吳姍姍，周展，陳樞青

(浙江大學 藥學院/浙江省抗腫瘤藥物臨床前研究重點實驗室，浙江 杭州 310058)

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腫瘤細胞膜蛋白體細胞突變分析

吳姍姍，周展Δ，陳樞青Δ

(浙江大學 藥學院/浙江省抗腫瘤藥物臨床前研究重點實驗室，浙江 杭州 310058)

目的 篩選腫瘤細胞特異性膜蛋白胞外突變(特異性膜表面蛋白突變)，以期尋找癌癥精準醫(yī)療的作用靶點。方法 收集7042個腫瘤樣本的體細胞突變信息，通過對體細胞突變位點進行基因定位分析，篩選出全部特異性膜蛋白胞外突變，并統(tǒng)計分析這些突變的整體分布情況，鑒定特異性膜蛋白胞外突變頻率較高的基因、突變位點以及腫瘤類型。結(jié)果 對7042個腫瘤樣本的4938362個體細胞突變，共篩選出97193個特異性膜蛋白胞外突變，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示這些突變涉及4347個基因，包括65532個基因位點。進一步分析鑒定出發(fā)生特異性膜蛋白胞外突變頻率較高的5個基因(MUC16、LRP1B、CSMD3、RYR2、USH2A)，1個突變位點(17:37868208)以及6個腫瘤類型(結(jié)直腸癌、黑素瘤、子宮癌、腦膠質(zhì)瘤、肺癌和胃癌)。結(jié)論 建立了特異性膜蛋白胞外突變信息庫，并得到了該類突變的整體分布情況，為尋找癌癥精準醫(yī)療的作用靶點提供了信息參考。

癌癥精準醫(yī)療；作用靶點；體細胞突變；特異性膜蛋白胞外突變

科學界普遍認為體細胞突變是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]，編碼區(qū)的體細胞突變會造成蛋白質(zhì)異常，從而形成腫瘤特異性抗原。造成蛋白質(zhì)異常的體細胞突變大部分是能造成單個氨基酸置換的非同義點突變[2]。膜蛋白是細胞的關鍵分子，也是重要的藥物作用靶點，許多膜蛋白都暴露于細胞表面，且?guī)缀?0%的藥物都以膜蛋白為受體作藥物作用靶點[3-6]。

雖然化療已經(jīng)成為癌癥治療的一個必要手段，然而，細胞毒性試劑(化學治療劑)無法特異性殺傷腫瘤細胞，且存在較大副作用。常規(guī)的其他治療方法如放療和手術同樣存在缺乏特異性的問題。隨著測序技術、分子生物學和生物信息學的快速發(fā)展，癌癥精準醫(yī)療方法如靶向治療和免疫治療逐漸成為研究熱點。靶向治療如抗體類藥物能夠特異性的靶向腫瘤細胞，具有特異性抗腫瘤作用，并且毒性明顯減少。其中抗體偶聯(lián)藥物(antibody-drug conjugates，ADCs)的腫瘤特異性高，副作用低，且其治療效果優(yōu)于一般單克隆抗體[7-9]。研究表明，奧法木單抗偶聯(lián)有絲分裂抑制劑MMAE(OFA-vcMMAE)能特異性識別慢性淋巴細胞白血病腫瘤細胞表面的CD20并造成有效殺傷[10]。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)偶聯(lián)MMAE(TRAIL-vcMMAE)具有高效靶向殺傷腫瘤細胞的效果，此處TRAIL可作為“靶向彈頭”代替抗體[11]。而嵌合抗原受體T細胞免疫療法(chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy，Car-T)作為免疫治療的一種也是癌癥治療的研究熱點之一。然而，尋找準確的藥物作用靶點是靶向治療和免疫治療發(fā)揮作用的關鍵，目前還沒有較全面的尋找腫瘤特異性抗原的方法。本研究旨在通過生物信息學方法對7042個腫瘤樣本(來自30個腫瘤類型)的4938362個體細胞突變進行細胞膜表面蛋白突變分析，通過對突變位點的基因定位分析篩選出全部特異性膜蛋白胞外突變并對其進行統(tǒng)計分析，建立全面篩選靶向治療和免疫治療潛在藥物作用靶點的參考信息庫。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與數(shù)據(jù)庫 7042個腫瘤樣本的體細胞突變數(shù)據(jù)源于公共數(shù)據(jù)庫COSMIC(Catalogue of somatic mutations in cancer)[12]和TCGA(The cancer genome atlas)[13]及已發(fā)表的相關數(shù)據(jù)[1]；細胞膜蛋白預測數(shù)據(jù)源于The human protein atlas[14](http://www.proteinatlas.org/)；Gene Cards人類基因數(shù)據(jù)庫[15]和David基因功能注釋數(shù)據(jù)庫[16]提供基因功能注釋信息；Ensembl數(shù)據(jù)庫[17]提供基因和編碼蛋白的序列信息。

1.2 方法

1.2.1 細胞膜蛋白篩選及其胞外區(qū)域氨基酸位點定位：從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載人類基因組所有編碼蛋白質(zhì)的序列，利用TMHMM(TransMembrane prediction using Hidden Markov Models)在線預測服務器預測所有蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的信息(包括跨膜區(qū)數(shù)量、跨膜區(qū)序列、胞內(nèi)序列和胞外序列)，從中篩選出跨膜區(qū)≥1的膜蛋白，并對膜蛋白處于胞外區(qū)域的氨基酸位點進行定位，結(jié)合人類蛋白質(zhì)組計劃鑒定出的膜蛋白[14]進行基因信息匹配，最終篩選出細胞膜蛋白及其胞外區(qū)域。

1.2.2 篩選膜蛋白胞外氨基酸突變：從7042個樣本的所有體細胞突變數(shù)據(jù)中篩選出全部的氨基酸突變，根據(jù)細胞膜蛋白及其胞外區(qū)域數(shù)據(jù)信息篩選出膜蛋白胞外氨基酸突變。

1.2.3 分類篩選：樣本中包含插入缺失和點突變，由于插入缺失容易造成移碼突變，產(chǎn)生與正常蛋白完全不同的多肽段，改變膜蛋白跨膜性質(zhì)。因此，本研究分析點突變形成的潛在腫瘤特異性抗原，利用生物信息學方法對所有體細胞突變位點進行基因定位分析，篩選造成膜蛋白胞外氨基酸發(fā)生置換的體細胞突變，并對突變前后氨基酸性質(zhì)的變化進行分析，從中篩選出氨基酸性質(zhì)發(fā)生變化的特異性膜蛋白胞外氨基酸突變。

1.3 統(tǒng)計學方法 對同一個基因位點突變所造成的特異性膜蛋白胞外氨基酸突變進行信息整合，并進行樣本來源信息匹配，附上樣本所對應的腫瘤類型信息。結(jié)合生物信息及統(tǒng)計分析軟件對篩選得到的特異性膜蛋白胞外突變進行統(tǒng)計分析，主要分析3項內(nèi)容：每個樣本所發(fā)生的特異性膜蛋白胞外突變的數(shù)量；7042個樣本的特異性膜蛋白胞外突變所涉及的基因及其出現(xiàn)次數(shù)；7042個樣本的特異性膜蛋白胞外突變所涉及的基因突變位點及其出現(xiàn)的次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 特異性膜蛋白胞外突變篩選情況 特異性膜蛋白胞外突變的篩選流程及結(jié)果見圖1。共篩選出97193個特異性膜蛋白胞外區(qū)突變。研究表明，造成蛋白質(zhì)異常的突變大部分是能造成單個氨基酸置換的編碼區(qū)域非同義點突變[2]。這97193個特異性膜蛋白胞外突變是致使膜蛋白胞外區(qū)氨基酸發(fā)生置換的點突變，本研究對這些突變進行深入考察。

圖1 特異性膜蛋白胞外區(qū)突變篩選流程圖Fig.1 Flow chart of the selection of specific mutations in membrane surface proteins

2.2 特異性膜蛋白胞外突變數(shù)在腫瘤樣本中的分布 統(tǒng)計結(jié)果顯示，7042個樣本中有5993個樣本發(fā)生特異性膜蛋白胞外突變，單個樣本特異性膜蛋白胞外突變數(shù)由1～811共有201類。突變數(shù)在100以上的樣本主要來自6個腫瘤類型，分別為結(jié)直腸癌(colorectal cancer)、黑素瘤(melanoma)、子宮癌(uterine cancer)、腦膠質(zhì)瘤(brain lower grade glioma)、肺腺癌(lung adenocarcinoma)和胃癌(stomach adenocarcinoma)，這說明這些腫瘤被找到潛在靶點的可能性較大。而其他樣本的突變數(shù)主要在1～20之間密集，10以下尤其密集(4207個樣本，占比70.2%)。由于數(shù)據(jù)量龐大，僅取具有代表性的突變數(shù)即10以下和500以上的統(tǒng)計結(jié)果作展示，見圖2。樣本的特異性膜蛋白胞外突變數(shù)越大，該樣本找到潛在靶點的可能性越大。由統(tǒng)計結(jié)果可知，30個腫瘤類型均有可能在腫瘤細胞膜表面蛋白上找到潛在靶點。

圖2 單個樣本特異性膜蛋白胞外突變數(shù)在腫瘤類型中的分布Fig. 2 The distribution of the number of specific mutations in membrane surface proteins in a single sample across human cancer types

2.3 涉及特異性膜蛋白胞外突變的基因 統(tǒng)計分析結(jié)果表明97193個特異性膜蛋白胞外突變共涉及到4347個基因。“基因出現(xiàn)次數(shù)”指所有樣本在該基因上發(fā)生特異性膜蛋白胞外突變的數(shù)量總和，基因出現(xiàn)的次數(shù)越大，該基因發(fā)生特異性膜蛋白胞外突變的可能性越大。有28個基因含有超過200次的基因出現(xiàn)次數(shù)，見圖3。

其中5個基因的出現(xiàn)次數(shù)大于600次，分別為ENSG00000181143 (MUC16)、ENSG00000168702(LRP1B)、ENSG00000164796(CSMD3)、ENSG00000198626 (RYR2)和ENSG00000042781(USH2A)，見表1。除表1所示的基因功能信息外，有研究表明，膽囊癌和急性淋巴細胞白血病的體細胞突變中分別有CSMD3突變[18]和USH2A突變[19]。

表1 基因功能信息表

2.4 涉及特異性膜蛋白胞外突變的基因位點 由統(tǒng)計分析結(jié)果可知，97193個特異性膜蛋白胞外突變是65532個基因位點上的突變?！盎蛲蛔兾稽c出現(xiàn)次數(shù)”表示在該基因位點上發(fā)生特異性膜蛋白胞外突變的樣本數(shù)，基因突變位點出現(xiàn)次數(shù)在各腫瘤類型的樣本中的分布代表了該基因突變位點在30個腫瘤類型中的普及性。統(tǒng)計結(jié)果表明，大部分基因突變位點只出現(xiàn)1次，僅8個基因突變位點出現(xiàn)次數(shù)≥8，見表2。

對這8個基因突變位點進一步分析可得它們在30個腫瘤類型各個樣本中的分布情況，見圖4。統(tǒng)計結(jié)果表示，出現(xiàn)次數(shù)最高的基因突變位點是17:37868208(17號染色體的37868208位點)，位于ERBB2蛋白質(zhì)編碼基因，且其涉及到的腫瘤類型最多，分別為膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、肺腺癌、卵巢癌和胃癌。發(fā)生特異性膜蛋白胞外突變的基因突變位點所涉及的腫瘤類型越多，越有助于拓寬靶向該突變位點藥物的腫瘤治療范圍。

表2 基因突變位點出現(xiàn)次數(shù)

圖4 高頻次出現(xiàn)的基因突變位點在腫瘤類型中的分布基因突變位點“A:B”表示“染色體位置:該染色體上的位點”Fig.4 The distribution of gene mutation sites with high frequency of occurrence across human cancer types Gene mutation site “A:B” represents “chromosome:gene site”

3 討論

本研究篩選出的氨基酸突變數(shù)比體細胞突變數(shù)多，這種現(xiàn)象與RNA的可變剪切(alternative splicing)有關，同一個基因的剪接位點及拼接位點可以不一致，這就導致了同一個基因能夠編碼多個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并表達出多個不同生理功能的相關蛋白。RNA可變剪切可以增加真核生物基因表達的復雜程度和蛋白質(zhì)的功能多樣性。因此，同一個基因突變位點在不同轉(zhuǎn)錄水平上翻譯得到的在氨基酸序列上的氨基酸突變位點可能不一致。

特異性膜蛋白胞外突變的“特異性”源于氨基酸突變后其性質(zhì)發(fā)生了變化。氨基酸的性質(zhì)主要包括酸堿性、親水性和疏水性。氨基酸性質(zhì)的變化可能會引起氨基酸帶電荷情況的變化，從而引起相應膜蛋白的分子間作用力的變化。另外，氨基酸性質(zhì)的變化也可能引起氫鍵及疏水作用力等的變化，進而影響相應膜蛋白與抗體之間的結(jié)合能力。所以，如果膜蛋白胞外氨基酸突變后性質(zhì)發(fā)生了變化，則其與抗體的結(jié)合能力就可能區(qū)別于正常膜蛋白，從而形成特異性抗原作為藥物作用靶點[20]。

傳統(tǒng)的癌癥治療方法如手術、放療、化療缺乏腫瘤殺傷特異性，存在較大副作用。2015年初，美國總統(tǒng)奧巴馬提出精準醫(yī)療計劃，其中癌癥精準醫(yī)療是最為重要的短期目標。精準醫(yī)療也逐漸成為癌癥研究熱點，癌癥免疫治療和靶向治療可以通過腫瘤特異性抗原選擇性地對腫瘤細胞造成特異性殺傷，從而降低副作用。因此，尋找腫瘤細胞區(qū)別于正常細胞的特異性抗原成為癌癥精準醫(yī)療的關鍵。本研究進行的腫瘤細胞膜蛋白體細胞突變分析是對樣本的所有體細胞突變進行分析，從中篩選出所有可能形成腫瘤特異性抗原的特異性膜蛋白胞外突變，即造成膜表面蛋白的氨基酸突變并使其性質(zhì)發(fā)生變化的全部突變，構(gòu)建了一個全面尋找腫瘤特異性膜表面潛在靶點的方法，建立了一個特異性膜蛋白胞外突變的信息庫，并發(fā)現(xiàn)MUC16、LRP1B、CSMD3、RYR2、USH2A這5個基因及17號染色體的37868208位點(ERBB2基因位點)在腫瘤樣本中發(fā)生特異性膜蛋白胞外突變的頻率較高，為尋找癌癥精準醫(yī)療，尤其是靶向治療及免疫治療的藥物作用靶點提供信息參考。然而并不是所有特異性膜蛋白胞外突變都能形成藥物作用靶點，這些突變有待后續(xù)抗原表位分析及實驗驗證。同時，本研究發(fā)現(xiàn)每個膜蛋白胞外突變位點在所有腫瘤樣本中出現(xiàn)的頻率較低(最高僅為12/7042)，體現(xiàn)了腫瘤細胞極強的異質(zhì)性，因而癌癥精準醫(yī)療必將是個性化的。

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(編校：吳茜)

Analysis of somatic mutations in membrane proteins of tumor cells

WU Shan-shan, ZHOU ZhanΔ, CHEN Shu-qingΔ

(Zhejiang Province Key Laboratory of Anti-Cancer Drug Research, College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

ObjectiveTo screen specific mutations on extracellular regions of membrane proteins (extracellular membrane protein mutations) in tumor cells and provide the reference information for target searching in cancer precision medicine.MethodsSomatic mutations on extracellular regions of membrane proteins of 7042 tumor samples were collected to screen all specific extracellular membrane protein mutations, and the overall distribution of these mutations were obtained by statistical analysis. Genes, gene site and cancer types occured high frequency of extracellular membrane protein mutations were identified.Results97193 specific extracellular membrane protein mutations were obtained from 4938362 somatic mutations in 7042 tumor samples (30 cancer types), the statistical analysis showed that 4347 genes and 65532 sites were involved in these specific mutations. The study further analyzed five genes (MUC16、LRP1B、CSMD3、RYR2、USH2A), one site (17:37868208) and six cancer types (including colorectal cancer, melanoma, uterine cancer, brain lower grade glioma, lung adenocarcinoma and stomach adenocarcinoma) which occured high frequency of extracellular membrane protein mutations.ConclusionAn information library of specific mutations on extracellular regions of membrane proteins was established and the distribution of these specific mutations was obtained which can provide reference information for target detection in targeted cancer therapy and immunological therapy.

cancer precision medicine; biological target; somatic mutations; specific extracellular membrane protein mutations

國家自然科學基金重點項目(81430081)；浙江省自然科學基金面上項目(LY15C06001)

吳姍姍，女，碩士在讀，研究方向：微生物與生化藥學，E-mail：swodylm@zju.edu.cn；陳樞青，通信作者，男，博士，教授、博士生導師，研究方向：生化藥學，E-mail：chenshuqing@zju.edu.cn；周展，共同通信作者，男，博士，講師、碩士生導師，研究方向：癌癥基因組學，E-mail：zhouzhan@zju.edu.cn。

R730.1

A

1005-1678(2015)11-0001-05