馮麗君，張穎超

(天津醫(yī)科大學(xué) 寶坻臨床學(xué)院 呼吸科，天津 301800)

?

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對博來霉素誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化模型影響的研究

馮麗君Δ，張穎超

(天津醫(yī)科大學(xué) 寶坻臨床學(xué)院 呼吸科，天津 301800)

目的 探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells，UC-MSC)對博來霉素誘導(dǎo)的實驗性小鼠肺纖維化中羥基脯氨酸(hydroxyprine，HYP)、活性氧(superoxyde dismutase，SOD)及丙二醛(malonaldehyde，MDA)的含量的影響。方法 采用小鼠氣管內(nèi)注人博來霉素誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化，取第四代UC-MSC細(xì)胞通過尾靜脈注射干預(yù)，給藥21 d后，處死小鼠獲取肺組織，對其進(jìn)行病理學(xué)切片觀察以及檢測組織中HYP、SOD及MDA的含量來評價UC-MSC對小鼠肺纖維化的影響。結(jié)果 病理學(xué)染色結(jié)果表明，治療組(給予博來霉素+UC-MSC)較模型組(僅給予博來霉素)相比，治療組不僅可降低炎癥細(xì)胞的浸潤以及膠原沉積等病理特征，還可降低由博來霉素誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化模型中HYP(P<0.01)和MDA(P<0.05)的含量以及增高SOD的含量(P<0.01)。結(jié)論 UC-MSC可對由博來霉素誘導(dǎo)的實驗性小鼠肺纖維化具有一定的保護(hù)作用。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；博來霉素；肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)一類以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病[1]。目前臨床上尚無確切的治療手段并且其發(fā)病機(jī)制尚不清晰，因此，尋找治療IPF的治療措施成為研究熱點。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一種存在于多種組織中的具有具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的干細(xì)胞[2]。MSC也是一種理想的種子細(xì)胞現(xiàn)已在諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用諸如組織工程等，其中MSC也可在用于治療與修復(fù)肺纖維化等相關(guān)疾病[3]。人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells，UC-MSC)是MSC一條重要的來源渠道，可作為細(xì)胞治療中一種非常有希望的干細(xì)胞替代來源[4]。本研究擬通過博來霉素誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化模型并給予UC-MSC干預(yù)后，通過檢測肺組織羥基脯氨酸(hydroxyprine，HPY)、活性氧(superoxyde dismutase，SOD)及丙二醛(malonaldehyde，MDA)的含量、組織病理學(xué)觀察來評價UC-MSC對肺纖維化的影響，為開發(fā)治療IPF新措施提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 新鮮臍帶由天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院提供(4 ℃保存?zhèn)溆?，本試驗?zāi)殠У墨@取以及動物實驗[昆明種雌性小鼠150只，體質(zhì)量(23±3)g，許可證號：TJBDRMH201510]的處置措施經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)遵循《實驗動物保護(hù)條例》。博來霉素購自天津太河制藥有限公司；羥基脯氨酸(HYP)、活性氧(SOD)及丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal calf serum, FBS)；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；無菌操作臺購自蘇州凈化有限公司，CO2培養(yǎng)箱購自長沙長錦科技公司。其余國產(chǎn)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 UC-MSC的培養(yǎng)與傳代：參照文獻(xiàn)[4]，將取得的臍帶經(jīng)處理后，用眼科剪剪碎成粘稠狀，取適量放人25 cm3的培養(yǎng)瓶中，覆蓋70%～80%培養(yǎng)瓶的底面積即可。然后加入完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清的DMEM)，吹打混勻。放人無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)基變成微黃時更換新鮮培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)一周可見具有梭形狀的細(xì)胞圍繞組織塊邊緣生長；待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶一半時丟棄掉組織塊。每3天更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長慢瓶底時可進(jìn)行傳代，按1︰2～1︰3的比例進(jìn)行傳代，傳至第4代時收集細(xì)胞，并制成密度為5×106/mL細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 實驗分組與處置：參照文獻(xiàn)[5]，將實驗動物隨機(jī)分為4組每組30只(對照組、UC-MSC組、博來霉素組和博來霉素+UC-MSC組)。第1天，所有小鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對小鼠進(jìn)行麻醉后，碘伏消毒，在無菌條件下，于頸部正中縱向剪開皮膚，逐層分離肌肉，暴露氣管。按體重2.5 mg/kg向博來霉素組及博來霉素+UC-MSC組小鼠氣管內(nèi)一次性注人博來霉素，向?qū)φ战M和UC-MSC組小鼠氣管內(nèi)注入相同體積的PBS，最后縫合皮膚，碘伏消毒，注射抗生素，正常飼養(yǎng)，每天記錄小鼠的生長狀況。術(shù)后3 d向?qū)φ战M和博來霉素組通過尾靜脈注入0.9%NaCl，UC-MSC組及博來霉素+UC-MSC組通過尾靜脈注射UC-MSC 0.2 mL(含細(xì)胞數(shù)1×106個)。治療結(jié)束(第21 d)后麻醉小鼠，12只小鼠取肺組織先經(jīng)10% 福安馬林中保存后制備、脫水、制備石蠟切片進(jìn)行HE染色和Masson 染色。18只小鼠處死后對肺組織中HYP、SOD及MDA的含量進(jìn)行檢測。

1.2.3 UC-MSC形態(tài)學(xué)觀察：參照文獻(xiàn)[4]，將UC-MSC傳代至第4代，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底部時，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗3遍后更換新鮮的完全培養(yǎng)基。蓋緊瓶蓋，倒置顯微鏡下拍照觀察第4代UC-MSC形態(tài)。

1.2.4 小鼠肺組織的病理學(xué)變化：參照文獻(xiàn)[5]，制備石蠟切片進(jìn)行HE染色。肺組織經(jīng)10% 福安馬林固定后，蒸餾水沖洗，經(jīng)脫水(30%、50%、70%、80%、95%、100%乙醇)，二甲苯透明，透臘后進(jìn)行石蠟包埋，待石蠟完全凝固后取出蠟塊，在切片機(jī)上進(jìn)行切片(厚度5 μm),烘片后經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化(100%、95%、85%、75%乙醇)，蘇木素染色，酒精分化，伊紅染色，中性樹膠封片。 Masson 染色具體過程如下：石蠟切片按上述脫蠟至水，鉻化處理或去汞鹽沉淀，依次自來水和蒸餾水洗，蘇木素液染核5～10 min。充分水洗,后用Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)染5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻最后95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.2.5 肺組織HPY、SOD及MDA含量檢測：參照文獻(xiàn)[5]，用組織堿水解法及分光光度法測定各個樣本中HYP的含量，SOD及MDA含量檢測按照試劑盒操作步驟檢測。

2 結(jié)果

2.1 UC-MSC形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下，第4代UC-MSC形態(tài)均一，呈梭形的細(xì)胞，傳代6～7 d左右細(xì)胞長滿瓶底，鋪滿瓶底，可見“鋪路石”樣，細(xì)胞質(zhì)回縮，分裂相少見。見圖1。

2.2 小鼠肺組織的病理學(xué)變化 HE結(jié)果表明，對照組(見圖2A)與UC-MSC組(見圖2B)小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)未見膠原沉積。博來霉素組小鼠在滴注博來霉素后表現(xiàn)為明顯的急性炎癥反應(yīng)，肺泡壁水腫，肺間質(zhì)內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(見圖2C)，但是在博來霉素+UC-MSC組的小鼠肺臟炎癥細(xì)胞浸潤較博來霉素組減少(見圖2D)。Masson 染色顯示，對照組(見圖3A)與UC-MSC組(見圖3B)小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常未見膠原蛋白沉積；博來霉素組小鼠在滴注博來霉素后可見肺泡間隔不同程度的，甚至出現(xiàn)肺實質(zhì)大片融合性病變，病變區(qū)域及輕度病變區(qū)域與正常肺組織的混雜分布(見圖3C)，但是在博來霉素+UC-MSC組的嚴(yán)重程度(見圖3D)較博來霉素組相比嚴(yán)重程度有所緩解。上述結(jié)果表明UC-MSC可保護(hù)博來霉素誘導(dǎo)的誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化。

圖2 各組小鼠肺組織 HE 染色 (×200) Fig.2 Histologic evaluation of different groups mouse lung tissues(×200)

圖3 各組小鼠肺組織 Masson 染色(×200)Fig.3 Massontrichrome staining of different groups mouse lung tissues(×200)

2.3 肺組織HYP、SOD和MDA含量 肺組織HYP、SOD和MDA含量檢測結(jié)果見表1。對照組和UC-MSC組的HYP、SOD和MDA的含量相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明單純注射UC-MSC不會對小鼠體內(nèi)HYP、SOD和MDA含量產(chǎn)生影響。

HYP含量檢測中，博來霉素組中的含量明顯高于對照組(P<0.01)，而給予UC-MSC治療的博來霉素+UC-MSC組中其HYP的含量與博來霉素組相比顯著降低(P<0.01)，結(jié)果表明UC-MSC可降低由博來霉素引發(fā)的HYP含量增高。

SOD含量檢測中，博來霉素組中的含量明顯低于對照組(P<0.01)，而給予UC-MSC治療的博來霉素+UC-MSC組中其SOD的含量與博來霉素組相比顯著提高(P<0.01)，結(jié)果表明UC-MSC可提高由博來霉素引發(fā)的SOD含量降低。

MDA含量檢測中，同樣，博來霉素組中的含量明顯高于對照組(P<0.01)，而給予UC-MSC治療的博來霉素+UC-MSC組中其MDA的含量與博來霉素組相比較低(P<0.05)，結(jié)果表明UC-MSC可降低由博來霉素引發(fā)的MDA含量增高。

綜上所述，UC-MSC可降低由博來霉素誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化模型中HYP和MDA的含量以及增高SOD的含量。UC-MSC對博來霉素誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化具有一定的保護(hù)作用。

表1 各組小鼠肺組織HYP、SOD和MDA含量比較Tab.1 The content of HYP,SOD and MDA in different groups(±s，n=18)

*P<0.05，**P<0.01，與對照相比，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與博來霉素組相比，compared with bleomycin group group

3 討論

目前，成體骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種理想的種子細(xì)胞在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用[6]。但研究表明[7]，成入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在來源限制、細(xì)胞的活力受限于成人的年齡等諸多問題，因此尋找一種新的更具優(yōu)勢的替代細(xì)胞具有重要意義。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為間充質(zhì)干細(xì)胞一重要來源具有以下優(yōu)點：首先，利用胎兒分娩后的廢棄物來源易得；其次，其增殖能力較強(qiáng)，可不短傳代培養(yǎng)，細(xì)胞長量較大；再次，連續(xù)多次傳代后仍然維持干細(xì)胞特性[8]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為成體骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的替代來源，具有很好的應(yīng)用市場。故本研究以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對象，探討其對小鼠肺纖維化的影響。

肺纖維化具體發(fā)病機(jī)制尚不清晰。研究表明[9]，博來霉素致肺纖維化是通過介導(dǎo)自由基損傷等機(jī)制，其中活性氧是肺纖維化進(jìn)程中的重要因子，當(dāng)氧化與抗氧化系統(tǒng)紊亂時，組織便會發(fā)生損傷。因此，阻斷過氧化反應(yīng)，不僅可以促進(jìn)肺損傷的修復(fù)，而且也可防止肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展[10]。SOD是體內(nèi)重要的清除氧自由基的酶，肺組織中SOD含量可以間接反映肺清除氧自由基的能力[5,11,12]；本研究對肺組織SOD的含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，博來霉素組中的含量為(85.32±6.89)U/mg明顯低于對照組(170.36±4.68)U/mg(P<0.01)，而給予UC-MSC治療的博來霉素+UC-MSC組中SOD的含量為(124.57±9.68)U/mg與博來霉素組相比顯著提高(P<0.01)。MDA是肺組織內(nèi)一種脂質(zhì)過氧化物，是氧自由基產(chǎn)生連鎖反應(yīng)的一種重要成分，從而增強(qiáng)活性氧對肺組織的損傷，故對其含量進(jìn)行檢測可了解組織受氧自由基損傷的狀況[13]。本研究對各組MDA的含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示博來霉素組中的含量為(8.91±2.14)nmol/mg明顯高于對照組的(6.74±1.23)nmol/mg(P<0.01)，而給予UC-MSC治療的博來霉素+UC-MSC組中其MDA的含量為(7.14±1.67)nmol/mg與博來霉素組相比較低(P<0.05)。HYP是肺組織膠原蛋白的重要成分，約占膠原蛋白氨基酸總量的13%，對HYP含量進(jìn)行可評估肺纖維化的嚴(yán)重程度[14]。本研究對 HYP的含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示博來霉素組中的含量為(697.15±65.36)μg/mg明顯高于對照組(310.54±32.23)μg/mg(P<0.01)，而給予UC-MSC治療的博來霉素+UC-MSC組中其HYP的含量為(561.34±45.12)μg/mg與博來霉素組相比顯著降低(P<0.01)。

本研究通過體外培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，采用第四代細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射干預(yù)由博來霉素誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化模型，通過HE、Masson染色以及檢測肺組織中，HPY、SOD和MDA的含量來評價UC-MSC對肺纖維化的影響。結(jié)果初步顯示UC-MSC可減輕炎癥細(xì)胞浸潤以及肺間質(zhì)膠原沉積，降低由博來霉素誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化模型中HYP(P<0.01)和MDA(P<0.05)的含量以及增高SOD的含量(P<0.01)。 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可保護(hù)博來霉素誘導(dǎo)的誘導(dǎo)實驗性小鼠肺纖維化。

[1] American Thoracic Society. Idiopathic pulmonary fibrosis:diagnosis and treatment. International consensus statement.American Thoracic Society(ATS), and the European Respiratory Society(ERS). Am J Respir Crit Care Med. 2000;161(2 Pt 1):646-664.

[2 ] Parekkadan B, van Poll D, Suganuma K, et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure[J]. PLoS One, 2007,2(1): 941.

[3] 黃坤，吳曉梅，王欣燕，等．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠肺纖維化的影響[J]．中華結(jié)核和呼吸雜志，2012(35)：659-664.

[4] Lu LL, Liu YJ, Yang SG,et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials[J]. Haematologica, 2006, 91(2): l0l7-1026.

[5] 鄭金旭，盧坤琴，夏德剛，等. 柴胡皂甙d對博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的治療作用及機(jī)制研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90(12)：808-812.

[6] 吳軍，張燕燕. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007(50)：10134-10137.

[7] 王丁. CD14單核細(xì)胞增強(qiáng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2010.

[8] 戎麗娟. IFN-γ對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2012.

[9] 莊誼，張德平. 肺纖維化與Th1/Th2失衡[J]. 國際呼吸雜志，2005(5)：349-351.

[10] 李婷. Ang(1-7)和AngⅡ通過氧化應(yīng)激對肺成纖維細(xì)胞遷移和肺纖維化的影響及其機(jī)制[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2014.

[11] 胡凡艷. 七氟醚預(yù)處理對肺葉切除術(shù)患者單肺通氣誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的影響[D]. 濟(jì)南：山東大學(xué)，2012.

[12] 梁永祺. 黃芪多糖對EAhy.926細(xì)胞的抗氧化及抗炎作用[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

[13] 遲梅英，潘曉軍，趙勇，等. 異丙酚對高氧肺損傷大鼠氧自由基、IL[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2007.

[14] 魏艷靜，武惠珍，韋再華，等. 肝硬化腹水中羥脯氨酸含量的觀察[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，(2)：109.

(編校：譚玲)

Study on effect of UC-MSC in IPF experimental model induced by bleomycin in mice

FENG Li-junΔ, ZHANG Ying-chao

(Department of Respiration, Baodi College of Clinical Medicine, Tianjin Medical University, Tianjin 301800, China)

ObjectiveTo investigate protective of umbilical cord-mesenchymal stem cells(UC-MSC) on idiopathic pulmonary fibrosis(IPF) experimental mode was induced by bleomycin in mice.MethodsIPF experimental mode induced by bleomycin with intratracheal injection, and then the fourth generation UC-MSC was injected in caudal vein. The lung tissues were obtained to evaluate the influence of UC-MSC on IPF by the observation of histological evaluation(HE) and Masson staining, the detection content of hydroxyprine(HYP), superoxyde dismutase(SOD) and malonaldehyde(MDA).ResultsThe HE and Masson staining showed that bleomycin+UC-MSC group could alleviate inflammatory cell infiltration and pulmonary interstitial collagen deposition. bleomycin+UC-MSC group could decline the content of HYP(P<0.01), MDA(P<0.05) and improve the content of SOD(P<0.01)compared with bleomycin group.ConclusionUC-MSC exhibits an protective effect on IPF experimental mode induced by bleomycin in mice.

umbilical cord-derivedumbilical cord-derived cell; bleomycin; idiopathic pulmonary fibrosis

馮麗君，通信作者，女，大專，主任醫(yī)師，研究方向：慢性阻塞性肺疾病，支氣管哮喘間質(zhì)性肺疾病等，E-mail：tianjinfenglijun@sina.com。

R285.5

A

1005-1678(2015)11-0019-04