劉定華，姚允泰，李立環(huán)，黃春梅

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院 檢驗科，重慶 401331；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心阜外心血管病醫(yī)院 麻醉科，北京 100037；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 檢驗科，北京 100730)

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烏司他丁對懸浮紅細(xì)胞儲存期凋亡損傷的影響研究

劉定華1，姚允泰2Δ，李立環(huán)2，黃春梅3

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院 檢驗科，重慶 401331；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心阜外心血管病醫(yī)院 麻醉科，北京 100037；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 檢驗科，北京 100730)

目的 研究烏司他丁對儲存期懸浮紅細(xì)胞凋亡損傷的影響。方法 采集16名健康自愿者血液并按血庫常規(guī)處理得懸浮紅細(xì)胞，同一來源的4份懸浮紅細(xì)胞中分別添加等量生理鹽水(對照組)及5,000、10,000、50,000 U/mL的烏司他丁溶液(試驗組C1、C2、C3)，在儲存0、7、14、21、28及35 d取樣檢測。使用流式細(xì)胞儀檢測紅細(xì)胞體積、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻率及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)果 各組紅細(xì)胞PS外翻率均自14 d開始升高(P<0.05)。對照組及C1、C2組紅細(xì)胞自21d開始明顯縮小，而C3組紅細(xì)胞體積直到28 d才明顯縮小，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組和C1組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度自35 d開始顯著增高(t=16.33,t=14.66,P<0.05)，而試驗組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均自14 d開始增高；而自21～35 d，C2及C3組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 在儲存期內(nèi)，懸浮紅細(xì)胞發(fā)生凋亡損傷并隨著時間延長而加劇，在儲存液里添加適量烏司他丁可在一定程度上抑制凋亡損傷。

烏司他??；懸浮紅細(xì)胞；凋亡；儲存

紅細(xì)胞儲存損傷是紅細(xì)胞在儲存期間受多種因素的影響而在形態(tài)、功能及生化特性等方面發(fā)生的有害變化，其會減低紅細(xì)胞在受血者體內(nèi)的存活率及運輸和釋放氧的能力、還可促進潛在的有害中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響血液的質(zhì)量及輸注療效，給臨床輸血帶來安全隱患[1-2]。既往研究表明凋亡不僅見于有核細(xì)胞，還可見于成熟紅細(xì)胞[3]；紅細(xì)胞在儲存期間發(fā)生凋亡，也可能是紅細(xì)胞儲存損傷的原因之一[4-6]。

烏司他丁是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的糖蛋白，具有廣譜蛋白酶抑制活性[7]，還可抑制溶酶體酶釋放，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放。既往國外文獻[8-11]報道，烏司他丁不僅對急性胰腺炎、休克等臨床重癥具有明確療效，還可抑制懸浮紅細(xì)胞在儲存過程中發(fā)生溶血。然而，烏司他丁對紅細(xì)胞凋亡損傷有無抑制或改善作用尚待研究。

本研究在懸浮紅細(xì)胞儲存液中添加適當(dāng)濃度的烏司他丁，分析隨儲存時間延長紅細(xì)胞凋亡損傷的發(fā)生情況，以探討烏司他丁在臨床輸血安全方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)；FITC -Annexin-V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國Becton-Dickinson公司)；Epics XL型流式細(xì)胞儀及配套熒光校準(zhǔn)微球(美國Beckman-Coulter Immunotech公司)；Fluo-3/AM鈣離子熒光試劑、配制Fluo-3/AM工作液的二甲基亞砜(美國Sigma 公司)。

1.2 研究對象 征集16名健康自愿者，男9名，女7名，年齡23～42歲，采集每名自愿者血液200 mL，按照我國血站技術(shù)操作規(guī)程[12]采集、分離、處理血液得懸浮紅細(xì)胞，同一來源紅細(xì)胞分為4份(對照組及試驗組)，相應(yīng)保存液中分別加入2.5 mL生理鹽水及不同濃度烏司他丁生理鹽水溶液，烏司他丁終濃度分別為5000 U/mL, 10000 U/mL及50000 U/mL(試驗組C1、C2及C3)。所有懸浮紅細(xì)胞均豎直儲存于2 ℃～6 ℃，在儲存期內(nèi)于0、7、14、21、28及35 d等6個時點取樣檢測。以上均為無菌操作。本研究試驗方案經(jīng)阜外心血管病醫(yī)院倫理委員會審查同意，按照赫爾辛基宣言和阜外心血管病醫(yī)院人體研究指導(dǎo)原則，自愿者在采集血液前均簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 紅細(xì)胞PS外翻率及細(xì)胞大?。簯腋〖t細(xì)胞使用冷PBS洗滌2次后重懸于100 μL Annexin-V結(jié)合液，使細(xì)胞數(shù)為106個/mL。細(xì)胞懸液中加入5 μL FITC-Annexin-V，輕輕混勻后于室溫避光放置15 min，最后加入400 μL Annexin-V結(jié)合液重懸后立即上機檢測。流式細(xì)胞儀使用熒光微球校準(zhǔn)光路，使其CV不超過2%，細(xì)胞懸液上機檢測10,000個紅細(xì)胞的前向散射光(forward scatter，F(xiàn)SC)及FL-1熒光信號(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)，每管細(xì)胞懸液檢測2次，取平均值，F(xiàn)SC代表紅細(xì)胞體積，F(xiàn)L-1熒光信號代表PS外翻率。

1.3.2 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度：紅細(xì)胞使用生理鹽水洗滌2次后重懸于1 mL Ringer液，細(xì)胞濃度為106個/mL。細(xì)胞懸液中加入3 μL Fluo-3/AM工作液，充分混勻后于37 ℃避光放置15 min，再加入2 μL Fluo-3/AM 工作液，充分混勻后于37 ℃避光放置25 min，最后1,000 g、22 ℃離心5 min后，使用Ringer液洗滌2次并加入1 mL Ringer液重懸后立即上機檢測。流式細(xì)胞儀使用熒光微球校準(zhǔn)光路，使其CV不超過2%，細(xì)胞懸液上機檢測10,000個紅細(xì)胞的FL-1熒光信號，每管細(xì)胞懸液檢測2次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 懸浮紅細(xì)胞PS外翻率 儲存期各時點所取懸浮紅細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞檢測，PS外翻率隨儲存時間延長而增高，對照組PS外翻率由(0.11±0.01)%增高至(5.83±0.47)%。與0 d相比，對照組與各試驗組均自14 d開始PS外翻率增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組與C1、C2和C3組各時點PS外翻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 儲存期各時點紅細(xì)胞PS外翻率(%,n=2)Tab.1 Analysis of storage-associated red blood cell PS exposure(%,n=2)

*P<0.05，同組內(nèi)與時點0 d比較，compared with intra-group at day 0

2.2 懸浮紅細(xì)胞體積 流式細(xì)胞術(shù)以FSC反映細(xì)胞體積大小。對照組懸浮紅細(xì)胞FSC檢測值自(539±22.5)降至(454.8±15.7)，表明懸浮紅細(xì)胞在儲存期內(nèi)體積逐漸縮小，但35 d與0 d相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；C1、C2、C3組內(nèi)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組與各試驗組在儲存期同一時點取樣體積大小，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 儲存期各時點紅細(xì)胞體積大小(n=2)Tab.2 Analysis of storage-associated red blood cell volume(n=2)

2.3 懸浮紅細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度 Fluo-3/AM熒光陽性率與細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度成正比，流式細(xì)胞檢測結(jié)果，見表3。表3表明對照組懸浮紅細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度呈時間相關(guān)性增高(5.8±1.1)%增至(38.4±2.6)%，(t=16.33，P<0.05)。C1組懸浮紅細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度自35 d開始顯著增高(t=14.66,P<0.05)。對照組與各試驗組間的Ca2+濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 儲存期各時點紅細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+ 濃度(%,n=2)Tab.3 Analysis of storage-associated red blood cell intracellular Ca2+ concentration(%,n=2)

*P<0.05，同組內(nèi)與時點0d比較，compared with day 0 (intra-group comparison)

3 討論

懸浮紅細(xì)胞是應(yīng)用最為廣泛的成分血液制品，用于補充血容量、改善器官組織缺氧、維持機體生命體征平穩(wěn)。懸浮紅細(xì)胞采集制備后常規(guī)儲存期為35～42 d，隨著儲存時間的延長，紅細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)、生化特性及功能的有害改變，即紅細(xì)胞儲存損傷[3,13]。紅細(xì)胞儲存損傷可降低紅細(xì)胞在受血者體內(nèi)的存活率，可導(dǎo)致受血者急性肺損傷、多器官衰竭甚至死亡[1-2,13]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動的程序性死亡過程，長久以來凋亡被認(rèn)為只發(fā)生于有核細(xì)胞，直到國外學(xué)者[3]提出與有核細(xì)胞有所區(qū)別的紅細(xì)胞凋亡概念，其特征性改變?yōu)榧?xì)胞皺縮、體積縮小及PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)至外側(cè)(即細(xì)胞膜表達PS)。紅細(xì)胞凋亡可能是懸浮紅細(xì)胞儲存損傷的重要機制，但國內(nèi)外對其的研究有限。

由于發(fā)生凋亡的紅細(xì)胞膜PS外翻并且細(xì)胞體積縮小，因此檢測紅細(xì)胞膜PS外翻率及細(xì)胞FSC可反映紅細(xì)胞凋亡率[14]。本研究利用FITC-Annexin-V熒光染色、使用流式細(xì)胞儀檢測了不同儲存時間懸浮紅細(xì)胞體積及細(xì)胞膜PS外翻率，結(jié)果表明懸浮紅細(xì)胞在儲存期間發(fā)生凋亡性改變，細(xì)胞體積FSC由539.2±22.5降低至454.8±15.7，PS外翻率由(0.11±0.01)%增高至(5.83±0.47)%，儲存早期凋亡不明顯，儲存中后期發(fā)生明顯凋亡改變。此外，本研究檢測了懸浮紅細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度，結(jié)果表明隨著儲存時間延長，懸浮紅細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度逐漸增高，由(5.8±1.1)%增高至(38.4±2.6)%，儲存早期細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高不明顯，對照組和C1組的Ca2+濃度后期增高差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其變化與懸浮紅細(xì)胞儲存期凋亡率增高表現(xiàn)出相似趨勢。研究結(jié)果提示可能隨著儲存時間延長，紅細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低等因素導(dǎo)致紅細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，進而刺激Ca2+敏感的K+通道，紅細(xì)胞丟失K+后皺縮，而且紅細(xì)胞內(nèi)增多的Ca2+可刺激表達于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PS外翻至膜表面，致使紅細(xì)胞膜磷脂成分不對稱、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，終致紅細(xì)胞進入凋亡程序[14-15]。由于PS外翻是細(xì)胞凋亡標(biāo)志物，因此檢測PS外翻率并結(jié)合FSC可對懸浮紅細(xì)胞儲存損傷進行有效評估[16]。

凋亡不僅可導(dǎo)致懸浮紅細(xì)胞儲存損傷，影響其結(jié)構(gòu)及正常功能，而且輸注紅細(xì)胞由于外翻的PS被巨噬細(xì)胞表面PS受體識別而被吞噬清除，也降低了輸注后紅細(xì)胞存活率，因此本研究設(shè)想如果對懸浮紅細(xì)胞凋亡進行干預(yù)，可能對紅細(xì)胞儲存損傷有所改善。烏司他丁是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，還可抑制溶酶體酶釋放，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放，可抑制多種炎癥前介質(zhì)及細(xì)胞因子[7,17-18]。因其安全性及療效，烏司他丁臨床應(yīng)用廣泛，如改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術(shù)刺激引起的對內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷以及改善休克時的循環(huán)狀態(tài)等[8-10]。此外，國外文獻[11]報道在紅細(xì)胞儲存液中添加烏司他丁可抑制紅細(xì)胞溶解。本研究在懸浮紅細(xì)胞常規(guī)儲存液中添加了不同濃度烏司他丁溶液，在不同儲存時點取樣檢測紅細(xì)胞膜PS外翻率、細(xì)胞大小及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，結(jié)果表明儲存中后期，對照組與C1，C2和C3組PS外翻率顯著升高(P<0.05)，而細(xì)胞體積在末期才明顯縮小，各試驗組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度改變均晚于對照組，對照組與C1組均自35 d開始，組內(nèi)Ca2+濃度顯著增高(t=16.33,t=14.66,P<0.05)。因此，在懸浮紅細(xì)胞儲存液中添加烏司他丁溶液可在一定程度上抑制紅細(xì)胞凋亡、減少儲存損傷，而烏司他丁添加量可能以終濃度50000 U/mL為宜。此外，烏司他丁是提取自人體尿液的糖蛋白，隨懸浮紅細(xì)胞輸注入人體內(nèi)應(yīng)無毒害。

綜上所述，懸浮紅細(xì)胞體外儲存期間發(fā)生凋亡損傷，其凋亡改變程度隨儲存時間延長而加劇，在懸浮紅細(xì)胞常規(guī)儲存液中添加適量的烏司他丁可在一定程度上抑制紅細(xì)胞凋亡。本課題組將征集更多自愿者進一步研究紅細(xì)胞凋亡機制及其與儲存損傷的關(guān)系、烏司他丁最適宜的添加量及其效用機制，并開展動物體內(nèi)實驗進行驗證。

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(編校：王冬梅)

Effects of ulinastatin on storage-associated eryptosis of suspended erythrocytes

LIU Ding-hua1, YAO Yun-tai2Δ, LI Li-huan2, HUANG Chun-mei3

(1.Department of Clinical Laboratory, University-Town Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401331, China; 2.Department of Anesthesiology, State Key Laboratory of Cardiovascular Diseases, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100037, China; 3.Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730, China)

ObjectiveTo investigate influence of ulinastation in storage period on apoptosis of suspended erythrocyte.MethodsRBCs were treated with saline (control group) and different doses of ulinastatin (5,000, 10,000 and 50,000 U/mL in group C1, C2 and C3, respectively).samples were detected when stored at 0,7,14,21,28,35 d,respectively. Indicators of corpuscular volume,phosphatidylserine extroversion rate and intracellular Ca2+concentration were analyzed by flow cytometer.ResultsThe phosphatidylserine (PS)-exposure levels of 4 groups started to increase on 14 day(P<0.05). Cells of the control group, group C1 and C2 began to shrink remarkably on day 21, while that of Group C3 on 28 day. The intracellular Ca2+levels of the control group and group C1 started to increase significantly on day 35, (t=16.33,t=14.66,P<0.05).one Ca2+levels of group C1,C2 and C3 increased on day 14. From 21 to 35 day, the intracellular Ca2+levels of group C2 and C3 were no significant compared with control group.ConclusionDuring the storage period, suspended erythrocyteapoptosis increase with time prolonged, adding suitable amount of ulinastatin in stock solution can inhibit apoptosis in damage at some level.

ulinastatin; suspended erythrocyte; apoptosis; storage

國家自然科學(xué)基金(81200109)；高校博士點教師基金(20121106120008)；天普研究基金(01201012)

劉定華，女，碩士，助理研究員，研究方向：臨床檢驗及應(yīng)用，E-mail：dinghua_liu@126.com；姚允泰，通訊作者，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：血液保護、器官保護及臨床麻醉，E-mail：yuntaiyao@126.com。

R333.1

A

1005-1678(2015)05-0021-04