李 蒙，陳芳霞，呂 寧，陳 鵬

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵712100）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）作為一種健康食 品資源正風(fēng)靡世界，主要在于其含有高生物價(jià)的蛋白質(zhì)和豐富的維生素 ，近年來(lái)的研究表明，黃酮類化合物是苦蕎中重要的營(yíng)養(yǎng)保健功能因子，蘆丁、兒茶素、花青素作為主要黃酮類化合物，具有抗氧化［2］、抗癌［3－4］、降血脂［5］等一系列藥理功效。

在植物類黃酮代謝途徑中，無(wú)色花青素是花青素、兒茶素以及原花色素的共同前體。二氫黃酮醇4－還原 酶（dihydroflavonol 4－reductase，DFR）可 將二氫黃酮醇還原為無(wú)色花青素，是調(diào)控植物體內(nèi)類黃酮代謝物積累的關(guān)鍵功能基因和重要的限速酶之一，催化立體結(jié)構(gòu)專一的三種黃酮醇（二氫山奈酚、二氫槲皮素和二氫楊梅素）生成花色素的前體物［6］，進(jìn)而通過(guò)花色素合成酶（ANS）和類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（3－GT 或5－GT）形成各種花青素苷［7］。由于它的重要性，研究發(fā)現(xiàn)不同物種的DFR 對(duì)3種底物的偏愛(ài)性也存在差異，但DFR 氨基酸序列在很多區(qū)域有較高的同源性，而且在植物的進(jìn)化過(guò)程中DFR 的功能沒(méi)有變化［8］。研究釀酒葡萄DFR 三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，底物特異性結(jié)合區(qū)域由26個(gè)氨基酸組成，其中任何一個(gè)氨基酸的突變都會(huì)改變酶對(duì)底物的特異性［6］，根據(jù)特異區(qū)133位氨基酸的不同，可分為Asn型、Asp型和非Asn／Asp型［9］。

目前已基本探明類黃酮花青素的生物合成途徑，由于DFR 編碼基因是花色改良和提高生物脅迫的關(guān)鍵基因之一，該基因已經(jīng)在不同種得到分離，在擬南芥、大麥、金魚(yú)草、葡萄、水稻、番茄中以單拷貝存在，毛果楊、非洲菊，苜蓿是以功能特性不同的多拷貝存在［10－11］。毛果楊DFR 雙基因轉(zhuǎn)化的煙草中發(fā)現(xiàn)，DFR1可以通過(guò)積累花青素而改變花的顏色，而DFR2只積累濃縮的丹寧（原花青素）［11］。因此，高等植物在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中，DFR 同工酶分別由不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，在促進(jìn)植物進(jìn)化中起著關(guān)鍵作用［12］。植物DFR 的過(guò)量表達(dá)都會(huì)提高黃酮的含量和生物的抗氧化能力［13－15］。

作為類黃酮代謝中關(guān)鍵酶，DFR 對(duì)植物體內(nèi)花青素合成積累起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。李小華等［16］對(duì)不同苦蕎品種間與花青素合成相關(guān)的5個(gè)酶表達(dá)差異的分析表明，DFR 編碼基因的表達(dá)量與苦蕎黃酮類化合物積累相關(guān)。目前，關(guān)于苦蕎DFR 的研究主要集中于轉(zhuǎn)錄水平［17］，而關(guān)于翻譯后DFR 蛋白質(zhì)的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文利用RT－PCR 方法，克隆獲得苦蕎DFR 編碼基因，成功將它導(dǎo)入大腸桿菌中，在優(yōu)化表達(dá)基礎(chǔ)上分離純化苦蕎DFR 重組蛋白，進(jìn)行多克隆抗體的制備。為從翻譯水平分析DFR 的表達(dá)與苦蕎黃酮類化合物累積的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材 料

苦蕎品種榆6－21（榆林農(nóng)業(yè)學(xué)校提供），于大田種植，開(kāi)花3d后采集灌漿期樣品，樣品采集后立即分裝，液氮速凍后于－80 ℃冰箱保存。原核表達(dá)載體pET47b、大腸桿菌菌株BL21（DE3）和TOP10均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．2 方 法

1．2．1 苦蕎總RNA 的提取及cDNA合成 苦蕎種子灌漿期總RNA 的提取參照陳鵬等［18］的方法進(jìn)行，以提取所得總RNA 為模板，Oligo（dT）18為引物，按照RevertAid First Strand cDNA Synthes Kit（Thermo Scientific公司）操作說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

1．2．2 DFR 表達(dá)載體構(gòu)建 據(jù)GenBank 中苦蕎DFR 編碼基因（GU169468．1）mRNA 全長(zhǎng)信息，針對(duì)其ORF 設(shè)計(jì)了1 對(duì)特異引物：上游引物下劃線為SacⅡ酶切位點(diǎn)），下游引物下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），以合成的cDNA 為模板 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條 件：98 ℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，59℃退火20s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化（北京百泰克生物科技有限公司回收試劑盒）和雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA Ligase連接到表達(dá)載體pET47b 后，KCM 方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，陽(yáng)性克隆菌經(jīng)PCR 和測(cè)序（北京奧科鼎盛公司）鑒定。

1．2．3 序列比對(duì)與分析 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast）進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)。應(yīng)用DNAMAN 軟件對(duì)推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)。利用ExPASy 在線軟件對(duì)其進(jìn)行等電點(diǎn)及分子量預(yù)測(cè)（http：／／www．expasy．org／）。

1．2．4 重組蛋白的表達(dá) KCM 方法將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體pET47b－DFR 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取陽(yáng)性克隆單菌落接種到Kana（50μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達(dá)0．6～0．8時(shí)，加入IPTG 至終濃度1mmol／L，37 ℃誘導(dǎo)3 h，收集1．5mL菌體，加入1×SDS－PAGE上樣緩沖液懸浮菌體，沸水保溫10min后進(jìn)行SDS－PAGE。

1．2．5 重組蛋白的可溶性分析 參照文獻(xiàn)［19］的方法優(yōu)化表達(dá)條件，鑒定的重組表達(dá)單菌落接種到Kana（50μg／mL）的LB 培 養(yǎng) 基 中，37 ℃培 養(yǎng) 至OD600值達(dá)0．6～0．8時(shí)，分別加入IPTG 至終濃度為0．15 mmol／L、0．25 mmol／L、0．5 mmol／L 和1 mmol／L，置于22 ℃、30 ℃和37 ℃搖床中震蕩培養(yǎng)，每4h、8h和12h取樣，用SDS－PAGE 檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況，參照文獻(xiàn)［20］進(jìn)行可溶性分析，收集剩余菌體后加入超聲裂解緩沖液（pH 7．5，20 mmol／L Tris－HCl，50 mmol／L NaCl），超聲破碎，12 000r／min，4 ℃離心10min后，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS－PAGE分析。

1．2．6 鈷離子螯合層析純化目的蛋白 收集誘導(dǎo)菌體超聲破碎后，12 000r／min，4℃離心10min，上清與等體積的2×PBS（pH 7．5，0．1 mmol磷酸二氫鈉，0．6 mol／L NaCl）混合，緩慢上樣經(jīng)1×PBS平衡的Talon resin柱上，先1×PBS 洗脫雜蛋白，然后用含20mmol／L咪唑［21］的PBS再次洗脫雜蛋白，最后用含150mmol／L 咪唑的PBS洗脫目標(biāo)蛋白。目 標(biāo) 蛋 白 經(jīng)pH 7．5 的 透 析 液（20 mmol／L Tris－HCl，50mmol／L NaCl）透析后，再通過(guò)PEG－6000濃縮，電泳檢測(cè)，－20 ℃保存。

1．2．7 重組蛋白抗體的制備 將濃縮后的蛋白與2×SDS－PAGE 上 樣 緩 沖 液 混 合，100 ℃煮 沸10 min，進(jìn)行電泳，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250 染色。滅菌水洗滌后，切取目的條帶置于研缽中，加入液氮充分研磨成粉末狀。加入1 mL 1×PBS（pH 7．5）充分溶解［22］、混勻后，將制備好的抗原與等體積弗氏完全佐劑（Sigma）充分乳化后，皮下多點(diǎn)注射免疫2只大耳朵雄兔，每只兔抗原劑量1mg［23］，初次免疫后2 周，抗原與弗氏不完全佐劑（Sigma）等體積充分混勻，免疫劑量減至500μg，皮下多點(diǎn)注射。之后每隔2周加強(qiáng)免疫1次，劑量如二免。3 次加強(qiáng)免疫后測(cè)抗血清效價(jià)，當(dāng)達(dá)到滿意值后，兔心臟穿刺取血，所取血液37℃靜置1h，之后室溫靜置至抗血清析出，收集血清，即得到DFR 的多克隆抗體，－20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．8 抗體的Western blotting檢測(cè) 取1g灌漿期的苦蕎種子，參考李玉萍等［20］加入2mL 可溶蛋白提取液（pH 7．5，10mmol／L Tris－HCl，25mmol／L NaCl），研缽中充分研磨、混勻后置于4 ℃過(guò)夜，10 000r／min，4 ℃離心10min，上清即為種子總蛋白，－20℃保存。參考文獻(xiàn)［24］方法Western blotting分析，苦蕎總蛋白和原核表達(dá)蛋白經(jīng)SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)移至0．15μm 的NC 膜上，50mA電流下轉(zhuǎn)移1h，辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 為二抗（1∶1 000，北京博奧森生物科技有限公司）進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，印跡信號(hào)采用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）進(jìn)行顯色，并利用化學(xué)發(fā)光成像儀（ChemiDocXRS System，Bio－Rad）記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2．1 苦蕎DFR編碼基因片段的擴(kuò)增

用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行DFR 編碼基因PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%（W／V）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示一條1 026bp的特異性擴(kuò)增片段（圖1），與預(yù)期大小一致。測(cè)序結(jié)果表明，本研究擴(kuò)增獲得的苦蕎二氫黃酮醇4－還原酶基因全長(zhǎng)1 026bp，編碼341個(gè)氨基酸，利用在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白分子量為38．53 kD，等電點(diǎn)為5．78，重組蛋白分子量為39．65kD，等電點(diǎn)為6．21。

2．2 重組表達(dá)載體的鑒定與表達(dá)

圖1 DFR 編碼基因的PCR 擴(kuò)增M．DL2000；1、2．DFR 編碼基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 PCR amplification of the coding sequence of DFR M．DL2000；1，2．PCR product of DFR

圖2 DFR 的質(zhì)粒PCR 擴(kuò)增M．DL2000；1～5．DFR 的質(zhì)粒PCR 擴(kuò)增Fig．2 Screening of positive recombinant plasmid by plasmid PCR M．DL2000；1－5．Plasmid PCR of five recombinant plasmids

圖3 DFR 誘導(dǎo)表達(dá)的SDS－PAGE分析M．蛋白marker；1、3．誘導(dǎo)前對(duì)照菌；2、4．誘導(dǎo)表達(dá)菌體Fig．3 SDS－PAGE analysis of the expression of DFR M．Protein marker；1，3．Uninduced cells containing pET47b－DFR；2，4．Induced cells containing pET47b－DFR

圖4 目的蛋白的可溶性表達(dá)分析M．蛋白marker；1．未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2．誘導(dǎo)的菌體蛋白；3．誘導(dǎo)菌株超聲波裂解后的沉淀；4．誘導(dǎo)菌株超聲波裂解后的上清Fig．4 The solubility analysis of recombinant M．Protein marker；1．Uninduced cells containing pET47b－DFR；2．Induced cells containing pET47b－DFR；3．Insoluble protein from induced cell containing pET47b－DFR；4．Soluble protein from induced cell containing pET47b－DFR

圖5 純化蛋白的SDS－PAGE分析M．蛋白marker；1～3．純化的目的蛋白Fig．5 SDS－PAGE analysis of purified DFR M．Protein marker；1－3．Purified protein

圖6 DFR 的Western blotting分析1．誘導(dǎo)后的目的蛋白；2．未重組表達(dá)載體的菌體蛋白；3．苦蕎種子灌漿期中總蛋白Fig．6 Western blotting analysis of DFR 1．Total protein from induced cell containing pET47b－DFR；2．Induced cells containing pET47b；3．Total protein of seed filling period of buckwheat

將構(gòu)建好的重組載體進(jìn)行PCR 鑒定，瓊脂糖電泳結(jié)果（圖2）顯示PCR擴(kuò)增的片段與預(yù)期大小一致，測(cè)序結(jié)果也證實(shí)DFR 的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21（DE3），誘導(dǎo)后經(jīng)SDS－PAGE分析，在35～45kD 之間有明顯的誘導(dǎo)表達(dá)條帶，其大小與預(yù)測(cè)的重組蛋白分子量大小相符（圖3），說(shuō)明重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。為了獲得最大可溶性目的蛋白產(chǎn)量，獲得pET47b－DFR表達(dá)菌株最佳誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)溫度22 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間10h、IPTG 濃度0．15mmol／L，SDS－PAGE 分析目的蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中分別以上清與包涵體形式存在（圖4）。

2．3 重組蛋白的純化與抗體制備

將含重組蛋白的上清經(jīng)過(guò)鈷離子螯合層析柱純化后，SDS－PAGE檢測(cè)結(jié)果表明鈷柱Talon resin實(shí)現(xiàn)了該重組蛋白的高效純化（圖5）。為徹底除去目的蛋白中可能存在的微量雜蛋白，將純化的目的蛋白SDS－PAGE（20cm×20cm）電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后切取目標(biāo)條帶，滅菌水洗滌后進(jìn)行兔抗苦蕎DFR 多克隆抗體制備。

2．4 多克隆抗體的Western blotting檢測(cè)

利用Western blotting 檢測(cè)制備抗體的特異性，結(jié)果顯示原核表達(dá)的融合蛋白、苦蕎種子灌漿期總蛋白與抗血清雜交顯示單一條帶，而未重組表達(dá)載體的菌體蛋白沒(méi)有雜交出任何條帶（圖6），說(shuō)明該抗體具有較高的特異性，且在灌漿期的苦蕎種子中含有大量的DFR 蛋白。由于重組蛋白DFR 含有組氨酸標(biāo)簽，Western blotting中灌漿期苦蕎種子雜交的蛋白條帶較原核表達(dá)的蛋白分子量略小。

3 討 論

苦蕎種子富含氨基酸均衡的蛋白質(zhì)和高生物活性的黃酮類物質(zhì)，是典型的藥糧兼用作物。灌漿期是苦蕎營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)累積與合成的關(guān)鍵時(shí)期，研究該時(shí)期籽粒中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)累積及次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律對(duì)于提高苦蕎的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值具有重要理論和應(yīng)用價(jià)值［18］。二氫黃酮醇4－還原酶是苦蕎次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶和一個(gè)重要的調(diào)控位點(diǎn)，不但參與黃酮類化合物的累積［15，25］，而且參與顯花植物雄性能育過(guò)程［26］。植物DFR 與哺乳動(dòng)物3β－羥基類固醇脫氫酶通過(guò)蛋白序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們由同一個(gè)祖先演化而來(lái)［27］，至今人們從多種植物分離并鑒定出DFR 編碼基因，研究結(jié)果顯示，DFR 同源基因都具有一個(gè)典型的NADP結(jié)合位點(diǎn)和26個(gè)氨基酸組成的底物特異性結(jié)構(gòu)域［28］。祝婷等［29］首次克隆了苦蕎DFR 編碼基因，到目前關(guān)于其蛋白質(zhì)相關(guān)的研究還未有報(bào)道，本研究從苦蕎灌漿期種子中克隆得到DFR 編碼基因，利用DNAMAN 軟件分析，發(fā)現(xiàn)其具有DFR 同源基因的典型特征和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，推測(cè)苦蕎DFR 編碼基因編碼蛋白具有催化活性，相關(guān)文獻(xiàn)表明大腸桿菌和酵母中表達(dá)的DFR 也都具有酶活和底物偏愛(ài)性［19，30－31］。由于目前對(duì)大腸桿菌的遺傳背景和生理特性研究了解得比較清楚，無(wú)未知干擾蛋白的產(chǎn)生，為獲得高純度融合蛋白提供有力工具。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建DFR 原核重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），實(shí)現(xiàn)了該基因的原核表達(dá)，但原核高效的表達(dá)系統(tǒng)，使部分蛋白不能有效正確折疊形成了包涵體，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，找到了獲得大量可溶性蛋白的途徑：首先菌體的活化過(guò)程，嚴(yán)格控制菌液OD600值達(dá)0．6～0．8進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度22 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間10h、IPTG 濃度0．15mmol／L，使用固定化鈷離子結(jié)合HIS標(biāo)簽純化蛋白，適宜濃度咪唑洗脫，最終獲得高純度DFR融合蛋白，為深入研究苦蕎DFR 的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、催化特性奠定了基礎(chǔ)。

真核生物次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控包含轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平等多個(gè)層次，目前關(guān)于DFR 編碼基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究在許多植物中都已經(jīng)取得了突破，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響植物次生代謝物的合成和累積［12，32］。而探討苦蕎次生代謝物的累積與DFR 表達(dá)的關(guān)系，從翻譯水平入手更具現(xiàn)實(shí)意義，免疫學(xué)技術(shù)是研究蛋白質(zhì)表達(dá)水平的有效方法，本研究通過(guò)原核表達(dá)獲得大量的目的蛋白，通過(guò)親和層析，得到高純度目的蛋白作為抗原，免疫兔后獲得DFR 多克隆抗體，Western blotting顯示獲得的抗體特異性好，背景低，可以為進(jìn)一步開(kāi)展DFR 蛋白酶在不同苦蕎品種、不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和不同組織內(nèi)的蛋白表達(dá)譜以及蛋白定位等方向的研究提供有利工具。

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