舒 暢，劉 超，吳江生

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家油菜工程技術(shù)研究中心／農(nóng)業(yè)部油菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070）

利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）生產(chǎn)雜交種是油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑［1］。CMS現(xiàn)象通常是由于植物線粒體DNA 的重排產(chǎn)生嵌合基因，編碼異常多肽，阻礙花粉的正常發(fā)育所致［2－8］。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的油菜CMS 的細(xì)胞質(zhì)來(lái)源可分為兩大類：一類是油菜品種間雜交或自然突變產(chǎn)生的雄性不育，即同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育，主要包括pol CMS、陜2ACMS和napCMS等；另一類為十字花科植物遠(yuǎn)緣雜交或原生質(zhì)體融合產(chǎn)生的雄性不育，即異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育，主要包括ogu CMS和kos CMS 等。其中，pol CMS 系統(tǒng)／陜2A CMS是目前中國(guó)油菜生產(chǎn)上利用的重要類型，根據(jù)其對(duì)溫度的敏感性，可分為高溫不育型、低溫不育型和穩(wěn)定不育型，其中高溫不育型較為普遍，在低溫條件下易產(chǎn)生微量花粉，影響雜交種制種純度；盡管ogu系統(tǒng)的不育性穩(wěn)定，但由于其恢復(fù)基因受專利保護(hù)限制了其在中國(guó)的應(yīng)用；nap 系統(tǒng)由于存在明顯的溫度敏感性，因此并不適合油菜的雜交種制種；tour系統(tǒng)由于育性不能被徹底恢復(fù)、難以實(shí)現(xiàn)三系配套而未能被有效利用［1］。目前在中國(guó)雜交油菜生產(chǎn)中，絕大多數(shù)應(yīng)用的是pol CMS，已造成了不育細(xì)胞質(zhì)單一化的局面。因此，選育新型穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型，不僅能克服不育細(xì)胞質(zhì)類型單一化的潛在威脅，擴(kuò)大油菜雜交種的遺傳基礎(chǔ)，同時(shí)也將有利于減小油菜雜交種的制種風(fēng)險(xiǎn)。

NRO4270A 是以蘿卜甘藍(lán)異源四倍體（Raphanus brassica，RRCC）為母本與甘藍(lán)型油菜雜交，通過(guò)多代選育獲得的穩(wěn)定甘藍(lán)型油菜不育系。本研究通過(guò)育性調(diào)查、恢保關(guān)系測(cè)定、花藥發(fā)育的顯微觀察和線粒體DNA 的RFLP分析對(duì)該不育系進(jìn)行鑒定，為該不育系的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 試驗(yàn)材料

NRO4270A 是以人工合成的蘿卜甘藍(lán)異源四倍體［9－11］為母本與甘藍(lán)型油菜雜交，從雜種后代中分離篩選出雄性不育株，通過(guò)進(jìn)一步與甘藍(lán)型油菜連續(xù)回交獲得的遺傳穩(wěn)定的甘藍(lán)型油菜蘿卜甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，NRO4270B 為其對(duì)應(yīng)的保持系。本研究的主要材料（表1）包括5 種雄性不育材料（pol、ogu、kos、hau和NRO4270A）以及不同的保持系、恢復(fù)系，均種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田、湖北省長(zhǎng)陽(yáng)縣和甘肅省和政縣油菜夏季繁殖基地。

表1 用于本研究的主要試驗(yàn)材料Table 1 Materials used in this study

1．2 育性鑒定

在湖北省武漢市、長(zhǎng)陽(yáng)縣和甘肅省和政縣，于開(kāi)花期時(shí)對(duì)NRO4270A 不育系進(jìn)行育性調(diào)查，并觀察其是否存在死蕾現(xiàn)象。

1．3 恢保關(guān)系測(cè)定

在開(kāi)花期，取表1 中不同保持系、恢復(fù)系以及‘華雙4號(hào)’的花粉，分別與NRO4270A、pol、ogu、kos和hau 5種不育系進(jìn)行測(cè)交。下一個(gè)種植季，分別種植測(cè)交后代F1。參考油菜的育性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［12］，在開(kāi)花期對(duì)其進(jìn)行3次育性調(diào)查。在F1育性調(diào)查過(guò)程中，只要有1次調(diào)查結(jié)果為不育即歸為不育類（S）；3次調(diào)查結(jié)果均無(wú)完全不育（即部分恢復(fù)育性）歸為半不育類（PS）；3次調(diào)查均為完全正常可育即歸為恢復(fù)類（F）。分別記載不同單株的育性情況，比較不同不育系恢保關(guān)系的差異。

1．4 石蠟切片的制作

參考石蠟切片的制作技術(shù)［13］，取NRO4270A CMS及其保持系NRO4270B 的花蕾制作石蠟切片，對(duì)其花粉發(fā)育過(guò)程進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察：（1）取材與固定：在開(kāi)花期，分別取 NRO4270A CMS 和NRO4270B 的花蕾，根據(jù)其長(zhǎng)度從小到大分為六級(jí)，分別固定于FAA 溶液（70%酒精90 mL，福爾馬林5mL，冰醋酸5mL）中24h；（2）染色：用適量的愛(ài)氏蘇木精染料進(jìn)行整體染色，3～5d后，用蒸餾水漂洗；（3）脫水：用不同濃度乙醇（30%、50%、70%、85%和95%）對(duì)材料進(jìn)行逐級(jí)脫水，每級(jí)處理1h，無(wú)水乙醇脫水2次，每次1h；（4）透明：用梯度濃度氯仿（20%、40%、60%、80%）逐級(jí)透明，每級(jí)處理1h后，純氯仿處理2次，每次1h；（5）浸蠟和包埋：加入等體積碎蠟，置于37℃恒溫箱中。溫育2d后，將材料轉(zhuǎn)入帶濾網(wǎng)的鐵盒中，逐級(jí)浸蠟：50%石蠟（48 ℃）2h，75%石蠟（53 ℃）2h，純蠟A（56 ℃）0．5h、純蠟B（56 ℃）0．5h、純蠟C（56 ℃）0．5h，然后在包埋盒中包埋材料；（6）切片：用KD－2508輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)對(duì)材料進(jìn)行橫切，蛋清甘油粘片和展片后，37 ℃下烘片3d以上；（7）脫蠟和封片：二甲苯脫蠟0．5～1h后，用樹(shù)膠封片。37 ℃下烘片3d后，用Ds－Ri1全自動(dòng)顯微鏡（Nikon）進(jìn)行觀察。

1．5 不同細(xì)胞質(zhì)類型的RFLP分析

1．5．1 DNA 的提取和酶切 取實(shí)驗(yàn)材料新鮮葉片5g，采用CTAB 法［14］提取總DNA。加入200μL TE（Tris－EDTA）溶解DNA 后，檢測(cè)DNA 質(zhì)量及濃度。將總DNA分別進(jìn)行酶切，酶切體系為：5μL10×buffer、15μg DNA、5 U 限 制 性 內(nèi) 切 酶，加ddH2O 至50μL，37 ℃下酶切24h。

表2 線粒體探針擴(kuò)增信息Table 2 Information of PCR－amplified mitochondrial probe

1．5．2 探針的制備和標(biāo)記 根據(jù)已公布的甘藍(lán)型油菜線粒體全基因組序列［15］，利用軟件Primer 5．0設(shè)計(jì)線粒體探針引物，相關(guān)基因包括atp1、atp6、atp9、orf222、cox2和cob（表2）。

PCR 擴(kuò)增探針并通過(guò)凝膠回收后，利用隨機(jī)引物DNA 標(biāo)記試劑盒（TAKARA）對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，反應(yīng)體系 為：100ng 探 針DNA、2．0μL 隨 機(jī) 引 物（9－mer），加ddH2O 至17．0μL，置于沸水中變性5 min后，再加入2．5μL 10×buffer、2．5μL dNTPs（－dCTP，0．2 mmol／L）、1μL Klenow 酶（2 U／μL）、2μLα－32P－dCTP（10Ci／μL），置于37 ℃水浴反應(yīng)4h，沸水中變性10min后備用。

1．5．3 轉(zhuǎn)膜和探針雜交 酶切產(chǎn)物在1．0%瓊脂糖凝膠上電泳（電壓30V）18～20h后，將凝膠置于0．25mol／L HCl溶液中10min，使指示劑變?yōu)辄S色（脫嘌呤）；蒸餾水漂洗凝膠后，轉(zhuǎn)移至0．4 mol／L NaOH 溶液中變性10 min；蒸餾水洗凈后，將凝膠轉(zhuǎn)移至堿溶液（0．4mol／L NaOH）處理30min。利用0．4 mol／L NaOH 溶液將DNA 轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。將晾干的尼龍膜在80 ℃條件下烘烤2h后，保存于2×SSC溶液備用。

預(yù)雜交前，將尼龍膜放入雜交袋中。預(yù)雜交液和雜交液均為church buffer（0．25mol／L NaPO4緩沖 液pH 7．2、0．7% SDS、1%牛 血 清 蛋 白 和1 mmol／L EDTA），將church buffer預(yù)熱至65℃，加入終濃度為100ng／μL 的變性鮭精DNA 后，將其加入雜交袋，在65 ℃的雜交箱中預(yù)雜交6～12h。將標(biāo)記好的探針，加入雜交袋中混勻，65 ℃雜交過(guò)夜。1．5．4 洗膜和信號(hào)檢測(cè) 雜交完成后，將雜交膜分別于65 ℃預(yù)熱的洗膜液A（2×SSC、0．1%SDS；5 min）和洗膜液B（0．5×SSC、0．1%SDS；15min）中漂洗2次，檢測(cè)放射性信號(hào)強(qiáng)度。將雜交膜晾干后壓磷屏，在FLA－9000 激光檢測(cè)儀（FUJIFILM）上檢測(cè)雜交信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2．1 NRO4270ACMS花器官形態(tài)觀察和育性鑒定

通過(guò)對(duì)花器官的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，NRO4270A 不育系的花瓣正常，但雄蕊明顯短于雌蕊，花藥短小干癟、乳白色，發(fā)育不良，呈三角形，無(wú)花粉形成，敗育徹底（圖1，A，C）。相比而言，正常甘藍(lán)型油菜花瓣寬大，雄蕊長(zhǎng)度明顯高于雌蕊，花藥飽滿，發(fā)育正常，可見(jiàn)大量的花粉（圖1，B，D）。

為檢測(cè)NRO4270A CMS 不育對(duì)環(huán)境的敏感性，經(jīng)連續(xù)5年（2009－2013）的育性調(diào)查。結(jié)果表明NRO4270ACMS的不育性穩(wěn)定，在湖北省武漢市（冬油菜區(qū)）、長(zhǎng)陽(yáng)縣（高海拔春油菜區(qū)）以及甘肅省和政縣（高海拔春油菜區(qū)）不育度和不育率均為100%，對(duì)環(huán)境反應(yīng)不敏感，表現(xiàn)無(wú)花粉，且無(wú)死蕾現(xiàn)象。

2．2 不同細(xì)胞質(zhì)雄性不育系恢保關(guān)系測(cè)定

圖1 甘藍(lán)型油菜不育系NRO4270A 雄性不育的表現(xiàn)A、B．開(kāi)放的花器官：A．NRO4270ACMS；B．可育甘藍(lán)型油菜；C、D．去除花萼和花瓣的花器官：C．NRO4270ACMS；D．可育甘藍(lán)型油菜Fig．1 Flower morphology of B．napus NRO4270ACMS A，B．Opening flower：A．NRO4270ACMS；B．Fertile B．napus；C，D．Opening flower with the sepals and petals peeled off：C．NRO4270ACMS；D．Fertile B．napus

8個(gè)甘藍(lán)型油菜材料（25cc1、00N269c、9A001C、恢7－5、91－恢5900、恢5148、298033和‘華雙4號(hào)’）分別與NRO4270ACMS、pol CMS、ogu CMS、kos CMS和hau CMS的恢保關(guān)系測(cè)定結(jié)果表明（表3）：（1）25cc1、00N269c和9A001C與5種CMS測(cè)交，可以恢復(fù)ogu CMS和kos CMS的育性，但不能恢復(fù)其他3種CMS的育性，因此ogu CMS和kos CMS具有相同的恢保關(guān)系；（2）恢7－5、91－恢5900、恢5148和298033能夠恢復(fù)pol CMS的育性，卻不能恢復(fù)其他4種不育系的育性；（3）所有的測(cè)驗(yàn)系都是NRO4270ACMS和hau CMS的保持系。Hau CMS是來(lái)源于芥菜型油菜的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，未獲得恢復(fù)系［16］。另外，通過(guò)將NRO4270A CMS與大量的國(guó)內(nèi)外甘藍(lán)型、白菜型等油菜品種測(cè)交，目前仍未篩選得到可以穩(wěn)定恢復(fù)其育性的材料。因此，NRO4270A CMS 與pol CMS、ogu CMS和kos CMS具有明顯不同的恢保關(guān)系。

2．3 NRO4270ACMS花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特性

NRO4270A 與NRO4270B 花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特性比較結(jié)果顯示：在造孢細(xì)胞時(shí)期NRO4270A 和NRO4270B 花粉囊壁形成藥室內(nèi)壁、中層及絨氈層，內(nèi)層為造孢細(xì)胞（圖版Ⅰ，A1、B1）；造孢細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成花粉母細(xì)胞（圖版Ⅰ，A2、B2），通過(guò)減數(shù)分裂形成正常的四分體，四分體被胼胝質(zhì)包圍，NRO4270A 絨氈層較NRO4270B 稍厚（圖版Ⅰ，A3、B3）。

在 單 核 期，NRO4270B 和NRO4270A 花 藥 發(fā)育開(kāi)始出現(xiàn)明顯的差異。（1）單核早期：NRO4270B花粉粒細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞核居于中央，然而NRO4270A花粉粒的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)液泡化，無(wú)花粉外壁的形成，絨氈層細(xì)胞液泡化并逐漸膨大增厚（圖版Ⅰ，A4、B4）。（2）單核中期：與NRO4270B相比，NRO4270A花粉粒的細(xì)胞質(zhì)稀薄并繼續(xù)液泡化，細(xì)胞核大多呈不規(guī)則形狀分布（圖版Ⅰ，A5、B5）。（3）單核晚期：NRO4270B花粉細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大的液泡，細(xì)胞核靠近細(xì)胞壁的一側(cè)（圖版Ⅰ，B6）；NRO4270A 花粉粒細(xì)胞質(zhì)徹底消失，細(xì)胞核解體，絨氈層細(xì)胞也逐漸解體（圖版Ⅰ，A6）并最終消失，藥室內(nèi)僅剩下無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的殘留物，并最終成為空腔（圖版Ⅰ，A7、A8）。相比之下，NRO4270B 的花粉粒在成熟以后，由花藥裂口處散出；絨氈層解體消失，花粉囊壁只剩下表皮和纖維層（圖版Ⅰ，B7、B8）。因此，NRO4270A的花粉敗育發(fā)生在四分體期至單核花粉期。

表3 5種不同細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢保關(guān)系測(cè)定Table 3 Identification of restorer and maintainer relationships between five different CMS types in B．napus

圖2 不同油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的RFLP分析1．pol CMS；2．ogu CMS；3．kos CMS；4～6．NRO4270ACMS；7．hau CMS；8．NRO4270B；9．華雙5號(hào)Fig．2 RFLP analysis of various CMS types in B．napus 1．pol CMS；2．ogu CMS；3．kos CMS；4－6．NRO4270ACMS 7．hau CMS；8．NRO4270B；9．Huashuang 5

2．4 NRO4270ACMS線粒體DNA 的RFLP分析

通過(guò)RFLP 對(duì)不同油菜不育細(xì)胞質(zhì)類型進(jìn)行分類。結(jié)果顯示（圖2），在3種限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ、BamHⅠ和HindⅢ）和6種線粒體探針（atp1、atp6、atp9、orf222、cox2和cob）組成的18個(gè)探針／酶組合中，3個(gè)cob組合在所有的材料中均未檢測(cè)到多態(tài)性，其他的15個(gè)組合均檢測(cè)到多態(tài)性。其中，對(duì) 于NRO4270A 不 育 系，cox2／EcoR Ⅰ組 合 在NRO4270A 和hau CMS中未檢測(cè)到差異；在atp6的3個(gè)組合中，未檢測(cè)到NRO4270A 與ogu CMS或kos CMS 的差異；在其他的11 種探針／酶組合中，NRO4270ACMS 均顯示與pol CMS、ogu CMS、kos CMS、hau CMS、保持系NRO4270B和常規(guī)品種‘華雙5號(hào)’有明顯不同的帶型。因此，結(jié)合恢保關(guān)系測(cè)定及RFLP 分析結(jié)果，說(shuō)明NRO4270A CMS具有與pol CMS、ogu CMS、kos CMS和hau CMS明顯不同的不育細(xì)胞質(zhì)，是一種新型不育胞質(zhì)類型。

3 討 論

本研究顯示，NRO4270A 不育系為典型的無(wú)花粉類型，在不同的環(huán)境條件下其不育度和不育率均為100%，不育性穩(wěn)定，而且NRO4270A 農(nóng)藝性狀優(yōu)良，異交結(jié)實(shí)率高，有利于繁殖不育系種子和生產(chǎn)雜交種。同時(shí)，NRO4270A 與pol CMS、ogu CMS、kos CMS 具有明顯不同的恢保關(guān)系。由于NRO4270A 和hau CMS尚未發(fā)現(xiàn)恢復(fù)系，因此我們并不能明確兩者恢保關(guān)系的差異。但是hau CMS的雄蕊退化為小花瓣，敗育徹底，不能產(chǎn)生花粉［16］，與NRO4270A 花器官的敗育特點(diǎn)存在明顯的差異。根據(jù)植物雄性不育的理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交獲得的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，一般獲得其恢復(fù)系較為困難［1］。考慮到NRO4270A 來(lái)源于蘿卜甘藍(lán)遠(yuǎn)緣雜交的后代，目前我們正試圖從該物種中篩選其恢復(fù)源。

細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果顯示NRO4270A 的花粉敗育主要發(fā)生在四分體期到單核晚期。前人的研究結(jié)果表明，hau CMS 的花藥敗育發(fā)生在雄蕊原基分化期，表現(xiàn)為雄蕊原基不能分化形成花藥，敗育徹底［16］；Pol CMS花藥發(fā)育在孢原細(xì)胞分化時(shí)期受阻，不能形成花粉囊；Ogu CMS花藥發(fā)育受阻于四分體期至單核花粉期，在四分體期以前，其花藥的發(fā)育與正常可育系相似，但是四分體期小孢子從四分體釋放困難，且該時(shí)期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，釋放的小孢子細(xì)胞質(zhì)液泡化，細(xì)胞核不分裂，花粉外壁發(fā)育不良，導(dǎo)致敗育。而且上述不育系絨氈層發(fā)育表現(xiàn)為液泡化和延遲退化［17］。比較而言，NRO4270A 的絨氈層在四分體期開(kāi)始出現(xiàn)液泡化現(xiàn)象，并且隨著花藥的發(fā)育，液泡化現(xiàn)象會(huì)逐漸嚴(yán)重，絨氈層也會(huì)肥大增厚并提前降解。另外，NRO4270A 的花粉粒不能形成花粉外壁，并且不能進(jìn)行正常的有絲分裂形成成熟花粉粒。因此，盡管NRO4270A 與ogu CMS 的敗育時(shí)期相似，然而它們的敗育特點(diǎn)仍然存在一定的差異。結(jié)合植物雄性不育的相關(guān)研究結(jié)果［18－19］，推測(cè)NRO4270A 絨氈層的提前降解可能與其細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）的異常有關(guān)，導(dǎo)致其不能為花粉外壁合成提供所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此花粉粒出現(xiàn)液泡化，并最終降解。

植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的產(chǎn)生與線粒體DNA 的結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)，而且不育區(qū)段編碼產(chǎn)生異常多肽，最終 導(dǎo) 致 雄 性 不 育 現(xiàn) 象［2－8］。NRO4270A 不 育系是由蘿卜甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交后代中選育獲得，推測(cè)蘿卜甘藍(lán)的細(xì)胞質(zhì)置換甘藍(lán)型油菜可育細(xì)胞質(zhì)后，造成細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的基因功能不協(xié)調(diào)，導(dǎo)致了NRO4270A 的雄性不育。本研究中，線粒體DNA 的RFLP分析表明，有15個(gè)探針／酶組合可以區(qū)分不同細(xì)胞質(zhì)。盡管ogu CMS和kos CMS具有相同的恢保關(guān)系，但是RFLP 分析表明在一些探針／酶組合（例如atp6／BamHⅠ）中，它們所檢測(cè)到的帶型并不相同，說(shuō)明二者具有不同的不育機(jī)理，這與前人的研究結(jié)果一致［6］。另外，NRO4270A 的檢測(cè)帶型明顯不同于其他細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，表明NRO4270A 為新型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。而且進(jìn)一步對(duì)NRO4270A 線粒體DNA 的多態(tài)性區(qū)段進(jìn)行序列分析，將為其不育機(jī)理的研究提供更多線索。

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圖版Ⅰ 甘藍(lán)型油菜不育系NRO4270A 和保持系NRO4270B的花藥發(fā)育的顯微解剖結(jié)構(gòu)NRO4270A：A1．造孢細(xì)胞時(shí)期；A2．小孢子母細(xì)胞時(shí)期；A3．四分體時(shí)期；A4．單核早期；A5．單核中期；A6．單核晚期；A7．小孢子和絨氈層細(xì)胞降解；A8．空的花粉囊；NRO4270B：B1．造孢細(xì)胞時(shí)期；B2．小孢子母細(xì)胞時(shí)期；B3．四分體時(shí)期；B4．單核早期；B5．單核中期；B6．單核晚期；B7．二核期；B8．成熟小孢子。PlateⅠ Microscopical structure of anther development in B．napus CMS NRO4270Aand its maintainer line NRO4270B Fig．A1．Sporogenous cell stage；Fig．A2．Microspore mother cell stage；Fig．A3．Tetrad stage；Fig．A4．Early mononucleate stage；Fig．A5．Middle mononucleate stage；Fig．A6．Later mononucleate stage；Fig．A7．Tapetal cells and microspores disappear；Fig．A8．Empty pollen sac；Fig．B1．Sporogenous cell stage；Fig．B2．Microspore mother cell stage；Fig．B3．Tetrad stage；Fig．B4．Early mononucleate stage；Fig．B5．Middle mononucleate stage；Fig．B6．Later mononucleate stage；Fig．B7．Dinucleate stage；Fig．B8．Mature microspore stage．