龐得全，王英曼，戴云飛，白靜，鄭維國(guó)，宮鳳玲，趙志宇

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 放療科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，河北 唐山 063000；3.華北理工大學(xué) 藥理系，河北 唐山 063000；4.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 急診科，河北 唐山 063000；5.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，河北 唐山 063000；6.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 口腔科，河北 唐山 063000)

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瘤內(nèi)siRNA干擾血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)惡性黑色素瘤的放射增敏作用

龐得全1，王英曼2，戴云飛1，白靜3，鄭維國(guó)4，宮鳳玲5，趙志宇6

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 放療科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，河北 唐山 063000；3.華北理工大學(xué) 藥理系，河北 唐山 063000；4.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 急診科，河北 唐山 063000；5.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，河北 唐山 063000；6.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 口腔科，河北 唐山 063000)

目的 研究瘤內(nèi)siRNA干擾VEGF的表達(dá)對(duì)惡性黑色素瘤放射敏感性的影響。方法 首先建立惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型，采用脂質(zhì)體包裹的小RNA干擾技術(shù)，將惡性黑色素瘤移植瘤裸鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、VEGF陰性質(zhì)粒組、VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組，每周2次測(cè)腫瘤體積，計(jì)算腫瘤體積抑瘤率；HE染色進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，計(jì)算腫瘤橫斷面壞死面積率；免疫組化法測(cè)定瘤體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)。結(jié)果 VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組VEGF的表達(dá)減弱(P<0.05)，VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組有較多的組織壞死，腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制(P<0.05)。結(jié)論 瘤內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的siRNA-VEGF對(duì)惡性黑色素瘤有放射增敏作用，為臨床開展針對(duì)VEGF基因的靶向治療和放射治療的聯(lián)合治療惡性黑色素瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；siRNA；放療敏感性；惡性黑色素瘤；凋亡

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是目前發(fā)生率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一，惡性度高，預(yù)后較差[1]。我國(guó)MM較少見，但發(fā)病率逐年升高，手術(shù)治療是其主要治療手段，但我國(guó)MM患者因就診時(shí)病期較晚而失去手術(shù)機(jī)會(huì)。放射治療是治療惡性腫瘤的重要輔助手段之一，然而惡性黑色素瘤對(duì)放射治療不敏感[2]，限制了放射治療的應(yīng)用。如何增加惡性黑色素瘤的放射敏感性一直是放療研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[3]。通過基因治療方式改變腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在放射敏感性是一種新的增敏方式，它除具有增敏效果外，還具有直接或間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和刺激免疫反應(yīng)的作用。

惡性黑色素瘤是一種高血管侵襲性的腫瘤，抑制其血管生成是重要的治療手段[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知活性最強(qiáng)的促血管生成因子，與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[5-6]。VEGF是輻射后血管增殖重要的調(diào)節(jié)因子，它和抗凋亡蛋白Bcl-2具有協(xié)同作用，增加機(jī)體和腫瘤組織對(duì)輻射的抗性。研究表明，惡性黑色素瘤中VEGF表達(dá)較色素痣明顯增高[7]，缺氧是VEGF最重要的誘導(dǎo)因素，放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)可加重腫瘤微環(huán)境的乏氧狀態(tài)，誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)乏氧細(xì)胞對(duì)射線抗拒。因此，VEGF是重要的放療敏感性的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以VEGF為靶點(diǎn)，應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，在體內(nèi)觀察其對(duì)A375細(xì)胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 惡性黑色素瘤細(xì)胞A375購(gòu)自ATCC，用添加了10%胎牛血清(購(gòu)自Gibco)和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合到80%時(shí)傳代。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c雌性裸鼠25只，其中一只用來培養(yǎng)移植瘤，4周齡，體質(zhì)量14～16 g，由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(冀)2010-0038]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在華北理工大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)1周后用于試驗(yàn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基(RPMI 1640)、L-谷氨酰胺以及胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司；VEGF siRNA由上海吉瑪生物公司合成；VEGF一抗，二抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天公司；其他常規(guī)試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.4 儀器：DHP-9272細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海呈天實(shí)驗(yàn)儀器公司)；DYY-11型凝膠電泳儀(北京六一實(shí)驗(yàn)儀器公司)；Mias系列圖像處理系統(tǒng)購(gòu)；Eclipse Ci-E正置顯微鏡(尼康)。

1.2 方法

1.2.1 VEGF-siRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定：VEGF-siRNA質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪生物公司：根據(jù)GenBank(access number U75285)人VEGF基因mRNA的已知序列，尋找符合特征的靶序列，使用Genscript公司在線設(shè)計(jì)軟件(http：//www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai)，合成針對(duì)編碼區(qū)(399-417)堿基序列的1條DNA寡核苷酸鏈，同時(shí)設(shè)計(jì)1條negative序列用于對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，該序列與siRNA序列有相同的組成，但是和VEGF mRNA沒有明顯的同源性。通過BLAST軟件進(jìn)行序列同源性分析，與人類其他基因無(wú)同源性，設(shè)計(jì)序列如下：

VEGF-siRNA：5’-GAAAGATAGAGCAAGACAAttcaagaga TTG-TCTTGCTCTATCTTTC-3’；對(duì)照-siRNA：5’-GTATAAG-TCAACTG-TTGACttcaagagaGTCAACAGTTGACTTATAC-3’。

化學(xué)合成各單鏈DNA片段退火形成雙鏈DNA，定向克隆至BamHⅠ和HindⅢ雙切空質(zhì)粒pRNAT-U6.1中，獲得siRNA的表達(dá)載體。

1.2.2 惡性黑色素瘤裸鼠皮下種植瘤模型的建立和干預(yù)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁生長(zhǎng)的A375細(xì)胞，胰酶消化，PBS液吹打懸浮細(xì)胞，離心5 min，棄上清，PBS液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)5.0×104個(gè)/ μL。A375細(xì)胞懸液搖勻后注射250 μL于裸鼠右腋部皮下，待接種的瘤細(xì)胞成瘤并直徑達(dá)到1.0 cm時(shí)，處死動(dòng)物，剝離腫瘤塊，用銳利刀片縱向均勻切成24份，分別轉(zhuǎn)種于24只5周齡裸鼠右腋部皮下，以皮下結(jié)節(jié)長(zhǎng)徑超過0.5 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。轉(zhuǎn)種后1周達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)，然后進(jìn)行治療。

實(shí)驗(yàn)分為3組，每組8只：①空白對(duì)照組：瘤內(nèi)注射0.1 mL PBS；②VEGF陰性質(zhì)粒組：無(wú)關(guān)干擾聯(lián)合放療組，在瘤體內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的對(duì)照siRNA質(zhì)粒20 μg；③VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組： siRNA-VEGF聯(lián)合放療組，瘤內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的siRNA-VEGF質(zhì)粒20 μg。第1周予BJ-6型直線加速器照射瘤體局部4Gy，瘤體表面覆蓋1cm厚凡士林紗布。每周質(zhì)粒注射2次，共4次。

1.2.3 Western blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)VEGF的表達(dá)：Western blot：收集腫瘤組織塊，加入1 mL蛋白裂解液，研磨后12000 r/min離心，取上清，按照CBA蛋白定量試劑盒使用說明檢測(cè)蛋白濃度。每管加入緩沖液，95 ℃煮沸5 min，蛋白樣品用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白電轉(zhuǎn)到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加相應(yīng)的鼠抗兔VEGF一抗(稀釋1000倍)4 ℃過夜，加入相應(yīng)的偶聯(lián)兔抗人VEGF二抗(稀釋1000倍)2 h，用ECL發(fā)光法檢測(cè)，成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以目的條帶與Actin條帶的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)：獲取腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)包埋，制片。

1.2.4 腫瘤壞死面積測(cè)量：每周測(cè)量惡性腫瘤的長(zhǎng)(a)寬(b)高(c)，以公式計(jì)算腫瘤體積=(a×b×c)π/6 mm3。腫瘤壞死面積：面積計(jì)算采用Image-Pro-Plus軟件，首先選中腫瘤部位，軟件自動(dòng)獲得面積所占像素?cái)?shù)，根據(jù)比例尺獲得的像素-長(zhǎng)度比例(mm2/像素)將面積換算為絕對(duì)面積(mm2)。

2 結(jié)果

2.1 瘤內(nèi)注射重組質(zhì)粒對(duì)惡性黑色素瘤VEGF表達(dá)的影響 空白對(duì)照組移植瘤注射PBS和VEGF陰性質(zhì)粒組2周后VEGF的表達(dá)沒有顯著影響，而VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組可以顯著抑制移植瘤VEGF的表達(dá)(見圖1A)。Western blot半定量分析表明(見圖1B)，VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組明顯抑制了VEGF蛋白的表達(dá)，蛋白表達(dá)量只有空白對(duì)照組的(12.66±1.57)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明pRNAT-U6.1-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)VEGF 蛋白的表達(dá)起到了抑制作用。見圖1、圖2。

圖1 瘤內(nèi)注射重組質(zhì)粒對(duì)惡性黑色素瘤VEGF免疫組化(A)及Western blot(B)結(jié)果(n=8)Fig.1 Expression of immunohistochemical(A) and Western blot(B) of melanocarcinoma by tumor injected recombinant plasmid(n=8)

圖2 瘤內(nèi)注射重組質(zhì)粒對(duì)惡性黑色素瘤VEGF表達(dá)百分率比較(n=8)**P<0.01，與空白對(duì)照組比較Fig.2 Comparison of expression percentage of melanocarcinoma by tumor injected recombinant plasmid(n=8)**P<0.01，compared with control group

2.2 瘤內(nèi)注射si-VEGF重組質(zhì)粒對(duì)惡性黑色素瘤放療敏感性的影響 瘤內(nèi)注射重組質(zhì)粒，每周測(cè)量并計(jì)算惡性腫瘤的長(zhǎng)(a)寬(b)高(c)，以公式腫瘤大小=(a×b×c)π/6 mm3。照射前移植瘤體積：空白對(duì)照組：(11.870±1.230)mm3；VEGF陰性質(zhì)粒組：(11.770±1.030)mm3；VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組：(11.660±1.056)mm3，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單純給予siRNA-VEGF質(zhì)粒2周后即可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)2周后移植瘤體積：空白對(duì)照組：(14.902±1.392)mm3；VEGF陰性質(zhì)粒組：(16.528±1.461)mm3；VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組：(13.152±1.136)mm3；VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組低于空白對(duì)照組，(P<0.05)。VEGF陰性質(zhì)粒組高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 瘤內(nèi)注射si-VEGF對(duì)惡性黑色素瘤生長(zhǎng)的作用(n=8)*P<0.05，與空白對(duì)照組比較Fig.3 Effect of si-VEGF intra-tumoral injection on the volume of melanoma (n=8)*P<0.05，compared with control group

注射質(zhì)粒4次，并給予放射治療后腫瘤體積計(jì)算同上，在照射后第2周腫瘤體積siRNA-VEGF組與對(duì)照組比較顯著減少，第3次注射后移植瘤體積：空白對(duì)照組：(5.026±0.462)mm3；VEGF陰性質(zhì)粒組：(6.549±0.469)mm3；VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組：(4.261±0.436)mm3； VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組低于VEGF陰性質(zhì)粒組(P<0.01)；第4次注射后移植瘤體積：空白對(duì)照組：(4.102±0.248)mm3；VEGF陰性質(zhì)粒組：(4.862±0.468)mm3；VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組：(2.654±0.363)mm3； VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組低于VEGF陰性質(zhì)粒組(P<0.01)。見圖4。

圖4 瘤內(nèi)注射si-VEGF重組質(zhì)粒對(duì)放療后惡性黑色素瘤大小的影響(n=8)**P<0.01，與VEGF陰性質(zhì)粒組比較Fig.4 Effect of si-VEGF intra-tumoral injection on the volume of melanoma after radiation(n=8)**P<0.01,compared with VEGF negtive plasmid group

VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組與對(duì)照組比較，腫瘤壞死面積顯著增加，空白對(duì)照組：(6.734±0.449)mm2；VEGF陰性質(zhì)粒組：(5.243±0.584)mm2；VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組：(11.760±1.435)mm2；VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組大于空白對(duì)照組和VEGF陰性質(zhì)粒組，(P<0.001)。見圖5。

圖5 瘤內(nèi)注射si-VEGF重組質(zhì)粒對(duì)惡性黑色素瘤壞死面積的影響(n=8)ΔΔΔP<0.001，與VEGF陽(yáng)性質(zhì)粒組比較Fig.5 Effect of si-VEGF intra-tumoral injection on the area of melanoma necrosis after radiation (n=8)ΔΔΔP<0.001，compared with VEGF positive plasmid group

3 討論

惡性黑素瘤是由皮膚和其他器官黑素細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤，皮膚黑素瘤表現(xiàn)為色素性皮損在數(shù)月或數(shù)年中發(fā)生明顯改變。其發(fā)病率雖低，但其惡性度高，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，死亡率高，因此早期診斷、早期治療很重要。對(duì)早期未轉(zhuǎn)移的病變應(yīng)行根治性手術(shù)切除，應(yīng)根據(jù)Breslow深度確定切除范圍，如果是指(趾)惡性黑素瘤，可采用截指(趾)術(shù)。應(yīng)切除受累淋巴結(jié)，但預(yù)防性淋巴結(jié)切除仍有爭(zhēng)議。肢體動(dòng)脈灌注抗有絲分裂藥物治療肢體黑素瘤有一定療效。對(duì)于發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移者可采用聯(lián)合化療和放射治療。生物化學(xué)治療和分子靶向治療具有很大的前景。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果得出，免疫組化與Western blot 均發(fā)現(xiàn)了pRNAT-U6.1-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)VEGF 蛋白的表達(dá)起到了抑制作用，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。通過使用BJ-6型直線加速器照射瘤體局部4Gy后，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF抑制組腫瘤體積顯著減少，提示了應(yīng)用pRNAT-U6.1-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)腫瘤放療敏感性的提高。目前已經(jīng)有研究針對(duì)VEGF和VEGF受體下游酪氨酸激酶的小分子靶向抑制藥物和阻斷性單克隆抗體，取得了一定的效果[8]。然而這些治療存在著半衰期短，潛在的全身性副作用等自身不足，限制了其臨床應(yīng)用。siRNA干擾技術(shù)是最新的基因阻斷技術(shù)，由雙鏈RNA介導(dǎo)、在轉(zhuǎn)錄后mRNA 水平關(guān)閉相應(yīng)基因的表達(dá)，是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在某種程度上可以達(dá)到基因敲除的效果[9]。siRNA 干擾技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的反義核酸、基因剔除等技術(shù)，具有嚴(yán)格序列特異性、治療針對(duì)性強(qiáng)、級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，故成為基因功能探索與治療的全新研究手段，應(yīng)用RNAi 技術(shù)抑制內(nèi)外源性致病基因的表達(dá)正成為基因治療的研究熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外已有使用siRNA干擾技術(shù)基因沉默VEGF基因在卵巢癌、膀胱癌等腫瘤中的表達(dá)的相關(guān)研究報(bào)道[10-13]。結(jié)果表明，VEGF-siRNA抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡，但VEGF -siRNA是否能增加惡性黑色素瘤細(xì)胞放射敏感性的研究未見報(bào)道。

然而目前siRNA干擾技術(shù)仍然存在著一些問題，包括RNA干擾的序列選擇、衰減現(xiàn)象、轉(zhuǎn)染效率等等，因此單純的RNAi阻斷VEGF基因表達(dá)并不容易取得理想的腫瘤治療效果。本實(shí)驗(yàn)研究?jī)H限于裸鼠體內(nèi)研究，而人體內(nèi)微環(huán)境更加復(fù)雜，干擾因素更多，如何真正在人體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因治療及其放療增敏機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(編校：譚玲)

Effect of siRNA interfering vascular endothelial growth factor on radiation sensitization of malignant melanoma

PANG De-quan1, WANG Ying-man2, DAI Yun-fei1, BAI Jing3, ZHENG Wei-guo4, >GONG Feng-ling5, ZHAO Zhi-yu6

(1．Department of Radiotherapy, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 2.Department of Hematology, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 3.Department of Pharmacology, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 4.Department of Emergency, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 5.Department of Radiology, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 6.Department of Stomatology, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo investigate the role of a small RNA interference against VEGF in radiation sensitivity in melanoma.MethodsA375 human melanoma cell lines were transplanted into nude mice，which with malignant melanoma were randomly divided into control group, VEGF negative plasmid group and VEGF positive plasmid group, followed by 4Gy irradiation twice a week for 2 weeks. The volume of tumor was calculated twice a week， the area of tumor necrosis was assayed by HE，the expression of VEGF in tumor was determined by Western-blot and Immunohistochemical.ResultsThe expression of VEGF in VEGF positive plasmid group decreased significantly (P<0.05), VEGF positive group had more tissue necrosis, tumor growth was significantly inhibited (P<0.05).ConclusionsiRNA-VEGF in tumor injection liposome encapsulated in malignant melanoma has a role in the radiation sensitization, which provides an experimental basis for the clinical development of targeted therapy combined with radiotherapy for the treatment of VEGF gene.

vascular endothelial growth factor; siRNA; radiation sensitivity; malignant melanoma; apoptosis

唐山市科技局指令性計(jì)劃(12140209A-30)；河北省科技廳 (112761175)

龐得全，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤放射增敏及腫瘤分子生物學(xué)；腫瘤放射治療和綜合治療，E-mail: pdq1974@aliyun.com。

R739.5

A

1005-1678(2015)08-0048-04