，c1－16－4，c1－20－9and c1－26－13，respectively；＊and＊＊indicate significant difference between transgenic homozygous lines and wild types at 0．05and 0．01 level，respectively；The same as below

圖7 不同濃度ABA 處理后VHA－c1轉(zhuǎn)基因株系主根相對伸長量Fig．7 Relative taproot growth of VHA－c1 transgenic homozygotes with the treatment of different concentrations of ABA

圖8 不同濃度ABA 處理下VHA－c1純合體種子萌發(fā)率Fig．8 The germination rate of VHA－c1 transgenic homozygotes with the treatment of different concentrations of ABA

2．5 不同濃度糖處理下VHA－c1轉(zhuǎn)基因純合體種子萌發(fā)率的變化

許多研究發(fā)現(xiàn)，植物響應(yīng)ABA 的生理過程與糖有關(guān)，于是我們接著對過表達純合體進行了糖處理。在濃度為4%、5%和6% Glc（葡萄糖）處理下，有5個株系的種子萌發(fā)率均高于WT（圖9，A），而在濃度為4%、5%和6%Suc（蔗糖）處理下，有4個株系的種子萌發(fā)率均高于WT（圖9，B）。

圖9 不同濃度葡萄糖（A）和蔗糖（B）處理下VHA－c1轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)率Fig．9 The germination rate of VHA－c1transgeneic homozygotes with the treatment of different concentrations of glucose（A）and sucrose（B）

3 討 論

3．1 VHA－c1在細胞擴展中的可能作用

V－ATPase某 些 亞 基（如A［17］、C［18－19］和E［20］）表達量的變化，影響了細胞擴展。其機理是V－ATPase利用液泡中ATP的γ－磷酸基團裂解時所釋放的能量，將質(zhì)子泵到液泡腔中，產(chǎn)生H＋電化學梯度，使液泡酸化，為物質(zhì)運輸提供能量，從而影響膨壓和細胞擴增［21］。

對于V－ATPase c亞基，Padmanaban等［6］已通過dsRNA 干擾發(fā)現(xiàn)擬南芥vha－c1突變株在暗培養(yǎng)下根和下胚軸長度都變短，揭示VHA－c1在細胞擴展中起重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)下的擬南芥VHA－c1過表達純合體的根變短，再次證實VHAc1在細胞的擴展中起作用。至于根為何變短，推測可能是由于VHA－c1 的上游調(diào)控區(qū)存在光敏感元件AE－box、GATA 等，黑暗信號可能直接或間接影響VHA－c1的過量表達，進一步影響V－ATPase活性，使得細胞擴展時質(zhì)子的轉(zhuǎn)運及液泡的酸化困難，使物質(zhì)運輸時供能受阻。至于是主根分生區(qū)變短還是根細胞伸長受抑制，還有待于在細胞層次上進一步驗證。

3．2 VHA－c1可能參與ABA 和糖介導的信號轉(zhuǎn)導途徑

ABA 是一種調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的激素，參與植物生長過程，并且廣泛存在于各種植物諸多生理活動中，如參與種子休眠、葉及根的伸展以及葉片脫落等。Tsinatis等首次報道了ABA 誘導V－ATPase c亞基的表達［22］。研究發(fā)現(xiàn)，對外源ABA 有響應(yīng)的植株其V－ATPase活性及H＋轉(zhuǎn)運活性增加［22－23］。本實驗對獲得的過表達純合體的種子和幼苗進行ABA 處理后發(fā)現(xiàn)，VHA－c1的過表達導致轉(zhuǎn)基因純合體種子萌發(fā)、主根伸長和子葉的擴展對ABA 的抑制不敏感。我們推測很可能是由于VHA－c1 基因的過量表達影響了V－ATPase的活性及H＋轉(zhuǎn)運活性，進而影響了植物在種子萌發(fā)和生長過程中對ABA 的響應(yīng)和轉(zhuǎn)運。

有研究發(fā)現(xiàn)，植物響應(yīng)ABA 的生理過程與糖有關(guān)。Chen等［14］發(fā)現(xiàn)，對ABA 不敏感的突變體hy5在種子萌發(fā)和幼苗生長方面對糖的抑制也不敏感，可能是由于糖處理減弱了種子或幼苗對ABA的響應(yīng)。Finkelstein等［24］將野生型和對ABA 不敏感（abi）的擬南芥種子進行萌發(fā)實驗后發(fā)現(xiàn)，低濃度的葡萄糖、蔗糖或果糖影響ABA 的抑制作用。本實驗對過表達純合體進行了糖處理，結(jié)果顯示：過半數(shù)的VHA－c1過表達純合體株系的種子在用葡萄糖和蔗糖處理后，萌發(fā)率較野生型高。綜合ABA和糖處理的結(jié)果，VHA－c1的過表達導致種子的萌發(fā)對外源ABA 和糖處理都不敏感，至于在種子萌發(fā)時，ABA 和糖信號怎樣介導種子萌發(fā)的信號轉(zhuǎn)導，以及VHA－c1 的過量表達怎樣影響了V－ATPase的活性，從而降低了種子對ABA 和糖的敏感程度，還有待于進一步的研究證實。

綜上所述，本研究獲得了擬南芥VHA－c1過表達純合體，對其進行暗培養(yǎng)、ABA 處理和糖處理，發(fā)現(xiàn)其表型與野生型不同，為進一步研究VHA－c1基因在植物生長發(fā)育、激素響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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